用作抗原掩蔽劑的人乳鐵蛋白衍生肽的製作方法
2023-07-21 22:19:01 2
用作抗原掩蔽劑的人乳鐵蛋白衍生肽的製作方法
【專利摘要】本發明涉及在哺乳動物生物體中遞送生物活性物質的藥物組合物的生嚴中用作抗原掩蔽劑的人乳鐵蛋白衍生肽，其中所述生物活性物質能夠誘導所述哺乳動物生物體產生不期望的免疫應答，其中所述藥物組合物包含所述生物活性物質和所述人乳鐵蛋白衍生肽的超分子聚集體，具有在所述藥物組合物遞送至所述哺乳動物生物體後不誘導或僅減弱誘導對所述生物活性物質的不期望的免疫應答的作用。
【專利說明】用作抗原掩蔽劑的人乳鐵蛋白衍生肽
【背景技術】
[0001]關於免疫球蛋白G的一般知識:免疫球蛋白G(IgG)是抗體分子。IgG是最豐富的免疫球蛋白並且近似均勻地分布在血液和組織液中，構成哺乳動物和人類中血清免疫球蛋白的主要部分。IgG分子由血漿B細胞合成和分泌。
[0002]IgG抗體主要涉及次級免疫應答。特異性IgG的存在通常對應於抗體應答的成熟。IgG是唯一能夠穿過人胎盤的抗體同種型，從而為子宮中的胎兒提供保護。在嬰兒自身免疫系統建立前，通過胎盤吸收的殘留的IgG與母乳中分泌的IgA —起為新生兒提供體液免疫。
[0003]IgG可以結合多種病原體，例如病毒、細菌和真菌，並且通過凝集和固定、補體激活(經典途徑)、吞噬調理作用和/或其毒素的中和作用對抗這些病原體保護機體。它在抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)中也起著重要的作用。
[0004]哺乳動物IgG產生的免疫應答與其它免疫應答以及免疫應答級聯和信號傳導通路密切聯繫。因此，半抗原或免疫原刺激物和受體以及受體家族在哺乳動物個體中分別以已知或未知的途徑相互聯繫和相互調節。
[0005]這也是為什麼任何作為治療劑導入的生物活性劑即使在按照個體劑量施用後仍然可以引發期望的和不期望的免疫反應。
[0006]WO 2007/048599描述了基於聚合物載體的顆粒藥物遞送系統，其特徵在於包括至少一種用於穿過生物屏障運輸的信號物質和至少一種活性成分，其中載體、信號物質和活性成分之間顯示為非共價連接。信號物質是乳鐵蛋白或乳鐵蛋白的衍生肽。
[0007]在特別優選的實施方式中，信號肽選自具有如下胺基酸序列的肽或其衍生物:
[0008]KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR (TO 2007/048599 中 SEQ ID N0.3)，
[0009]CFQffQRNMRKVRGPPVSC(TO 2007/048599 中 SEQ ID N0.4)，
[0010]FQffQRNMRKVRGPPVS(TO 2007/048599 中 SEQ ID N0.5)，
[0011]FQffQRNMRKVR(TO 2007/048599 中 SEQ ID N0.6)，
[0012]KCRRffQffRMKKLGAPSITCVRR (TO 2007/048599 中 SEQ ID N0.29)和
[0013]CRRffQffRMKKLGAPSITC (W0 2007/048599 中 SEQ ID N0.30)。
[0014]在優選的實施方式中，WO 2007/048599的細胞穿透肽包括WO 2007/048599中的SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.29或SEQ ID N0.30中顯示的胺基酸序列或同源性至少為40%、優選至少為50%、更優選為75%以上或更佳的為90%以上的相關序列。
