一種從生物樣本中快速提取核酸的方法
2023-07-22 12:37:06 1
專利名稱：一種從生物樣本中快速提取核酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種從生物樣本中快速提取核酸的方法。
背景技術：
DNA分子是分子生物學研究的基本材料，依不同的實驗目的可採取不同的抽提方法獲取數量和質量不等的DNA。目前抽提DNA的方法一般有以下幾種(I)陰離子去汙劑法用SDS或二甲苯酸鈉等去汙劑使蛋白質變性，可以直接從生物材料中提取DNA。細胞中DNA與蛋白質之間常借靜電引力或配位鍵結合，由於陰離子去汙劑能夠破壞這種價鍵，所以常用陰離子去汙劑提取DNA，但陰離子去汙劑常常影響後續的PCR反應。
(2)水抽提法利用核酸溶解於水的性質，將組織細胞破碎後，用低鹽溶液除去RNA，然後將沉澱溶於水中，使DNA充分溶解於水中，離心後收集上清液。在上清中加入固體氯化鈉調節至2. 6M。加入2倍體積95 %乙醇，立即用攪拌法攪出，然後分別用66 %，80 %和95%乙醇以及丙銅洗滌，最後在空氣中乾燥，既得DNA樣品，此法提取的DNA中蛋白質含量較高，故一般不用。(3)苯酹抽提法苯酹作為蛋白變性劑，同時抑制了 DNase的降解作用。用苯酹處理勻漿液時，由於蛋白與DNA聯結鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶於酚相，而DNA溶於水相。離心分層後取出水層，多次重複操作，再合併含DNA的水相，利用核酸不溶於醇的性質，用乙醇沉澱DNA。此時DNA是十分粘稠的物質，可用玻璃漫漫繞成一團，取出。此法的特點是使提取的DNA保持天然狀態。苯酚抽提法是抽提DNA最常規的方法，但是因為要使用苯酚，對實驗者有害，因此目前也有利用吸附過柱的方法提取DNA的商業化試劑盒。因為需要蛋白酶K處理過程，一般需要經過3-4小時的抽提過程，才能進入後續的PCR反應。醫院病理科存在大量各種疾病甲醒固定石臘包埋組織(formalin fixed andparaffin embedded tissues, FFPET),為分子病理研究提供了大量的信息來源,近年來的靶向治療使從石蠟包埋組織中抽提DNA成為研究的熱點。然而福馬林固定後的蠟塊包埋組織DNA降解嚴重，存檔FFPET組織切片取量有限，傳統酚氯仿提取DNA步驟繁雜，提取過程損失嚴重等都制約了石蠟組織在分子病理學中的研究應用，如何高效、高質量提取微量石蠟組織中DNA對利用石蠟組織進行分子研究及診斷至關重要。傳統從石蠟組織裡抽提DNA需要先用二甲苯脫蠟，然後用無水乙醇去除二甲苯，脫蠟過程繁瑣，至少需要3 4小時，而且二甲苯是有機溶劑，對實驗操作者的身體有害。脫完蠟後，標本也需要再經過3 4小時的抽提，才能進入後續的PCR反應。Chelex-100是一種由苯乙烯和苯二乙烯共聚體組成的螫合樹脂，其懸液在鹼性環境(pHIO 11)和100°C條件下，可導致細胞膜破裂並使DNA變性釋放出來，並且Chelex-100可高選擇性的結合多價陽離子，去除樣品和緩衝液中的多價金屬離子，避免煮沸過程中模板DNA的降解。Chelex-100提取DNA具有經濟、簡便、高效等優點，目前已被用於從全血或血液、精液或精斑、混合斑、毛髮、培養細胞等提取DNA。但一般也需要經過2 3小時的抽提過程，才能進入後續的PCR反應。目前已經有採用Chelex-100提取石蠟切片中的遺傳物質的報導，如在2010年海南醫學學院學報上發表的文章「四種微量石蠟組織DNA提取方法的比較」 一文中，就採用了Chelex-100提取石蠟切片中的DNA，但在該文獻中，在採用Chelex-100提取前，還是採用了二甲苯脫蠟、乙醇洗滌的步驟，從而使得步驟繁瑣，操作不夠簡單快捷。為此，發明人提出了一種簡單快捷、效果良好的從生物樣本中提取DNA的方法。但目前尚沒有採用Chelex-100提取RNA的報導，為此，發明人提出了一種採用Chelex-100簡單快速、效果良好的從生物樣本中提取RNA的方法。
發明內容
