一種NtHMA2基因突變體與應用的製作方法

2023-07-07 17:52:07 1

本發明屬於遺傳工程技術領域，具體涉及一種NtHMA2基因突變體與應用。

背景技術：

鎘( Cd)、砷( As) 、鉻( Cr) 、汞( Hg)和鉛( Pb) 等是公認的對植物和人體危害比較大的重金屬元素，植物必需微量元素鋅( Zn) 、鎳( Ni) 、銅( Cu)等如果過量也會產生危害。所以，關於作物重金屬汙染及其降低方法的研究越來越引起科研人員的重視。菸草（Nicotiana tabacum）是重要的經濟作物，是茄科一年生草本植物。近年來關於菸草中重金屬的研究也逐漸成為菸草減害研究的一個熱點。

重金屬對菸草品質會產生不利影響。菸鹼含量是衡量菸葉品質的一個重要指標，在一定範圍內提高菸鹼有利於菸葉品質的提高，Cd 汙染會降低菸葉菸鹼含量，可能原因是根合成菸鹼途徑或者菸鹼向上部轉運過程受阻。另外，菸葉中可溶性糖對Cd、Pb極為敏感，輕度汙染就會導致其含量明顯下降，這可能是由於重金屬破壞了菸草葉綠體，光合作用受阻引起的。重金屬會導致菸葉糖鹼比和氮鹼比升高，化學成分組成失衡，品質受到影響。

重金屬對人體的危害巨大，如過量的鎘進入人體內可能對血管造成損害；另外鎘元素對腸道吸收鐵具有抑制作用，還會干擾鈷、銅、鋅等微量元素的代謝過程，引起肺、腎、肝等人體臟器損害，最終可能導致致癌、致畸和致突變等作用。砷可以誘發許多疾病，如急性砷中毒可造成中樞神經系統障礙導致全身麻木、呼吸道和消化道病變甚至快速死亡；慢性砷中毒導致神經系統紊亂、全身乏力、食慾減退、噁心以及皮膚色素沉著和角化病等皮膚病變等，而且可以引起肺癌、皮膚癌和膀胱癌等疾病。鋅元素是人體的重要的微量元素之一，對人體的生長發育、智力、免疫功能甚至是視力都有至關重要的作用。但是人體中的鋅不是越多越好。人體攝入過量的鋅，在胃液中易轉化成氯化鋅，對胃黏膜有較強的腐蝕性，可致胃黏膜充血、水腫、甚至出血。過量的血鋅會抑制白細胞的吞噬功能，是人體抵抗力下降，易受病菌感染。過量的鋅還會影響人體其他無機鹽的吸收與代謝，如影響鐵的吸收，使肝臟中鐵代謝受損成銅/鋅比值過高；影響膽固醇代謝，形成高膽固醇血症等。鎳及其鹽類的毒性較低，但由於它本身具有生物化學活性，故能激活或抑制一系列的酶（精氨酸酶、羧化酶、酸性磷酸酶和拓脫羧酶）而發揮其毒性。鎳可引起接觸性皮炎。直接進入血液的鎳鹽毒性較高，膠體鎳或氯化鎳毒性較大，可引起中樞性循環和呼吸紊亂，使心肌、腦、肺和腎出現水腫、出血和變性。

菸草是我國重要的經濟作物，重金屬汙染不僅影響菸草本身生長發育，對吸食者的的健康也具有嚴重的威脅。減害一直是菸草科研工作的一個重要方向，其中降低重金屬含量是一個重要的公關目標。

技術實現要素：

本發明的第一目的在於提供一種NtHMA2基因的EMS突變體；第二目的在於提供所述的NtHMA2基因突變體的應用。

本發明的第一目的是這樣實現的，與野生型菸草的NtHMA2基因具有如序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列相比，突變體含有的NtHMA2基因序列520位的C突變為T，形成終止密碼子，使該基因提前終止。