[0015]WO 2007/076904A1描述了具有包含人乳鐵蛋白或牛乳鐵蛋白的至少8個連續胺基酸的胺基酸序列的肽，其中所述肽適宜作為細胞穿透肽。在WO 2007/076904A1和WO2007/048599中提及的許多肽是相同的。
[0016]在WO 2007/076904A1的實施例中具有最佳效果的、最具前景的細胞穿透肽是 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR (WO 2007/076904A1 中的 SEQ ID N0.3，本申請中的 SEQ IDN0.1)。
[0017]乳鐵蛋白衍生的細胞穿透肽旨在允許運送貨物分子，這些分子是活性藥物成分如DNA、RNA、肽或用於疫苗接種的抗原，其可以經口攝取，由於能穿過生物膜因此人或動物生物體可以有效地吸收這些分子。
[0018]問題和解決方法
[0019]當為了治療疾病而給哺乳動物生物體施用的生物活性物質誘導了不期望的免疫應答時,在同樣的生物活性物質此後必須再次施用於該生物體時,這種免疫應答可能會成為嚴重的問題。[0020]本發明的目的是尋找可以在哺乳動物生物體中遞送生物活性物質的藥物組合物的生產中用作佐劑或賦形劑的抗原掩蔽劑，其中所述生物活性物質能夠誘導哺乳動物生物體產生不期望的免疫應答，抗原掩蔽劑具有在遞送藥物組合物至哺乳動物生物體後不誘導或僅減弱誘導對該生物活性物質的不期望的免疫應答的作用。
[0021 ] 所述問題通過在哺乳動物生物體中遞送生物活性物質的藥物組合物的生產中弓丨入用作抗原掩蔽劑的人乳鐵蛋白衍生肽得以解決，其中所述生物活性物質能夠誘導哺乳動物生物體產生不期望的免疫應答，其中藥物組合物包括生物活性物質和人乳鐵蛋白衍生肽的超分子聚集體，具有在遞送藥物組合物至哺乳動物生物體後不誘導或僅減弱誘導針對該生物活性物質的不期望的免疫應答的作用。
[0022]發明詳述
[0023]本發明涉及在哺乳動物生物體中遞送生物活性物質的藥物組合物的生產中用作抗原掩蔽劑的人乳鐵蛋白衍生肽，其中單獨的生物活性物質能夠誘導哺乳動物生物體產生不期望的免疫應答，其中藥物組合物包括生物活性物質和人乳鐵蛋白衍生肽的綴合物，具有在遞送藥物組合物至哺乳動物生物體後不誘導或僅減弱誘導針對該生物活性物質的不期望的免疫應答的作用。
[0024]由於人乳鐵蛋白衍生肽來自人乳鐵蛋白，因此它對於人的免疫系統沒有免疫原性。令人驚訝地，雖然序列在遺傳上不保守，但人乳鐵蛋白衍生肽對於哺乳動物，優選對於生產動物或家畜，例如在藥物研發中用作模式物種的豬、羊、牛或狗的免疫系統沒有或僅有低程度的免疫原性。因此，本發明的優勢在於不限於應用於人，同樣適用於獸醫應用和使用動物模型的人類治療的發展。
[0025]人乳鐵蛋白衍生肽
[0026]人乳鐵蛋白衍生肽可以具有19至30個胺基酸的長度。
[0027]人乳鐵蛋白衍生肽可以具有19至30個胺基酸的長度並且可以包含根據SEQ.1D.N0.1KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR的胺基酸序列或與SEQ.1D.N0.1的序列具有至少90、95或98%同源性的序列。
[0028]人乳鐵蛋白衍生肽優選是具有SEQ.1D.N0.1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR的胺基酸序列或與該序列具有至少90、95或98%同源性的序列的肽。
[0029]最優選的人乳鐵蛋白衍生肽是與SEQ.1D.N0.1序列具有至少90、95或98%同源性並且其中存在位置2和19處的半胱氨酸殘基。優選的半胱氨酸殘基以氧化的形式存在，形成內部的Cys-Cys橋。
