一種微生物樣品DNA保存液的製作方法

2023-08-13 03:38:36

本發明涉及一種生物樣本保存液，尤其涉及一種微生物樣品dna保存液。
背景技術：
：聚合酶鏈反應(pcr)是一種體外核酸擴增技術，在分子生物學和醫學領域得到廣泛應用。pcr檢測技術的第一步是模板dna的製備，即樣本中dna的提取，直接影響pcr反應的結果。隨著pcr技術的發展，已經有許多提取基因組dna的方法。但是要從現場的環境標本如土壤、灰塵和汙水中，或是人體組織樣本如糞便中，快速檢測致病微生物，由於模板量少，再加上微生物脫離原有生存環境，往往導致原有微生物的豐度發生變化、dna受損，使實驗的敏感性大大降低，其中尤以腸道微生物的保存最為困難。糞便離體後，其環境也發生了變化，例如無氧環境轉變成有氧環境，其中提供微生物代謝的能量來源也進入只消耗而不補充的狀態。與此同時，其中的部分細菌還保持了活性，繼續代謝和生長，而由於環境的變化，不同細菌其增長與死亡的速率已經不同於排便前。因此，需要對糞便進行一些保存措施，儘量將其中微生物的構成穩定在剛剛離體時的狀態，從而最好的代表大腸中的共生微生物。糞便採集之後，通過提取細菌的總dna，擴增核糖體16srrna可變區，測序以及一系列生物信息學分析，可以了解糞便中的細菌構成，進一步研究其和人體健康疾病之間的關係。現有技術中對於糞便微生物的保存，多採用低溫冷凍的方法，例如中國專利公布號為cn102864138a的發明專利，公開了一種人類糞便dna提取方法，即採用低溫保存法，採集的糞便樣本立即放於-20℃～-80℃，然而低溫冷凍的方法需要大型設備配合使用，適用性較差，操作也較為複雜，不適於廣泛的臨床檢測；常見的dna保存液中，通常含有edta，雖然可以在常溫下使用，然而這種dna保存液並不適用於糞便微生物樣品的dna保存，具有使用局限性。技術實現要素：為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種適用於常溫下保存微生物樣品、操作簡單、適用性較好、可應用於大規模樣品檢測的微生物樣品dna保存液。本發明的微生物樣品dna保存液，其中在純水中溶解有0.5～2mm/l的edta、飽和氯化鈉(nacl)、質量分數為2～5％的甲醇、質量分數為5-15％的甘油、質量分數為5-10％的脂肪醇聚氧乙烯醚、質量分數為1-5％的十二烷基硫酸鈉(sds)以及混合的礦物油，並調節ph至6.0-9.0。進一步的，還包括質量分數為5-10％的二甲基亞碸(dmso)。具體的，所述二甲基亞碸(dmso)的質量分數為8％。進一步的，還包括質量分數為2-5％的乙醇。具體的，所述乙醇的質量分數為3％。具體的，所述微生物樣品dna保存液中溶解有1mm/l的edta。具體的，所述甲醇的質量分數為4％。具體的，所述甘油的質量分數為10％。具體的，所述脂肪醇聚氧乙烯醚的質量分數為8％。具體的，所述十二烷基硫酸鈉(sds)的質量分數為3％。具體的，所述保存液調節ph至8.0。應當說明的是，1)edta作為陽離子螯合劑，能使鈣變成螯合物，從而能高效率地防止生物體反應或者酶反應；2)甲醇作為抗氧化劑，能預防羥基的產生游離；3)甘油，不僅具有由羥基(oh基)引起的防止氧化的效果，同時還具有作為防凍液在-20℃～4℃下穩定地保存微生物樣品的作用，還有防止蛋白分解、抑制酶反應的效果；4)脂肪醇聚氧乙烯醚能加強表面活性，具有分散、滲透作用，進一步加入乙醇後，與其配合可增加其它成分在水中的分散能力，並減少甲醇等物質揮發逸出；5)乙醇和sds作為變性劑，可以將微生物樣品中的粘蛋白和球蛋白等有機物質進行變性處理，作為抑菌劑，可以防止微生物的豐度發生變化；6)二甲基亞碸是一種重要的滲透型細胞保護劑，dmso能夠快速穿透細胞膜進入細胞中，降低冰點、延緩凍存過程，同時提高細胞內離子濃度，減少細胞內冰晶的形成，從而減少細胞損傷，研究結果表明，培養液中dmso濃度為10％時，細胞生長抑制率近100％，1‰濃度時抑制率為35％，即使是0.04‰的濃度，dmso對細胞的生長也有不利的影響，可以避免微生物的豐度發生變化；7)礦物油又稱石蠟油，是從原油分餾所得到的無色無味的混合物，它可以分成輕質礦物油及一般礦物油兩種，而輕質礦物油的比重及黏稠度較低，其具有低致敏性及不錯的封閉性，將微生物樣品混入保存液後，礦物油浮於混合液上表面，可以有效阻隔空氣，降低微生物的新陳代謝，對於厭氧性微生物還可以有效避免改變其生存環境，同時可以避免揮發性物質逸出。藉由上述方案，本發明至少具有以下優點：按照以上配方配製保存液，將採集的微生物樣品，直接置於保存液中，無需凍存，即可達到穩定其中微生物構成的作用，也可適用於長途運輸。上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，並可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例並配合附圖詳細說明如後。