本發明的發明目的在於提出一種核酸的快速提取方法。 為了實現本發明的發明目的，所採用的技術方案為本發明涉及一種從生物樣本中快速提取DNA的方法，所述的方法包括以下步驟I.取少量生物樣本，所述生物樣本選自病理組織石蠟切片樣本、血斑精斑或精液樣本、組織液樣本、腦脊液樣本、血液樣本、血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、積液樣本、組織細胞樣本；2.將生物樣本置於chelex-100的水溶液中，所述的chelex-100的水溶液的濃度為 I 80g/100ml ；3. 80 100°C條件下加熱I 50分鐘；4.將抽提柱放入離心管中，將步驟3中獲得的液體加入到抽提柱中，1000 20000轉/分鐘，離心2 120秒；5.收集離下的液體，用於PCR反應。本發明還涉及一種從生物樣本中快速提取RNA的方法，其特徵在於，所述的方法包括以下步驟I.取少量生物樣本，所述生物樣本選自病理組織石蠟切片樣本、血斑精斑或精液樣本、組織液樣本、腦脊液樣本、血液樣本、血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、積液樣本、毛髮樣本、組織細胞樣本；2.置於 I 80% chelex-100 的 DEPC 水溶液中；3. 80 100°C條件下加熱I 50分鐘；4.將抽提柱管放入離心管中，將步驟(3)中獲得的液體加入到抽提柱管中，1000 20000轉/分鐘，離心2 120秒；5.收集離下的液體，用於RT-PCR反應。其中，本發明的第一優選技術方案為，所述的方法抽提柱為，在抽提柱底部有一層起物理阻擋的膜。本發明的第二優選技術方案為，所述的chelex-100的水溶液的濃度為2 50g/100ml，更優選 3 10g/100ml。本發明的第三優選技術方案為，所述的chelex-100的EDPC水溶液的濃度為2 50g/100ml，優選 3 10g/100ml。
本發明的第四優選技術方案為，所述的加熱溫度為90 100°C，優選90 95°C。本發明的第五優選技術方案為，所述的加熱時間為5 30分鐘,優選8 10分鐘。本發明的第六優選技術方案為，所述的離心的時間為2 120秒，優選10 30秒。本發明的第七優選技術方案為，所述的離心的轉速為5000 20000轉/分鐘，優選10000 20000轉/分鐘，更優選15000 20000轉/分鐘。其中，本發明中的生物樣本選自病理組織石蠟切片樣本、血斑精斑或精液樣本、組織液樣本、腦脊液樣本、血液樣本、血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、積液樣本、毛髮樣本、組織細胞樣本；當生物樣本為組織細胞樣本或石蠟切片時，在步驟I中採用研磨棒對生物組織進行研磨，當提取RNA時，則需要在冰上進行研磨，以減少RNA降解，提高生物組織中RNA的釋放，提聞檢驗效率。本發明的技術優勢為 I.本發明方法簡單，時間短，且不使用有害有機溶劑。傳統方法中一般從石蠟包埋組織中抽提DNA需要先用二甲苯脫蠟，然後用無水乙醇去除二甲苯，所用的時間長，過程繁瑣，至少需要3 4小時才能完成，而且二甲苯是有機溶劑，對人體有害。脫完蠟後，標本需要再經過蛋白酶K的處理，以去除蛋白質，這個過程也需要3 4小時，故通常方法抽提石蠟包埋組織中DNA，進入後續PCR反應，需要6 8小時以上。本發明的方法簡便易行，不使用揮發性有害有機溶劑二甲苯，不會對實驗人員造成傷害，並且所需時間大為縮短，僅需10餘分鐘即可完成；2.本發明採用高溫加熱進行提取，不僅使石蠟變成液態，而且使組織中的蛋白質變性，DNA或RNA被釋放出來，省去了需要蛋白酶K水解需要3 4個小時的過程；3.通常液態石蠟和chelex-100都會對PCR或RT-PCR反應造成不良影響，通過本發明，可將液態石蠟和chelex-100截留在抽提柱的膜上，從而消除了液態石蠟和chelex-100對PCR或RT-PCR反應的不良影響，提高了 PCR或RT-PCR反應的靈敏度；4.目前尚沒有採用Chelex-100提取RNA的報導，發明人在本發明中提出了一種採用Chelex-100簡單快速、效果良好的從生物樣本中提取RNA的方法。
