快速提取測定氧化葡萄糖桿菌胞內右旋糖酐糊精酶方法

2023-07-22 13:22:21 2

專利名稱：快速提取測定氧化葡萄糖桿菌胞內右旋糖酐糊精酶方法
技術領域：
本發明涉及一種快速提取、測定氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacteroxydans)胞內 右旋糖酐糊精酶的方法。
背景技術：
右旋糖酐(Dextran)，又名葡聚糖，是一種由葡萄糖單元脫水形成的高分子聚合 物，是世界上最早發現的微生物多糖，其化學結構主要是由葡萄糖的a-l，6_鍵首尾脫水 縮合而成的一條線形長分子鏈，在分子結構中含有不同比例的a-l，2、a_l，3及a_l， 4-糖苷鍵的支鏈，分子式為(C6H1(l05)n。右旋糖酐因其安全、無毒、生物相容性好等優點，被 廣泛應用於醫藥、食品、色譜分析等多個領域。右旋糖酐膠體液具有擴充血容量、維持血壓 的功效，可作為血漿代用品。在食品工業中，因其具有持水性、粘稠性，作為食品添加劑。在 石油工業中，右旋糖酐可作為油井鑽泥添加劑。同時也可應用於精細化工，製成交聯葡聚糖 凝膠，廣泛應用於分子篩色譜技術。此外，新型的改性右旋糖酐合成酶合成的改性葡聚糖作 為低熱量食品和益生源物質受到了相當的關注。右旋糖酐的生產有兩種方法微生物直接發酵法和酶合成法，工業生產主要以直 接發酵法為主。直接發酵法生產葡聚糖時，產物分子大小難以控制，發酵後菌體與產品很難 分離，生產中引入的氮、氯等雜質，致使右旋糖酐質量低，臨床副反應多。利用誘導分離出的 葡聚糖合成酶來製備右旋糖酐可以克服這些不足。因此，從特有的微生物中通過分子生物 學技術構建和篩選的右旋糖酐合成酶的全新酶源是目前研究重點之一。Hehre和Hamilton等在研究中發現來源於G. oxydans中的某種酶能夠利用麥芽糊 精和澱粉部分水解物合成右旋糖酐，這種酶被命名為右旋糖酐糊精酶(DDase)。該酶可催化 形成只含有a-l，6和a-1，4_糖苷鍵的右旋糖酐，該右旋糖酐與利用腸膜明串珠菌製備的 右旋糖酐相比，粘度和含熱值較低，且具有持水性、粘稠性的特點，作為低熱量食品添加劑， 廣泛應用於食品行業。研究表明，應用DDase是一條優良的右旋糖酐合成途徑。該種產品 還有許多潛在的應用領域亟待開發，如新型食品添加劑、澱粉基甜味劑、低脂肪食物替代品 等等。近二十年來，人們開始慢慢關注這種特殊的轉糖基酶(DDase)，分別對該酶的特性進 行了深入的研究，包括影響產酶的環境因素、酶的純化、酶的底物特異性以及糖基衍生物的 合成等等。對於氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)胞內右旋糖酐糊精酶的研究也 成為研究熱點，目前對於胞內右旋糖酐酶的提取測定方法主要使用超聲波破碎法，由於該 方法每次只能破碎一個樣品，不但操作時間長，而且不能對樣品進行平行分析，導致結果平 行性和重複性差；同時破碎條件不溫和，導致部分酶失活；因此開發一種快速的胞內右旋 糖酐酶的提取測定方法是很有必要的。

發明內容
本發明的目的是提供一種快速提取、測定氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)胞內右旋糖酐糊精酶的方法，以克服現有技術存在的缺陷。
為實現上述目的，本發明主要包括如下步驟A)將氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)發酵液離心，並使用磷酸緩衝液 洗滌菌體；B)將步驟A獲得的菌體，添加5-25%的甘氨酸+0. 5_5%的Triton X-100對細胞 進行透性化處理；C)將步驟B的細胞透性化處理液，調節pH至pH6. 0-7. 5，進行細胞透性化處理 l_5h，使得細胞內的氧化葡萄糖桿菌右旋糖酐糊精酶釋放出來；D)測定胞內右旋糖酐糊精酶轉化對硝基苯_ a -D-吡喃葡糖苷(NPG)生成對硝基 苯酚(p-nitrophenol)的酶活。本發明同現有技術相比的顯著優點是胞內右旋糖酐糊精酶提取過程中，細胞破 壁條件溫和，既能使胞內酶儘可能多的釋放出來，又能維持胞內酶及系列生化活性物質的 穩定性，可以應用於胞內右旋糖酐糊精酶的快速提取測定，並且一次性試驗處理量大、平行 性好。
具體實施例方式實施例1(1)將氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)發酵液離心，並使用磷酸緩衝 液洗滌菌體；(2)將步驟(1)獲得的菌體，添加15%的甘氨酸+1%的Triton X-100對細胞進行 透性化處理；(3)將步驟⑵的細胞透性化處理液，調節pH至pH6. 0 ；(4)按照步驟(3)，進行細胞透性化處理3h，使得細胞內的氧化葡萄糖桿菌右旋糖 酐糊精酶釋放出來；(5)然後測定胞內右旋糖酐糊精酶轉化對硝基苯-a -D-卩比喃葡糖苷(NPG)生成對 硝基苯酚(p-nitrophenol)的酶活。步驟5 為一種常規的方法，根據 Process Biochemistry 39 (2004) 1299-1304 文獻 報導的方法作了適當修改，簡述如下向L 0. 6mL 2mM 的 p-nitrophenyl-a -D-glucopyranoside (NPG)，7中 液(50mM pH6. 47)的體系中，加入0. 5mL步驟(4)得到的酶提取液，30°C下反應30min，然後 加入500 uL 1M碳酸鹽緩衝液(pH10. 83)，測定A410下的吸光值。實施例2實施例1中，將步驟2改為添加25%的甘氨酸+0. 5%的Triton X-100對細胞進 行透性化處理。實施例3實施例1中，將步驟2改為添加15 %的甘氨酸+1 %的Triton X-100對細胞進行 透性化處理。實施例4實施例1中，將步驟2改為添加5%的甘氨酸+5%的Triton X-100對細胞進行透 性化處理。
實施例5實施例1中，將步驟3改為調節pH至pH6. 5。實施例6實施例1中，將步驟3改為調節pH至pH7. 0。實施例7實施例1中，將步驟3改為調節pH至pH7. 5。實施例8實施例1中，將步驟4改為進行細胞透性化處理lh，使得細胞內的氧化葡萄糖桿菌 右旋糖酐糊精酶釋放出來。實施例9實施例1中，將步驟4改為進行細胞透性化處理5h，使得細胞內的氧化葡萄糖桿菌 右旋糖酐糊精酶釋放出來。
權利要求
一種快速提取測定氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)胞內右旋糖酐糊精酶的方法，其主要步驟為A)將氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)發酵液離心，並使用磷酸緩衝液洗滌菌體；B)將步驟A獲得的菌體用細胞透性化處理液對細胞進行透性化處理，使得細胞內的氧化葡萄糖桿菌右旋糖酐糊精酶釋放出來；C)測定右旋糖酐糊精酶轉化對硝基苯 α D 吡喃葡糖苷(NPG)生成對硝基苯酚(p nitrophenol)的酶活。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟B的胞透性化處理液為5-25%的甘氨酸 +0. 5-5% 的 Triton X-IOO0
3.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟B的細胞透性化處理液pH為6.0-7. 5。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟B中細胞透性化處理時間為1-5小時。
全文摘要
本發明公開了一種快速提取測定氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)胞內右旋糖酐糊精酶的方法，主要步驟包括將氧化葡萄糖桿菌發酵液離心收集菌體，並用磷酸緩衝液洗滌菌體後，採用適量的甘氨酸+Triton X-100對細胞進行透性化處理，使得細胞內的蛋白質釋放出來，然後測定右旋糖酐糊精酶轉化對硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(NPG)生成對硝基苯酚(p-nitrophenol)的酶活。本發明方法操作簡便、重複性和平行性好，可用於對氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)胞內右旋糖酐糊精酶的快速提取和活性檢測。
文檔編號C12N9/00GK101928698SQ200910148259
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月19日 優先權日2009年6月19日
發明者毛相朝, 王華磊, 王舒, 邢豔瓏, 魏東芝 申請人:青島生物能源與過程研究所