[0030]可以包括用於肽GMP合成中的任何額外的標準化學修飾，如N-乙醯化、醯化、甲基化、苯甲基化、C-醯胺化、酯化、C末端bulkesters、等排的胺基酸修飾和非天然胺基酸如苯硫基-丙氨酸或環脯氨酸-丙氨酸或其它任意的具醯胺基_、酯基-或醚骨幹的胺基酸取代。[0031]然而優選的是，除了形成內部的Cys-Cys橋外，人乳鐵蛋白衍生肽將不顯示其他額外的化學修飾。
[0032]能誘導哺乳動物生物體產生不期望的免疫應答的生物活性物質
[0033]能夠誘導哺乳動物生物體產生不期望的免疫應答的生物活性物質通常包括或包含在藥物製劑或藥物製備物中。
[0034]用於誘導哺乳動物生物體產生期望的免疫應答的生物活性物質，例如大多數疫苗，不在定義的「不期望的免疫應答」的範圍中。
[0035]能夠誘導哺乳動物生物體產生不期望的免疫應答的生物活性物質可以優選地選自生物活性蛋白或生物活性肽、抗血清、多克隆抗體或單克隆抗體。也可以是提供其它「可溶受體」或「可溶受體結合物」的重組蛋白，或修飾的重組蛋白如聚乙二醇(PEG)化實體以及具有免疫原性風險作為不期望副作用的治療劑，包括風險已知或潛在相關的如抗生素、肽藥物和肽類似物的小分子。
[0036]能夠誘導不期望的IgG免疫應答的生物活性物質可以包含在輸送至哺乳動物生物體的血液樣品中。
[0037]能夠誘導不期望的IgG免疫應答的生物活性物質可以包含在移植至哺乳動物生物體的器官中或表面。
[0038]不期望的免 疫應答 [0039]哺乳動物生物體產生的不期望的免疫應答是免疫系統通過產生針對生物活性物質的抗體的應答，所述生物活性物質被遞送到哺乳動物生物體以產生期望的有益的治療效果，該治療效果與免疫應答不同或者免疫應答是不希望出現的副作用。
[0040]不期望的免疫應答可以是(主要地)IgG免疫應答。
[0041]不期望的免疫應答可以是(主要地)IgE免疫應答。
[0042]即使在第一次施用包含或含有能夠誘導不期望的免疫應答的生物活性物質的藥物製劑或藥物製備物時，不期望的免疫應答沒有導致不期望的副作用，但當包含或含有能夠誘導不期望(IgG或IgE)的免疫應答的生物活性物質的藥物製備物被或必須第二次或再一次或幾次或一段時間施用，不期望的免疫應答可以引發不期望的副作用。例如，在這種情況下血漿中存在的IgG水平可能使生物活性物質部分或完全失活並且降低期望的治療效果。在有些情況下，生物活性物質的部分或完全失活也可能與發炎、發熱或其它不期望的副作用關聯發生。這些副作用可以由IgG抗體與生物活性物質的聚集或沉澱的存在而非特異性誘導。
[0043]能夠誘導哺乳動物生物體產生不期望的IgG免疫應答的生物活性物質的典型實例是如:針對有毒動物的毒液的抗-毒液-抗血清。例如蛇、昆蟲、蜘蛛或某些水母種類，其中抗血清由動物，通常是馬產生，其中抗血清用於治療接觸了毒液的人。在第一次施用抗血清後，人個體通常針對馬的蛋白，主要是抗血清中馬IgG抗體，產生不期望的、以IgG免疫應答為主的應答反應。
[0044]眾所周知的例子是馬產生的特異性抗蛇毒的抗血清，其遞送至被被某種蛇物種咬傷的人以治療蛇毒的嚴重作用。在第一次施用抗蛇毒抗血清後，由於毒素的失活可以治療個體，但可能針對包含在血清中的馬蛋白，主要是馬Ig抗體，產生不期望的IgG免疫應答。當此人後來被同一條或另一條蛇咬傷時，再次使用馬抗蛇毒抗血清治療可能是危險的，因為針對抗馬的血清蛋白的IgG抗體以一定水平存在。