圖I為實施例I中採用兩種方法抽提的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M代表分子量標記，I代表的是用試劑盒抽提的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，2代表的是用本發明的方法抽提的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖。下面對本發明的具體實施方式
做進一步的解釋和說明，但並不對本發明的內容構成限制。本發明所用的試劑均為市售試劑，所用的實驗儀器均為實驗室常用儀器。
具體實施例方式實施例II.用兩種方法提取石蠟包埋組織切片中的DNA，每種方法抽提3個標本，平行比較。I)用北京百泰克生物技術有限公司生產的石蠟組織切片DNA提取試劑盒抽提石蠟包埋組織切片中的DNA
a.取2片5um的醫用石蠟(型號型號BX12M311398，北京中西遠大科技有限公司生產)包埋組織切片放入I. 5mL的離心管中。b.加入Iml 二甲苯，震蕩混勻，55°C水浴10分鐘。13000轉5分鐘，吸棄上清。c.重複第2步一到三次。d.加Iml無水乙醇，震蕩混勻。13000轉5分鐘，吸棄上清。
e.重複第4步一次。f.將沉降下來的標本烘乾。g.加入 200 μ I Buffer I,混勻。h.加入25μ1 Proteinase K，震蕩混勻。55°C水浴消化過夜。i. 13000轉離心5分鐘，上清轉移到一乾淨的I. 5mL離心管中。j.加入220 μ I Buffer 2，震蕩混勻。70°C水浴10分鐘k.加入220 μ I無水乙醇，混勻。I.將抽提柱放入收集管中，移入第5步的混合液體，室溫靜置3分鐘。m. 13000轉離心2分鐘，把液體重新轉入柱子，重新過柱。η. 13000轉離心2分鐘，棄液體。ο.把柱子移入新的收集管內，加入500 μ I Buffer 3。p.把柱子移入新的收集管內，13000轉離心I分鐘，棄液體。加入600 μ I WashBuffer。(Wash Buffer按包裝預加適量無水乙醇)q. 13000 轉離心 I 分鐘，棄液體。加入 600 μ I DNA Wash Buffer。r. 13000轉離心I分鐘，棄液體。13000轉離心2分鐘，開蓋揮發4-5分鐘。s.、把柱子移入I. 5mL的帶蓋離心管中，在膜中央加入40 μ I Elution Buffer (須70°C預熱)。室溫靜置3分鐘。t. 13000轉離心I分鐘，收集液體，取5ul用於PCR反應。2)本發明的方法抽提石蠟包埋組織切片中的DNAa.取2片5um的醫用石蠟(型號型號BX12M311398，北京中西遠大科技有限公司生產)包埋組織切片；b.置於200ul的溶液I中，所述的溶液為10% chelex-100 (sigma公司)的水溶液；c. 90 0C條件下加熱20分鐘；d.將抽提柱放入離心管中，將步驟3中獲得的液體加入到抽提柱裡，12000轉/分鐘離心30秒；所述的抽提柱為e.收集離下的液體，取5ul用於PCR反應。2. DN A鑑定方法2. I DNA質量的瓊脂糖凝膠電泳鑑定因為石蠟切片中的DNA含量較低，用普通瓊脂糖凝膠電泳方法不能檢測到DNA的量，因此將用每種方法抽提的三個標本基因組DNA，各取20 μ L混合，真空抽去部分水分後，力口 5 μ L的DNA loading buffer混勻上樣,在2%的瓊脂糖凝膠中80V電泳30min,在紫外凝膠成像儀下觀察所提取DNA基因組的質量並拍照存檔。圖I為兩種方法抽提的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M代表分子量標記，I代表的是用試劑盒抽提的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，2代表的是用本發明的方法抽提的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖。2. 2螢光定量PCR檢測所提取DNA基因組的濃度選擇針對人β -2actin基因組DNA的引物和TaqMan突光探針，採用PrimerExpress軟體自行設計，由上海生物工程公司(Sangong)合成。引物序列見表I。表I :引物和探針的序列表
權利要求
1.一種從生物樣本中快速提取DNA的方法，其特徵在於，所述的方法包括以下步驟 (1)取少量生物樣本，所述生物樣本選自病理組織石蠟切片樣本、血斑精斑或精液樣本、組織液樣本、腦脊液樣本、血液樣本、血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、積液樣本、毛髮樣本、組織細胞樣本； (2)將生物樣本置於chelex-100的水溶液中，所述的chelex_100的水溶液的濃度為I 80g/100ml ； (3)80 100°C條件下加熱I 50分鐘； (4)將抽提柱放入離心管中，將步驟(3)中獲得的液體加入到抽提柱中，1000 20000轉/分鐘，離心2 120秒； (5)收集離下的液體，用於PCR反應。
2.一種從生物樣本中快速提取RNA的方法，其特徵在於，所述的方法包括以下步驟 (1)取少量生物樣本，所述生物樣本選自病理組織石蠟切片樣本、血斑精斑或精液樣本、組織液樣本、腦脊液樣本、血液樣本、血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、積液樣本、毛髮樣本、組織細胞樣本； (2)置於I 80%chelex-100的DEPC水溶液中； (3)80 100°C條件下加熱I 50分鐘； (4)將抽提柱管放入離心管中，將步驟(3)中獲得的液體加入到抽提柱管中，1000 20000轉/分鐘，離心2 120秒； (5)收集離下的液體，用於RT-PCR反應。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於，所述的抽提柱為，在抽提柱底部有一層起物理阻擋的膜。
4.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於，所述的chelex-100的水溶液的濃度為2 50g/100ml，優選3 10g/100ml ;所述的chelex-100的DEPC水溶液的濃度為2 .50g/100ml，優選 3 10g/100ml。
a)根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於，所述的加熱溫度為90 100°C，優選.90 95°C。
b)根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於，所述的加熱時間為5 30分鐘，優選.8 10分鐘。
c)根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於，所述的離心的時間為2 120秒，優選10 30秒。
d)根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於，所述的離心的轉速為5000 20000轉/分鐘，優選10000 20000轉/分鐘，更優選15000 20000轉/分鐘。
全文摘要
本發明涉及一種從生物樣本中快速提取核酸的方法。該方法為取生物樣本，置於chelex-100的水溶液或chelex-100的DEPC水溶液中，在80～100℃加熱1～50分鐘；將抽提柱放入離心管，將上述液體加入到抽提柱中，1000～20000轉/分鐘離心2～120秒；取離心後的液體用於PCR或RT-PCR反應。本發明採用chelex-100與高溫加熱的方法進行提取，省去了蛋白酶水解的步驟，對石蠟切片省去了脫蠟的步驟，消除了有機溶劑二甲苯，時間大為縮短；通過在抽提柱放置截留膜，去除了液態石蠟和chelex-100對PCR或RT-PCR反應的不良影響，提高了PCR或RT-PCR反應的靈敏度。
文檔編號C12N15/10GK102807975SQ20111014324
公開日2012年12月5日 申請日期2011年5月30日 優先權日2011年5月30日
發明者熊慧, 謝立群, 陳嘉錚 申請人:熊慧