所述的NtHMA2基因的EMS突變體的製備方法包括EMS誘變和TILLING篩選突變體。

EMS誘變菸草種子：

A ：利用漂白水處理菸草種子，然後旋轉離心並濾幹；

B ：對種子進行漂洗，清除漂白水，使種子不受漂白劑化學成分影響，然後進行旋轉離心濾幹；

C ：將種子放在10℃ ~30℃溫度下的去離子水中浸泡10~15小時，菸草種子催芽萌發，以利種子均勻誘變處理，然後進行旋轉離心濾幹；

D ：將種子放在0.5%的EMS （甲基磺酸乙酯）誘變劑溶液中浸泡處理10~15個小時，然後進行旋轉離心濾幹；

E ：將種子放在漂洗劑溶液中漂洗，再用去離子水衝洗，反覆進行5~8 次此過程，然後布氏漏鬥濾紙過濾乾燥。

TILLING篩選核苷酸變化的突變體

A ：誘變處理後的種子（M1代）播種與大田，單株套袋自交收種獲得M2代，每個M1代單株收穫的M2代種子播種1粒種子。

B：取M2代突變體單株葉片利用QIAGEN DNA提取試劑盒提取突變體材料葉片DNA。

C：樣品濃度測定及建池

將樣品按照順序大小排列。分別取2ul DNA樣品16通道 Tecan infinite M200儀器上進行濃度測定。將所有的樣品濃度稀釋至40ng/ul，製作8倍DNA池用於TILLING分析。

D: 利用Primer3設計NtHMA2基因TILLING分析引物，HMA2-F：

AATATAGAGATGGCCAATGAAGGT和HMA2-R： CTAAAATTTATATGACCAAGTACTT，擴增長度為1400bp左右。

E:TILLING分析 M2代突變體，篩選核苷酸突變的單株，並進行測序驗證，獲得一個突變體，其CDS的520位的C突變為T，形成終止密碼子，使該基因提前終止。

F:在M3代突變體篩選突變位點純合的植株，自交收種。

G:對純合突變體進行鎘吸收試驗，具體為在煙株現蕾期，將100µmol CdCL2溶液500mL澆於煙株根部。5天後取葉片，殺青烘乾，檢測重金屬含量。

H: 含有突變序列的菸草相比含有SEQ ID NO:1序列的菸草葉片鎘含量降低40%左右，鋅、鐵、鉛、鉻、鎳等含量降低30%左右，砷含量降低10%左右。

本發明的第二目的是這樣實現的，NtHMA2基因突變體可以使菸葉鎘含量降低30~50%，鋅、鐵、鉛、鉻、鎳等含量降低20~40%左右，砷含量降低5~15%左右。即以所述的NtHMA2基因突變體獲得低重金屬含量的菸草。

附圖說明

圖1 為突變體突變位點測序峰圖；

圖2為本發明NtHMA2突變體與雲煙87葉片鎘含量對比示意圖；

圖3為本發明NtHMA2突變體與雲煙87葉片鋅含量對比示意圖；

圖4為本發明NtHMA2突變體與雲煙87葉片鐵含量對比示意圖；

圖5為本發明NtHMA2突變體與雲煙87葉片砷含量對比示意圖；

圖6為本發明NtHMA2突變體與雲煙87葉片鉻含量對比示意圖；

圖7為本發明NtHMA2突變體與雲煙87葉片鎳含量對比示意圖。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基於本發明教導所作的任何變換或替換，均屬於本發明的保護範圍。

本發明所述的NtHMA2基因突變體，與野生型菸草的NtHMA2基因具有如序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列相比，突變體含有的NtHMA2基因序列520位的C突變為T，形成終止密碼子，使該基因提前終止。

NtHMA2基因編碼的胺基酸序列如SEQ ID No：2所示；

NtHMA2基因突變體的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；

NtHMA2基因突變體編碼的胺基酸序列如SEQ ID No：4所示；

所述的NtHMA2基因的EMS突變體的製備方法包括EMS誘變和TILLING篩選突變體。

EMS誘變菸草種子：

A ：利用漂白水處理菸草種子，然後旋轉離心並濾幹；

B ：對種子進行漂洗，清除漂白水，使種子不受漂白劑化學成分影響，然後進行旋轉離心濾幹；

C ：將種子放在10℃ ~30℃溫度下的去離子水中浸泡10~15小時，菸草種子催芽萌發，以利種子均勻誘變處理，然後進行旋轉離心濾幹；

D ：將種子放在0.5%的EMS （甲基磺酸乙酯）誘變劑溶液中浸泡處理10~15個小時，然後進行旋轉離心濾幹；

E ：將種子放在漂洗劑溶液中漂洗，再用去離子水衝洗，反覆進行5~8 次此過程，然後布氏漏鬥濾紙過濾乾燥。

TILLING篩選核苷酸變化的突變體

A ：誘變處理後的種子（M1代）播種與大田，單株套袋自交收種獲得M2代，每個M1代單株收穫的M2代種子播種1粒種子。

B：取M2代突變體單株葉片利用QIAGEN DNA提取試劑盒提取突變體材料葉片DNA。

C：樣品濃度測定及建池

將樣品按照順序大小排列。分別取2ul DNA樣品16通道 Tecan infinite M200儀器上進行濃度測定。將所有的樣品濃度稀釋至40ng/ul，製作8倍DNA池用於TILLING分析。

D: 利用Primer3設計NtHMA2基因TILLING分析引物，

HMA2-F：AATATAGAGATGGCCAATGAAGGT和

HMA2-R： CTAAAATTTATATGACCAAGTACTT，擴增長度為1400bp左右。

E:TILLING分析 M2代突變體，篩選核苷酸突變的單株，並進行測序驗證，獲得一個突變體，其CDS的520位的C突變為T，形成終止密碼子，使該基因提前終止。

F:在M3代突變體篩選突變位點純合的植株，自交收種。

G:對純合突變體進行鎘吸收試驗，具體為在煙株現蕾期，將100µmol CdCL2溶液500mL澆於煙株根部。5天後取葉片，殺青烘乾，檢測重金屬含量。

H: 含有突變序列的菸草相比含有SEQ ID NO:1序列的菸草葉片鎘含量降低40%左右，鋅、鐵、鉛、鉻、鎳等含量降低30%左右，砷含量降低10%左右。

本發明所述的應用為NtHMA2基因突變體可以使菸葉鎘含量降低30~50%左右，鋅、鐵、鉛、鉻、鎳等含量降低20~40%左右，砷含量降低5~15%左右。即以所述的NtHMA2基因突變體獲得低重金屬含量的菸草。

下面以具體實施案例對本發明做作進一步說明：

所述的NtHMA2突變體的製備方法，未突變NtHMA2突變體的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示，突變體的核苷酸序列520位的C突變為T，具體製備方法包括以下步驟：

（1）選用50% 漂白水處理雲煙87種子6 分鐘，離心濾幹；

（2）利用去離子對種子進行漂洗1 分鐘，離心濾幹去除漂白水成分；

（3）室溫條件，去離子水浸泡菸草種子10-12 小時，離心濾幹；

（4）室溫條件，0.50%EMS 甲基磺酸乙酯處理菸草種子12 小時，離心濾幹；

（5）加入去離子水漂洗1 分鐘，離心濾幹，共重複漂洗８次。然後布氏漏鬥濾紙過濾乾燥。

（6）誘變處理後的種子（M1代）播種與大田，單株套袋自交收種獲得M2代，每個M1代單株收穫的M2代種子播種1粒種子，共獲得1842個M2代單株。

（7）取M2代突變體單株葉片利用QIAGEN DNA提取試劑盒提取突變體材料葉片DNA。具體步驟如下：將樣品液氮研磨，並用1.5ml離心管收取；加入400ul的AP1溶液，4ul的RNA酶混勻；把樣品放入65℃水浴鍋水浴10min，期間搖勻3次；往樣品中加入130ul P3溶液，冰浴5mim；高速離心，13200rpm，5min；取上層液倒入紫色過濾柱，13200rpm，2min離心；將濾液轉入新的1.5mL離心管並加入675ul的AW1溶液混勻;把混勻樣品溶液分2次轉入淡黃色過濾柱並進行10000rpm，1min離心，棄除濾液；把淡黃色過濾柱放入新的2ml離心管中並加入500ul的AW2溶液，進行10000rpm，1min離心，棄濾液 (此步驟重複兩次)；再把棄除濾液的淡黃色過濾柱進行空轉（10000rpm，1min），將空轉好的淡黃色過濾柱放入新的1.5ml離心管中加入50ul AE溶液後靜置5min，放入離心機進行10000rpm，1min離心，去除淡黃色過濾柱，放入4℃冰箱保存。

（8）樣品濃度測定及建池

將樣品按照順序大小排列。分別取2ul DNA樣品16通道 Tecan infinite M200儀器上進行濃度測定。將所有的樣品濃度稀釋至40ng/ul，製作8倍DNA池用於TILLING分析。

（9）利用Primer3設計NtHMA2基因TILLING分析引物，

HMA2-F：AATATAGAGATGGCCAATGAAGGT和

HMA2-R：CTAAAATTTATATGACCAAGTACTT，擴增長度為1400bp左右。

（10）TILLING分析 M2代突變體，擴增體系為：1.0µl 10×buffer，0.8µl dNTP(2.5mM)，0.16 µl HMA2-F primer(10µM) ，0.16µl HMA2-R primer (10uM)， 6.78 µl H2O，1.0 µl DNA模板 (20ng/ul) 。反應程序為95℃ 3min，94℃ 30s，62℃ 30s，-1℃/循環，72℃ 1min，7個循環；94℃30s，58℃30s，72℃1min，40個循環，72℃5min；99℃ 10min；70℃20s, -0.3℃/循環, 70個循環，4℃保存。擴增產物通過毛細管電泳進行分析。

（11）篩選出的核苷酸突變的單株，進行測序驗證，獲得一個突變體，其NtHMA2基因CDS的520位的C突變為T，形成終止密碼子，使該基因提前終止。

（12）在M3代突變體中經過測序篩選突變位點純合的植株（圖1），自交收種。

NtHMA2突變體降低菸葉重金屬含量的方法包括以下步驟：

（1）對純合突變體進行鎘吸收試驗，具體為在溫室種植純合突變體及野生型對照，煙株現蕾期，將100µmol CdCL2溶液500mL澆於煙株根部，5天後取葉片，殺青烘乾。利用菸草行業標準YC/T380-2010的方法檢測菸葉重金屬含量。

（2）含有突變序列的菸草相比含有SEQ ID NO:1序列的菸草葉片鎘含量降低40%左右，鋅、鐵、鉛、鉻、鎳等含量降低30%左右，砷含量降低10%左右（表1，圖2~圖7）。

表1 菸葉重金屬含量

SEQUENCE LISTING

雲南省菸草農業科學研究院

一種NtHMA2突變體與應用

2017

PatentIn version 3.3

4212

DNA

NtHMA2基因核苷酸

atggtggaaa gtgaaaaaat gaatgaaaca aagaagttga gcaagagcta ttttgatgtt 60

ttgggaattt gctgtacttc agaagttgtt ctagttgaaa aaattctcaa gaatcttgaa 120

ggggttaaag aggtttcagt aattgtcaca acaaagactg tcattgttat tcatgattct 180

cttctcattt ctccgcaaca aattgttaaa gcattgaatc aagcaagatt agaagcaagc 240

ataagagtga aaggagagaa aaactaccaa aagaaatggc caagtccatt tgcaattggc 300

agtggaatat tgcttggact ctcatttttg aagtactttt ttgcaccttt ccaatggtta 360

gcacttgcag ctgttgcagt tgggattcct ccaattattt ttagaggtgt ggctgccgtg 420

cgaaacctca ctcttgacat caacattctt gttttaatag cagtggctgg atcaattgtt 480

ttacacgatt attgggaagc tggtactatt gtcttcttat tcgccattgc agaatggcta 540

gagtcaaggg caagtcacaa ggctaccgct gctatgtcat cactggtcaa tatagtccct 600

ccaacagcag ttttagctga aagcggagaa gtcgtaaatg ttgatgaagt caaggtgaat 660

agcattcttg ctgtgaaagc tggtgaaact atacctattg atggagttgt agtggaaggg 720

gaatgtgacg tggacgagaa aacactgaca ggcgagtcgt ttccagtttc taagcaaaga 780

gattcaacgg tctgggctgg cactacaaat ctaaatggct atatcagtgt taagactacg 840

gctttggctg aagattgtgc ggtggctagg atggcacagc ttgtcgaaga tgctcagaac 900

aagaaatcaa aaacccaaag atacatcgac aagtgtgcta aatattatac accagcaatt 960

gtggctatat cagcttcttt ggcaattgtt cctactgcat taagagttca caatcgaaat 1020

gaatggtatc gcttggcttt ggtcacattg gtgagtgcat gtccgtgtgc acttgttcta 1080

tctacaccag ttgccatgtg ttgcgcactt tcaaaagcag caacgtccgg tcttctgttt 1140

aaaggagcag agtaccttga gactctagct aaaatcaaaa tcatggcttt tgacaaaaca 1200

gggactataa ctaaaggaga atttatggtg accgagttca agtctctgat tgatggtttt 1260

agtctcaata cactgcttta ctgggtttca agcattgaga gcaagtcagg tcatccgatg 1320

gcagccgctc tggtggacta tgcacaatca aattccgttg agccaaagcc tgatagagtt 1380

gagcagtttc aaaattttcc tggtgaaggg atatttggaa gaattgatgg aatggaaatc 1440

tatgtcggga ataggaaaat ttcttcaaga gctggatgta ccacagtacc agaaatagag 1500

ggtgatagtt tcaaaggaaa gtctgttgga tacatatttt tgggatcatc tccagctgga 1560

attttcagtc tttccgatgt ttgtcgaatt ggtgtaaaag aagcaatgag agaactgaag 1620

cagatgggta tcaaaaccgc gatgcttact ggtgattgtt atgcagctgc caaccatgtg 1680

caggatcagt taggtggagc tttggatgaa tttcaagcag aactcctacc agaggacaag 1740

gcaacaatca tcaagggttt tcagaaggaa gctccaacag cgatgatagg cgacggcctt 1800

aatgatgctc ctgcattagc aacagctgac attggcatct caatgggcat ctctgggtca 1860

gctctcgcta aagaaacagg ccatgttata ctaatgacaa atgacatcgg aagaataccg 1920

aaagctgcac gtcttgctag aagagttcga aggaagattg ttgagaatat gattatatca 1980

gtcgttacaa aggctgccat agttgcattg gcaatagcag gttatccatt ggtttgggct 2040

gctgtcctcg cagatactgg gacatgcttg ctagtgattt tgaacagcat gctacttcta 2100

cgaggaggca cacgcagaca tgggaaaaaa tgttggagat cttctactcc ttcgcatgct 2160

ccccaccaca aagacaaagc ttcatgttgc aagtcggaaa atgctcccca gctgtgttgc 2220

tctgatattg agtcacaaaa gaaatgtaca agtcaatcat gctcgtccga ggtgtgtgtt 2280

ccaagatgtc aacctgtctc ctcaggatca aagtcatgtg gaaataatca gtgcccagac 2340

tccattgaaa atagtggttt tcattctcat ccccgtcctc aatgctgctc gtcgaagatg 2400

gctgctaaag catgccaatc tgcagtttca gaatcaaagt catgcggaaa taatcagtgc 2460

ccagactccg ttgaaaatag tggttttcat tctcatcccc gtcctgaatg ctgctcgtcg 2520

aagatggctg ctaaagcgtg ccaatctgca gtttcagaat caaagtcatg tggaaataat 2580

cagtgcccag actccgttga aaatagtggt tttcattctc atccccgtcc tcaatgctgt 2640

tcatcgaaga tggctgctaa agcaggccaa tctgcacttt cagaatcaaa gtcatgtgga 2700

aataacaatt gctcagactc cattcacaag agtaattgtc attctttaac taactctcta 2760

gtatgttctt ccaagatgtc tgctccacaa tgtcattctg ctacttcaag caacaaatca 2820

tgtggaagta ccaagtgctc cgacttcagt gacaaaaaat gttgtcaatc cgacaaaatt 2880

cctcaaacgt gctctaccaa gaagtctgct ccaggatgtc aatctgcagt ttctgggtct 2940

aaatcatgtg gaaatagcaa gtgttcagac tcaaaagaca atagtagcca tccttcacat 3000

cccgatcatc aaacatgcat gtctaagttg tgtgctccac aaagccaatc tgcaacttca 3060

agctccagga catgtggaaa tacaaagtgc tcggacacca atagcaagaa ttcttgttat 3120

tcacaaacca actctgaatc atgctcttca aagatgtctg gtccatcatg caaaactgct 3180

aattcaggtt caaggtcatg cagaaataag aagtgccagg actctgcaac cgagaacagt 3240

tttcattcac cacttactaa tccactcagt ggggaaaagc tttcggagca gaaaagcttg 3300

gatttagtcc gaaaagataa ggaatcaagt catgatcttc gtcatggctg ctctgacgag 3360

gaacatgatc atacaaattt agacaaggca tatgacagtt gtgccttaca agaatgttgt 3420

tattcggttc aaggcaataa aactgatgta tcagaaactg gaatccagga aactgctcat 3480

tgtgacagca ccaatcaaac atgccaaact gcaagttcag gatcgatgac atgcggaaat 3540

gataagatcc tggactctct aagcatccat ggttgtcatt cgcatgataa tccactccac 3600

gaggagaaca acttggagca gaaaatcttg gatgttgttg gagaaggtat aaaatcacct 3660

catgctgtcg gtcatggctg ttcggacaag gaacacgatc actcacatcc agaaaaggca 3720

tatgacagtt gtgcaacaga tgattgttgt ttttcagttc aagtccatgg cattgacgac 3780

gtatcaaaaa gtgaaattca agaaactgct cattgtgaca gcacaaagca gagcatggtc 3840

atctccagca gctgcaaaca tgaaccaaaa gatcaggtaa atcactgtgg acttcactct 3900

aaaactactc caactgatga agaactagcc aagctggtta gaagatgctg caaatacaaa 3960

ccatgccacg acgtccgttc tggctgcagg aagcatgctg cagaatgtgg tccaaccgtt 4020

cgatcaacca tcaatatctt acgggacaac catcatcatt acctagactg cagtggtcgt 4080

aaggtttgtt cgctgttgga gaagagacac atcggtggat gctgtgacag cttcagaaaa 4140

gaatgttgtg ccaagaaaaa acaccttgga gcaagttttg gaggaggttt atcagaaatt 4200

gtcatagagt ag 4212

1403

PRT

NtHMA2基因胺基酸

Met Val Glu Ser Glu Lys Met Asn Glu Thr Lys Lys Leu Ser Lys Ser

1 5 10 15

Tyr Phe Asp Val Leu Gly Ile Cys Cys Thr Ser Glu Val Val Leu Val

20 25 30

Glu Lys Ile Leu Lys Asn Leu Glu Gly Val Lys Glu Val Ser Val Ile

35 40 45

Val Thr Thr Lys Thr Val Ile Val Ile His Asp Ser Leu Leu Ile Ser

50 55 60

Pro Gln Gln Ile Val Lys Ala Leu Asn Gln Ala Arg Leu Glu Ala Ser

65 70 75 80

Ile Arg Val Lys Gly Glu Lys Asn Tyr Gln Lys Lys Trp Pro Ser Pro

85 90 95

Phe Ala Ile Gly Ser Gly Ile Leu Leu Gly Leu Ser Phe Leu Lys Tyr

100 105 110

Phe Phe Ala Pro Phe Gln Trp Leu Ala Leu Ala Ala Val Ala Val Gly

115 120 125

Ile Pro Pro Ile Ile Phe Arg Gly Val Ala Ala Val Arg Asn Leu Thr

130 135 140

Leu Asp Ile Asn Ile Leu Val Leu Ile Ala Val Ala Gly Ser Ile Val

145 150 155 160

Leu His Asp Tyr Trp Glu Ala Gly Thr Ile Val Phe Leu Phe Ala Ile

165 170 175

Ala Glu Trp Leu Glu Ser Arg Ala Ser His Lys Ala Thr Ala Ala Met

180 185 190

Ser Ser Leu Val Asn Ile Val Pro Pro Thr Ala Val Leu Ala Glu Ser

195 200 205

Gly Glu Val Val Asn Val Asp Glu Val Lys Val Asn Ser Ile Leu Ala

210 215 220

Val Lys Ala Gly Glu Thr Ile Pro Ile Asp Gly Val Val Val Glu Gly

225 230 235 240

Glu Cys Asp Val Asp Glu Lys Thr Leu Thr Gly Glu Ser Phe Pro Val

245 250 255

Ser Lys Gln Arg Asp Ser Thr Val Trp Ala Gly Thr Thr Asn Leu Asn

260 265 270

Gly Tyr Ile Ser Val Lys Thr Thr Ala Leu Ala Glu Asp Cys Ala Val

275 280 285

Ala Arg Met Ala Gln Leu Val Glu Asp Ala Gln Asn Lys Lys Ser Lys

290 295 300

Thr Gln Arg Tyr Ile Asp Lys Cys Ala Lys Tyr Tyr Thr Pro Ala Ile

305 310 315 320

Val Ala Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Val Pro Thr Ala Leu Arg Val

325 330 335

His Asn Arg Asn Glu Trp Tyr Arg Leu Ala Leu Val Thr Leu Val Ser

340 345 350

Ala Cys Pro Cys Ala Leu Val Leu Ser Thr Pro Val Ala Met Cys Cys

355 360 365

Ala Leu Ser Lys Ala Ala Thr Ser Gly Leu Leu Phe Lys Gly Ala Glu

370 375 380

Tyr Leu Glu Thr Leu Ala Lys Ile Lys Ile Met Ala Phe Asp Lys Thr

385 390 395 400

Gly Thr Ile Thr Lys Gly Glu Phe Met Val Thr Glu Phe Lys Ser Leu

405 410 415

Ile Asp Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu Leu Tyr Trp Val Ser Ser Ile

420 425 430

Glu Ser Lys Ser Gly His Pro Met Ala Ala Ala Leu Val Asp Tyr Ala

435 440 445

Gln Ser Asn Ser Val Glu Pro Lys Pro Asp Arg Val Glu Gln Phe Gln

450 455 460

Asn Phe Pro Gly Glu Gly Ile Phe Gly Arg Ile Asp Gly Met Glu Ile

465 470 475 480

Tyr Val Gly Asn Arg Lys Ile Ser Ser Arg Ala Gly Cys Thr Thr Val

485 490 495

Pro Glu Ile Glu Gly Asp Ser Phe Lys Gly Lys Ser Val Gly Tyr Ile

500 505 510

Phe Leu Gly Ser Ser Pro Ala Gly Ile Phe Ser Leu Ser Asp Val Cys

515 520 525

Arg Ile Gly Val Lys Glu Ala Met Arg Glu Leu Lys Gln Met Gly Ile

530 535 540

Lys Thr Ala Met Leu Thr Gly Asp Cys Tyr Ala Ala Ala Asn His Val

545 550 555 560

Gln Asp Gln Leu Gly Gly Ala Leu Asp Glu Phe Gln Ala Glu Leu Leu

565 570 575

Pro Glu Asp Lys Ala Thr Ile Ile Lys Gly Phe Gln Lys Glu Ala Pro

580 585 590

Thr Ala Met Ile Gly Asp Gly Leu Asn Asp Ala Pro Ala Leu Ala Thr

595 600 605

Ala Asp Ile Gly Ile Ser Met Gly Ile Ser Gly Ser Ala Leu Ala Lys

610 615 620

Glu Thr Gly His Val Ile Leu Met Thr Asn Asp Ile Gly Arg Ile Pro

625 630 635 640

Lys Ala Ala Arg Leu Ala Arg Arg Val Arg Arg Lys Ile Val Glu Asn

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Met Ile Ile Ser Val Val Thr Lys Ala Ala Ile Val Ala Leu Ala Ile

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Cys Leu Leu Val Ile Leu Asn Ser Met Leu Leu Leu Arg Gly Gly Thr

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Arg Arg His Gly Lys Lys Cys Trp Arg Ser Ser Thr Pro Ser His Ala

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Pro His His Lys Asp Lys Ala Ser Cys Cys Lys Ser Glu Asn Ala Pro

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Ser Cys Ser Ser Glu Val Cys Val Pro Arg Cys Gln Pro Val Ser Ser

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Ser Gly Phe His Ser His Pro Arg Pro Gln Cys Cys Ser Ser Lys Met

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Ala Ala Lys Ala Cys Gln Ser Ala Val Ser Glu Ser Lys Ser Cys Gly

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Pro Arg Pro Glu Cys Cys Ser Ser Lys Met Ala Ala Lys Ala Cys Gln

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Ser Ser Lys Met Ala Ala Lys Ala Gly Gln Ser Ala Leu Ser Glu Ser

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1400

4212

DNA

NtHMA2基因突變體核苷酸