[0045]已知的還有使用抗淋巴細胞/抗胸腺-淋巴細胞球蛋白對人低風險的骨髓增生異常症候群的免疫調節治療。在這些治療方法中，由兔或馬產生的直接針對人免疫原性細胞的抗體球蛋白在一定的時期內施用於患者。在這種情況下，同樣存在針對包含在球蛋白組分中的兔蛋白或馬蛋白主要是馬IgG抗體的不期望的IgG免疫應答的危險。這種不期望的IgG免疫應答可能對當前或重複治療產生負面影響。
[0046]進一步眾所周知的是包含或含有針對腫瘤細胞的表位的單克隆抗體的藥物製備物的應用。
[0047]對本發明意義上不期望的IgG免疫應答的抑制可能有益的其他情況可以是輸血領域，其中輸送的血液和患者免疫系統間的不相容可能以不期望的IgG免疫應答方式發生。
[0048]對本發明意義上不期望的IgG免疫應答的抑制可能有益的另一種情況可以是器官移植領域，其中移植的器官(可能是腎、肝、肺或心等等)與患者免疫系統間的不相容可能以不期望的IgG免疫應答方式發生並且可以至少部分促進排斥或排異反應。
[0049]能夠誘導哺乳動物不期望的IgG免疫應答的生物活性物質可以包括藥物的或生物的活性蛋白質或肽，特別是對於所施用的哺乳動物生物體而言是非天然的蛋白質或肽。
[0050]非天然可以指，生物活性蛋白質或肽是來自相對於其所遞送的物種而言的其它物種，優選來自其它哺乳動物物種，或來自相同物種或半合成來源。
[0051]非天然可以指，生物活性蛋白質或肽是以一種使得其所遞送的哺乳動物生物體的IgG免疫應答系統檢測到的方式修飾。
[0052]優選的，該能夠誘導不期望的IgG免疫應答的生物活性物質所遞送的哺乳動物是智人。
[0053]例如源自某一哺乳動物生物體的蛋白質，當它由重組微生物產生時，成為可以被該哺乳動物的IgG免疫應答系統檢測到。
[0054]例如源自真核來源生物體的糖基化的蛋白質，其在重組原核生物體中產生時通常缺乏糖基化。因此，當重組蛋白以藥物製備物的形式遞送回其來源生物體時，成為可以被該來源哺乳動物生物體的IgG免疫應答檢測到。
[0055]眾所周知的與不期望的IgE免疫應答相聯繫的副反應例如過敏、過敏性反應或甚至如過敏性休克。
[0056]能夠誘導哺乳動物生物體產生不期望的IgG或IgE免疫應答的生物活性物質可包括製備物，其包含或由如下組成:抗血清或多克隆或單克隆抗體或提供其它「可溶性受體」或「可溶性受體結合物」的重組蛋白或修飾的重組蛋白如聚乙二醇(PEG-)化的、截短的、或遺傳修飾的實體，以及因不期望的或嚴重的或致死的副作用如過敏反應和過敏性休克，而具有免疫原性風險的治療劑，包括像抗生素、麻醉劑這些風險已知的小分子，以及任何潛在相關的免疫原性生物活性成分，包括肽-藥物和肽類似物、生長或壞死因子、或混合物如體液部分，如來自人血液或細胞培養物的血液因子。
[0057] 此外，可將人乳鐵蛋白片段的免疫調節作用用於抗原掩蔽中以調控在過敏領域潛在的免疫應答誘導劑。例如，入乳鐵蛋白片段和花粉、草花粉、牛奶蛋白、蜂毒肽(mellitine)、雞蛋蛋白質等的聯合可以調控機體對這些抗原決定簇或抗原的過敏反應。[0058]藥物組合物
[0059]可將人乳鐵蛋白衍生肽用作向哺乳動物有機體遞送生物活性物質的藥物組合物的生產中的抗原掩蔽劑。
[0060]藥物組合物可以是藥物製劑或優選地多顆粒藥物製劑，優選地選自顆粒、微粒、微片、片劑或膠囊或其它藥物製劑。藥物組合物可以還包括獸用藥物組合物。
[0061]含有人乳鐵蛋白衍生肽和生物活性物質的藥物組合物可包括其它賦形劑，其是本領域技術人員已知的用於藥物製劑的配製。典型的賦形劑是抗氧化劑、增白劑、結合劑、稀釋齊?、填充劑、調味劑、流動助劑、芳香劑、助流劑、滲透促進劑、染料、增塑劑、聚合物、成孔劑、溶劑或穩定劑。
[0062]藥物組合物可以包含、可以基本上包含或可以含有多至80、多至50、多至25、多至10%重量的或任意的藥用賦形劑，如本領域技術人員已知的用於藥物劑型配方的其他賦形劑。