附圖說明圖1是本發明志願者4種處理方式下的腸道菌群香農多樣性指數結果圖。具體實施方式下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例一樣品來源及分組保存方式由於糞便微生物樣品的生物保存要求較高，本發明一較佳實施例採用人糞便微生物樣品作為實驗樣品來進行如下實驗。s1、採集5位志願者的糞便樣本，每個志願者的樣品採集18份，分別做6種不同的處理，每種處理重複試驗3次；s2、不同處理方式a、凍存一周(標號0)：採集至少0.2g糞便樣品，液氮速凍後，-80℃下密封保存，保存一周後進行dna提取，16srrna基因v3/v4可變區擴增，文庫構建、測序等處理；b、保存液保存一周(標號1-3)：採集至少0.2g糞便樣品，使用本發明3種不同配方(成分如表1所示)室溫下(25℃)密封，避光保存一周，然後進行dna提取，16srrna基因v3/v4可變區擴增，文庫構建、測序等處理；c、保存液保存一周(標號4)：採集至少0.2g糞便樣品，使用現有技術中常見的保存液配方(成分如表2所示)室溫下(25℃)密封，避光保存一周，然後進行dna提取，16srrna基因v3/v4可變區擴增，文庫構建、測序等處理；d、不做任何處理保存一周(標號5)：採集至少0.2g糞便樣品，室溫下(25℃)密封，避光保存一周，然後進行dna提取，16srrna基因v3/v4可變區擴增，文庫構建、測序等處理。表1本發明微生物樣品dna保存液配方成分/標號123edta(mm/l)210.5nacl飽和飽和飽和甲醇(％)245甘油(％)51015脂肪醇聚氧乙烯醚(％)5810sds(％)135dmso(％)5810乙醇(％)235ph986表2現有技術保存液成分表乙二胺四乙酸二鈉(edta-2na)2％異硫酸氰酸胍0.47％氯化鈉(nacl)0.9％ph7.4實施例二糞便樣本處理方法本實施例提供一種對上述糞便樣本的處理方法：s1、對照組樣品預處理：固體糞便(對應樣品標號為0和5)：稱取200mg固體糞便於2ml離心管中，加入800ulstooldnabuffera，充分震蕩混勻5min左右，1800g離心1min；從中取出50ul重懸液於乾淨的1.5ml離心管中，加入800ullysis-bindingbuffer旋渦震蕩混勻，70℃裂解5min。離心5min後轉移上清至乾淨的1.5ml離心管中。s2、實驗組樣品預處理糞便保存液(對應樣品標號為1-4)：取200ul半液體狀態的糞便加入不超過10％(w/v)的stooldnabuffera進行稀釋，充分震蕩5min，從中取出50ul重懸液至乾淨的1.5ml離心管。s3、dna提取a、加入混勻的磁珠20ul，旋渦震蕩20s，室溫靜置4min，旋渦震蕩20s，室溫靜置4min.b、置於磁架上，靜止20s，吸取上清。c、加入500ulwashbufferw1，旋渦震蕩混勻磁珠20s。d、置於磁架上，靜置20s，棄上清。e、重複步驟d一次，並儘量除去所有液體。f、加入750ulwashbufferw2，旋渦震蕩混勻磁珠20s。g、置於磁架上，靜置20s，棄上清。h、重複步驟f-g一次，並儘量除去所有液體。i、置於磁力架上開蓋乾燥7-8min，用槍吸棄所有的液體。j、加入50ulelutionbuffer或ddh2o，旋渦震蕩混勻磁珠15s。k、65℃，7min(期間旋渦震蕩一次，震蕩10s)。旋渦震蕩混勻磁珠15s。l、置於磁力架上，靜置2min，吸上清於收集管中。s4、dna測序提取後的dna送往測序公司進行建庫測序，獲得測序數據後進行後續生物信息分析，得到菌群結果。實施例三不同的保存方式樣品菌群多樣性比較經過上述實驗操作，獲得了5位志願者6種處理方式下的腸道菌群序列信息，通過生物信息學分析，計算菌群香農多樣性指數，進行比較。各志願者經檢測後的香農指數如圖1所示，統計後的結果如表3所示，表中香農多樣性指數數值越高代表細菌的豐富程度越高，pvalue是標號0-4的樣品與標號5的樣品比對得到的差異性的可信度分析，結果表明，標號0-4的樣品基本可以滿足糞便微生物樣品dna的保存，然而與現有技術的保存液(標號4)相比，本發明的微生物樣品保存液的處理效果更接近液氮速凍的處理方法，尤其是標號2配方的保存液。表3不同處理方式下香農指數結果成分/標號012345香農指數9.57.59.48.56.33.2pvalue＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.05-以上所述僅是本發明的優選實施方式，並不用於限制本發明，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁12