可控性腫瘤活細胞疫苗及其製備方法和用途的製作方法
2023-12-09 02:19:56 2
專利名稱：可控性腫瘤活細胞疫苗及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種可控性腫瘤活細胞疫苗及其製備方法和用途，屬於腫 瘤生物免疫治療和細胞免疫學領域。
背景技術：
目前，癌症仍然為人類的主要死亡原因。癌症治療的常規方法，如手 術、放療和化療等，雖然在治療一^良性及生長速度較慢的腫瘤效果較好， 但對於浸潤生長、增殖快速的惡性實質腫瘤，這些常規的治療措施療效很 不理想。
大量研究表明，腫瘤細胞之所以能在生物體內失控生長、增殖，主要 原因是機體抗腫瘤免疫機制的缺陷或不完善，從而使腫瘤細胞逃避機體的 "免疫監視"而處於"免疫逃逸"狀態，尤其反映在機體免疫細胞不能對 腫瘤抗原進行特異性免疫識別，自身難以激發足夠的免疫反應。
近年來，腫瘤細胞疫苗的發展為治療惡性腫瘤帶來了希望。目前用於 製備腫瘤細胞疫苗的細胞主要有腫瘤細胞和抗原提呈細胞(Antigen Presenting Cells, APC)兩種，所採用的方法通常有以下幾種1、直接 將死亡全腫瘤細胞或腫瘤細胞裂解輛作為腫瘤疫苗；2、將基因修飾的APC (一般是樹突狀細胞Denditic Cells, DC)作為腫瘤疫苗；3、將APC尤 其是DC與腫瘤細胞進行融合形成雜交瘤，以其提取物作為腫瘤疫苗；4、 將基因修飾的腫瘤細胞滅活後製成腫瘤疫苗。
雖然採用上述方法製備的腫瘤細胞疫苗在體外、動物試驗和臨床前研 究方面證明其具有一定的有效性，但臨床試驗有效果不好，主要存在以下 缺陷或不足 ，
1、 抗原提呈效率低，抗原提呈不完全，如腫瘤DNA疫苗、RNA疫苗不 能通過MHC或HLA-II類分子對腫瘤抗原進行提呈，而滅活腫瘤細胞或其裂 解物與APC或T細胞共同培養又不能有效通過MHC或HLA- I類分子進行腫
瘤抗原提呈。 '
2、 多數為單價腫瘤疫苗，僅供特定個體免疫治療，而絕大多數腫瘤 抗原異質性高，缺乏特異抗原表型，單價疫苗效果差。3、疫苗效價低，活的腫瘤疫苗具有高效的抗腫瘤免疫能力，腫瘤疫 苗的失活是導致其效價降低的主要原因之一。研究表明，細胞因子基因修 飾的瘤苗，其細胞因子的表達與細胞活性呈線性相關，經放射線處理後的 瘤苗與活瘤苗比較，細胞因子分泌量顯著減少，經放射線處理後的腫瘤細 胞有可能產生腫瘤特異性抗原基因突變，導致腫瘤疫苗的特異性下降；而 DC經放射線照射後，其表面共刺激分子和MHC分子表達均下降，必然影響 DC提呈抗原的活性，刺激T淋巴細胞增殖的能力也顯著降低。
發明內容
本發明的第一個目的，是為了克服現有的腫瘤細胞疫苗存在抗原提呈 效率低、抗原提呈不完全、單價疫苗效果差和g價低的缺陷，提供一種可 控性腫瘤活細胞疫苗。
本發明的第二個目的，是為了提供可控性腫瘤活細胞疫苗的製備方法。
本發明的第三個目的，是為了il供可控性腫瘤活細胞疫苗的用途。
本發明的第--.個目的可以通過採取如下技術方案達到 可控性腫瘤活細胞疫苗，其特點是
1) 由自殺基因胸苷激酶TK和免疫調節基因，通過轉染腫瘤細胞進行
轉基因操作形成雙基因修飾的可控腫瘤活細胞疫苗；
2) 可直接接種宿主或與抗原提呈細胞DC融合後接種宿主，可控腫瘤 活細胞疫苗在接種-周后可以於體內給予GCV滅活；
3) 既可控制活疫苗體內生長，又可使目的基因充分分泌表達。 本發明的第一個目的還可以通過採取如下技術方案達到
所述的免疫調節基因可以是IL-18、 IL-12、 IL-2、 B7-l、 IFN-Y 、 GM-CSF
等各種免疫基因，以及其他治療用具有免疫活性的目的基因等。
本發明的第二個目的可以通過釆取如下技術方案達到
可控性腫瘤活細胞疫苗的製備方法，其特徵在於將自殺基因胸苷激
酶TK和免疫調節基因如IL-18通過慢病毒感染和脂質體介導的方式轉染 腫瘤細胞進行轉基因操作，篩選穩定表達上述目'的基因的細胞克隆培養擴 增獲得雙基因修飾的腫瘤細胞疫苗；具體包括如下歩驟1) 建立穩定表達TK基因的腫瘤細胞系；
2) 建立雙基因修飾的腫瘤活細胞疫苗；
3) 活腫瘤細胞疫苗的體外調控抑瘤觀察；
4) 活腫瘤細胞疫苗的體內調控抑瘤觀察；
5) 活細胞疫苗致敏DC誘導製備特異性抗J3，瘤CTL。
本發明中進行轉基因操作需要應用慢病毒載體，所述載體可以是腺相 關病毒載體、慢病毒載體或質粒DNA載體。
本發明中應用的慢病毒載體可以是第三代慢病毒載體質粒，所應用的 慢病毒表達系統ViraPowerTM Lentiviral Expression Systems 為載體質 粒、包裝質粒、rev質粒和包膜蛋白質粒4質粒共轉染293T細胞生產假病 毒顆粒。應用該系統包裝的基因質粒克服了腺病毒作為載體轉染時不能建 立長期穩定表達目的基因細胞系的缺點。
該包裝系統中①去掉了 HIV的大部分的蛋白編碼基因，不存在產生復 制型HIV的可能性；②慢病毒載體的包裝質粒中缺失掉了 LTRs，因而載體 基因組只能在生產細胞中表達，而不可能被整合入病毒粒子中；③假型慢 病毒載體無複製性，只攜帶外源基因，相當均一，無類似於複製型腺病毒 (replication competent adenoviruses, RCA)之類的成分；④載體基因 組有自滅活機制，整合於宿主基因組後，不可能再被拯救而產生可被包裝 的病毒基因組，因而其生物安全性極高。
本發明所述包裝系統中去掉了 HIV的大部分的蛋白編碼基因；慢病毒 載體的包裝質粒中缺失掉了 LTRs;假型慢病毒載體無複製性，只攜帶外源 基因；載體基因組有自滅活機制。
本發明的第三個目的可以通過採取如下技術方案達到
可控性腫瘤活細胞疫苗的用途，其特徵在於通過基因修飾的活腫瘤
細胞疫苗激活免疫系統淋巴細胞增殖，產生特異性CTL殺傷效應和/或非 特異性NK殺傷效應，在宿主體內產生顯著增強的抗腫瘤免疫應答。
本發明所述的可控腫瘤活細胞疫苗可以單獨使用，或與手術、放療、 化療及其他生物治療聯合應用以取得最佳療效。
本發明所述的可控腫瘤活細胞疫苗可以直接使用，也可以在體外刺激產生細胞毒性T淋巴細胞，間接使用。
本發明所述的可控腫瘤活細胞疫苗使用途徑包括但不限於以下幾種 皮下、皮內、腫瘤內注射，其中以靠近腋窩、腹股溝附近的皮內注射為佳。
應用本發明處理細胞時，外源基因表達效率的提高不是由轉導的基因 種類引起的，因此多種基因都可以用於轉染，以適應不同設計需要，例如 IL-12、 IL-2、 B7-1、 IFN-y、 GM-tSF等各種免疫基因，以及其他治療用 具有免疫活性的目的基因等。
本發明具有如下有益效果
1、本發明克服了現有技術中的缺點，通過對腫瘤細胞進行轉基因操 作，製備成可調控的活細胞疫苗免疫治療惡性腫瘤的新策略以及製備方 法，經過這樣的處理後，腫瘤疫苗的效價更高，腫瘤抗原的提呈更加完全， 外源免疫調節基因的表達增高並且穩定，更好的實現轉基因的效果，從而 增強腫瘤疫苗激發的特異性免疫反應，增加腫瘤疫苗的療效。
2 、本發明利用HSV-TK/GCV系統在特定時間控制免疫調節基因修飾的 腫瘤細胞疫苗死活，有機地結合免^基因工程化技術和DC疫苗的優勢達 到抗原提呈及目的基因分泌最大化的雙重效應。在保證安全性的前提下， 這一疫苗策略可擴展為使用同種異體腫瘤細胞系建立活細胞通用疫苗庫， 克服自身腫瘤取材及培養的不足，同時有利於克服自身腫瘤抗原免疫逃逸 的缺點，刺激機體產生更強的免疫識別和殺傷效應。
3、 本發明首次利用慢病毒載體取代傳統的逆轉錄病毒包裝攜帶TK基 因，大大提高了轉染效率，可以高效整合入腫瘤細胞基因組中，經過加壓 篩選獲得穩定傳代表達的細胞系，為活疫苗構建奠定了前提基礎。
4、 本發明能滿足大量腫瘤疫苗製備要求，適於建立通用抗腫瘤疫苗 庫，可縮短現有疫苗方法的製備時間和成本，並且容易形成一種惡性腫瘤 免疫治療標準。 ，
圖l為本發明通過HSV-TK/GCV系統對U87/TK/I1-18腫瘤細胞疫苗 "死活"的體外調控示意圖。
圖2為本發明通過MTT法測試GCV對U87/ TK/IL-18腫瘤細胞疫苗的
增殖抑制示意圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解這些實施例僅用於 說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的 實驗方法，如大腸桿菌感受態細胞的製備與轉化、質粒提取及限制性內切 酶消化、DNA片段的回收、線性DNA片段的連接、重組質粒的篩選與鑑定、 PCR擴增反應、蛋白印跡等按照常規條件如Sambrook等，分子克隆實驗 室手冊 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中 所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1:
本實施例提供一種可控腫瘤活細胞疫苗，其特點是
1) 由自殺基因胸苷激酶TK和免疫調節基因，通過轉染腫瘤細胞進行
轉基因操作形成雙基因修飾的可控i中瘤活細胞疫苗；
2) 可直接接種宿主或與抗原提呈細胞DC融合後接種宿主，可控腫瘤 活細胞疫苗在接種一周後可以於體內給予GCV滅活；
3) 既可控制活疫苗體內生長，又可使目的基因充分分泌表達。 本實施例的製備方法包括如下步驟
1、建立穩定表達TK基因的腫瘤細胞系 '
本實施例以腦膠質瘤細胞株U87為例進行說明，所述操作均在無菌條
件下進行。
(1) 腫瘤細胞體外培養 ，
按照ATCC (http : 〃www. atcc.org)哺乳動物細胞培養方案及U87細胞 系培養方案，用含10。/。胎牛血清(FBS)、青黴素100U/ml、鏈黴素100Pg/ml 和1%L-穀氨醯胺的DMEM(高糖)完全培養基培養，置於5%C02、 37°C、飽 和溼度條件培養箱中培養。
(2) TK基因修飾腫瘤細胞
對數生長期的膠質瘤U87細胞鋪6孔板，2.'0X105 cells/per well, 在37°C、5%C02飽和溼度培養箱培養；感染前更換新鮮DMEM完全培養基， 置於培養箱中待用；將表達TK基因的載體pLenti-TK質粒(含抗性基因 BSD)慢病毒液，由-7(TC冰箱取出，37。C水浴融化，按10-2終稀釋比，加入培養孔板感染腫瘤細胞，前後晃板混勻，置於箱中培養24h後更換培 養液繼續培養24h更換含BSD(終濃度6 u g/ml)的新鮮DMEM完全培養基 篩選；每3 4d更換培養基，給予BSD壓力培養10d後，採用畫圈法挑取 單克隆細胞株，擴增傳代，RT-PCR及Western鑑定目的基因的表達。
2、 建立雙基因修飾的腫瘤活細胞疫苗 '
本實施例以免疫調節基因IL-18為例進行說明，以篩選獲得穩定高表 達目的基因的腫瘤細胞株為活疫苗的主體。
利用LipofectamineTM 2000糹旨質體轉染試劑盒(Sigma產品)介導的 pcDNA3. l-hIL-18轉染U87/TK細胞。U87/TK細胞以1X105 cells/500 u 1 /well鋪24孔板培養，達到90%融合度時轉染；將lug的質粒稀釋於 50 u 1無血清的DMEM培養基中，輕輕混勻；2u 1的LipofectamineTM 2000 溶於50y 1無血清的匿EM培養基中，室溫下孵育5min;稀釋後的質粒與 LipofectamineTM 2000輕輕均勻混合，室溫下孵育20min;將轉染液 (100u l)加入待轉染的細胞孔中，前後輕搖培養板充分混勻，置於37"C、 5%C02飽和溼度培養箱；轉染後次閂更換為DM'EM完全培養基繼續培養， 轉染後48h更換為含G418及BSD的DMEM完全培養基篩選培養；每3 4d 更換培養基，給予G418及BSD壓力培養10d後，採用畫圈法挑取單克隆 細胞株，擴增傳代，RT-PCR、 ELISA及Western鑑定目的基因的表達。
3、 活腫瘤細胞疫苗的體外調控抑瘤觀察
將U87/TK/IL-18細胞接種96孔板，每孔接種細胞2 4X 103，置於 37°C、 5%C02培養箱培養使細胞貼壁生長；6h或過夜後加入GCV，使GCV 終濃度為0、 0.01、 0.1、 1、 10、 50ug/ml，每組設3個復孔，置於培養 箱中培養6天，每天觀察細胞存活情況；6天後，吸除96孔板中培養液， 加入200ixl無血清純培養液稀釋的0.5mg/mlMTT溶液，37'C避光培養 4-6h;除去MTT液，加入100u 1DMS0溶液，在ll聯免疫檢測儀上以570nm 吸收波長測定各孔吸光度值，計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗孔吸 光值/對照孔吸光值)X100%，細胞殺傷率=1一細胞存活率。
4、 活腫瘤細胞疫苗的體內調控抑瘤觀察
(1)將生長狀態良好的體外培養的活細胞疫苗以4.2X106個/只分 別皮下接種於裸鼠腋下， 一周後隨機分組，給予GCV100mg/kg，給藥途徑 為腹腔注射給藥，給藥容量0. lml/10g體重，l次/天，連續給藥7天。
9(2)實驗過程中比較各組動物存活時間的'差異；根據以下公式計算 腫瘤體積V4/2X長徑X短徑2，計算腫瘤體積並比較各組間腫瘤生長曲
線的差異。
(3 )療效評價按照RTV=Vt /,V0公式計算相對腫瘤體積(RTV )和相 對腫瘤增殖率T/C%， T/Cy^給藥組的RTV平均值/陰性對照組的RTV平均值
X100%， (Vt:每天測量腫瘤得到的瘤體積；V0:初始瘤體積(給藥前))，
如果1/0%>40%，為無效，如果T/C。/。《40。/。，經統計學處理P<0. 05，為有效。
(4)腫瘤組織的病理組織學觀察觀察各主要臟器有無轉移瘤形成，
腫瘤及心肝脾肺腎等組織製備石蠟切片，進行病理組織學觀察。
5、活細胞疫苗致敏DC誘導製備特異性抗腫瘤CTL
(1) DC細胞的培養和成熟
無菌操作抽取健康人外周血，jp素抗凝後緩慢加入裝有淋巴細胞分離 液的離心管中，分層後離心棄上清，吸取中間的白色細胞層；在含有5% FCS和1%雙抗的RPMI-1640中培養2小時，將懸浮的細胞(含T細胞) 吸出，置入含10U/ml人重組白介素-2(rhlL-2) 、 80ng/ml人重組GM-CSF、 10%FCS和1%雙抗的RPMI-1640中培養，每二天換液一次。貼壁的細胞 加入DC培養液(含RPMI-1640、 5%FCS、 100U/ ml GM-CSF、 500 U/ml IL-4)， 於37。C、 5%C02的孵箱中培養，每三天換液，可加入40 ng/ml的TNF-a 或l y g/ml的LPS刺激DC成熟，第七天收穫DC細胞備用。
(2) 腫瘤細胞疫苗在體外刺激DC
將製備好的腫瘤細胞疫苗加入成熟的DC細胞中，按DC與腫瘤細胞的 比例為5:1-10:1混合，37°C， 5%(:，02溫箱孵育24 48h，作為致敏的抗原 提呈細胞。
(3) 特異性抗腫瘤CTL的誘導製備
將致敏的腫瘤細胞疫苗與10 20倍的自體淋巴細胞等體積混合，37 °C， 5%(:02溫箱培養5 6天，3天後加入30U/ml的IL-2誘導抗原特異性 CTL的活化和擴增，收集通過Nylon wool分離的T cell，此特異性抗腫 瘤CTL細胞可直接應用於臨床治療。
(4) 細胞毒性T細胞(CTL)檢測收集通過Nylon wool分離的T cell,與51Cr標記的腫瘤細胞混合， 在37'C、 5% C02培養箱內培養5小時，在Y射線檢測儀上檢測51Cr的 釋放的強度，即可反映細胞毒性T細胞(CTL)對相應靶細胞的殺傷作用。
研究結果表明，本發明是一種安全、有效的基因工程腫瘤活細胞疫苗， 具有丌發成為用於惡性腫瘤治療性疫苗的良好前景。
本發明利用基因工程技術，用免疫細胞因，基因修飾腫瘤細胞的瘤 苗，在體內細胞因子僅需極微量的表達，就可以達到大劑量全身系統給藥 才能產生的生物學免疫反應，而且基因的持續表達，可以避免反覆大劑量 給藥對機體的副損害。經基因修飾的細胞疫苗更加高效地增強細胞的抗原 提呈能力，增加細胞的免疫原性，糾正患者的"免疫耐受"狀態，激發和 強化患者自身的特異性抗腫瘤免疫功能。
權利要求
1、可控性腫瘤活細胞疫苗，其特徵是1)由自殺基因胸苷激酶TK和免疫調節基因，通過轉染腫瘤細胞進行轉基因操作形成雙基因修飾的可控腫瘤活細胞疫苗；2)可直接接種宿主或與抗原提呈細胞DC融合後接種宿主，可控腫瘤活細胞疫苗在接種一周後可以於體內給予GCV滅活；3)既可控制活疫苗體內生長，又可使目的基因充分分泌表達。
2、 根據權利要求1所述的可控性腫瘤活細胞疫苗，其特徵是所述的免 疫調節基因是IL-18、 IL-12、 IL-2、 B7-l、 IFN-Y或GM-CSF免疫基因，或者是 治療用具有免疫活性的目的基因。
3、 可控性腫瘤活細胞疫苗的製備方法，其特徵在於將自殺基因胸 苷激酶TK和免疫調節基因如IL-18通過慢病毒感染和脂質體介導的方式 轉染腫瘤細胞進行轉基因操作，篩選穩定表達上述目的基因的細胞克隆培 養擴增獲得雙基因修飾的腫瘤細胞疫苗；具體包括如下步驟1) 建立穩定表達TK基因的腫瘤細胞系；2) 建立雙基因修飾的腫瘤活細胞疫苗；3) 活腫瘤細胞疫苗的體外調控抑瘤觀察；4) 活腫瘤細胞疫苗的體內調控抑瘤觀察；5) 活細胞疫苗致敏DC誘導製備特異性抗腫瘤CTL。
4、 根據權利要求3所述的可控性腫瘤活細胞疫苗的製備方法，其特 徵在於進行轉基因操作需要應用慢病毒載體，所述載體是腺相關病毒載 體、慢病毒載體或質粒DNA載體。
5、 根據權利要求4所述的可控性腫瘤活細胞疫苗的製備方法，其特 徵在於所應用的慢病毒載體為載體質粒、包裝質粒、rev質粒和包膜蛋 白質粒4質粒共轉染293T細胞生產假病毒顆粒。
6、 根據權利要求4所述的可控性腫瘤活細胞疫苗的製備方法，其特 徵在於所應用的慢病毒載體中去掉了 HIV的大部分的蛋白編碼基因；慢 病毒載體的包裝質粒中缺失掉了 LTRs;假型慢病毒載體無複製性，只攜帶 外源基因；載體基因組有自滅活機制。
7、 可控性腫瘤活細胞疫苗的用途，其特徵在於通過基因修飾的活 腫瘤細胞疫苗激活免疫系統淋巴細胞增殖，產生特異性CTL殺傷效應和/ 或非特異性NK殺傷效應，在宿主體內產生顯著增強的抗腫瘤免疫應答。
8、 根據權利要求7所述的可控性腫瘤活細胞疫苗的用途，其特徵在 於可控腫瘤活細胞疫苗單獨使用，或與手術、放療、化療及其他生物治療聯合應用。
9、 根據權利要求7所述的可控性腫瘤活細'胞疫苗的用途，其特徵在 於可控腫瘤活細胞疫苗可以直接使用，或者在體外刺激產生細胞毒性T 淋巴細胞，間接使用。
10、 根據權利要求7所述的可控性腫瘤活細胞疫苗的用途，其特徵在 於可控腫瘤活細胞疫苗使用途徑包括皮下、皮內、腫瘤內注射，其中以 靠近腋窩、腹股溝附近的皮內注射為佳。
全文摘要
本發明涉及一種可控性腫瘤活細胞疫苗及其製備方法和用途，其特徵在於將自殺基因胸苷激酶TK和免疫調節基因通過慢病毒感染和脂質體介導的方式轉染腫瘤細胞進行轉基因操作，篩選穩定表達上述目的基因的細胞克隆培養擴增獲得雙基因修飾的腫瘤細胞疫苗。本發明疫苗能夠激活免疫系統淋巴細胞增殖，產生特異性CTL殺傷效應和/或非特異性NK殺傷效應，在宿主體內產生顯著增強的抗腫瘤免疫應答。本發明腫瘤疫苗的效價更高，腫瘤抗原的提呈更加完全，外源免疫調節基因的表達增高並且穩定，更好的實現轉基因的效果，從而增強腫瘤疫苗激發的特異性免疫反應，增加腫瘤疫苗的療效。
文檔編號A61K39/00GK101559220SQ20081019875
公開日2009年10月21日 申請日期2008年9月25日 優先權日2008年9月25日
發明者戴學軍, 健 林, 王偉民 申請人:廣州軍區廣州總醫院