[0063]超分子聚集體
[0064]最優選的，人乳鐵蛋白衍生肽和生物活性物質形成超分子聚集體，其也可以被稱作複合體或綴合物，其中人乳鐵蛋白衍生肽和生物活性物質彼此非共價連接。在這種情況下，超分子聚集體通過如離子力或範德華力保持在一起。
[0065]這些超分子聚集體可以通過在人乳鐵蛋白衍生肽的水溶液或處理介質溶液或懸浮液中添加生物活性化合物 有利地製備。溶液被溫和地混合一段短的時間，優選多至2分鐘，或溫育多至I小時、多至2小時或更長時間。
[0066]除了人乳鐵蛋白衍生肽和生物活性物質，超分子聚集體可另外包括或含有載體，例如載體聚合物，如樹枝狀聚合物。
[0067]可行但不優選的方案是人乳鐵蛋白衍生肽和生物活性物質形成超分子聚集體，其中人乳鐵蛋白衍生肽和生物活性物質彼此共價連接。在這種情況下，可以通過人乳鐵蛋白衍生肽的反應基團和生物活性物質的反應基團間的化學反應形成超分子聚集體。也可以使用其它額外的化學反應連接分子連接分子。
[0068]優選地，超分子聚集體可以包含，可以基本上包含或可以含有至少20%、至少50 %重量的、至少80 %、至少90 %重量的或100 %的人乳鐵蛋白衍生肽和生物活性物質。超分子聚集體可以是藥物組合物的一部分，藥物組合物包含其它賦形劑。
[0069]優選地，藥物組合物可以包含，可以基本上包含或可以含有至少20、至少50、至少75、至少90%重量的或100%的超分子聚集體。
[0070]製備藥物組合物的方法
[0071]本發明也涉及製備如本文定義的藥物組合物的方法，通過在天然條件下混合人乳鐵蛋白衍生肽和生物活性劑，孵育混合物以允許超分子聚集體的(共價的或非共價的)形成並且添加該混合物至藥物組合物。
[0072]在最簡單的實施方式中，藥物組合物與所述混合物可以是相同的，意味著最終的藥物組合物實質上僅含有人乳鐵蛋白衍生肽和生物活性劑。然而在許多情況下，添加其它藥用賦形劑可能利於或適於形成(最終)藥物組合物。
[0073]天然條件意味著在該條件下可以維持人乳鐵蛋白衍生肽和生物活性劑的生物活性。天然條件可以是例如在緩衝水溶液中，如pH 7.4的磷酸鹽緩衝液，或在生理氯化鈉溶液中混合人乳鐵蛋白衍生肽和生物活性劑。
[0074]孵育混合物以允許超分子聚集體形成是指給予人乳鐵蛋白衍生肽和生物活性劑聚集的充足時間。通常在室溫下混和並孵育多至2分鐘就足夠了。然而孵育多至1小時、多至2小時或更長的時間可能也是適合的。形成超分子聚集體的適宜溫度可以在O至37°C的範圍，優選4至30°C，適宜的室溫環境為18至28°C。
實施例
[0075]實施例1:人乳鐵蛋白片段(hLf)與細菌裂解物的非共價連接
[0076]材料:
[0077]來自大腸桿菌(Escherichia coli)的細菌裂解物、人乳鐵蛋白片段SEQ.1D.N0.1KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR, pH = 7.4 的磷酸鹽緩衝液(Ph.Eur.):將 5.97g 二水合磷酸氫二鈉(相當於4.76g磷酸氫二鈉)、0.38g磷酸二氫鉀和16g氯化鈉溶解在1.81去離子水中。然後將製備的澄清溶液放入21的容量瓶中，用去離子水補充至刻度線，隨後均質化。然後，用3ml的IN HCl在23.2 °C調節pH至7.43，在將溶液裝入PE瓶。
[0078]裝置:
[0079]Malvern Zetasizer Nano ZS90 ;規格參數:
[0080]材料:蛋白質RI:1.45 吸收值:0.00，分散劑:水 25°C:0.8872cP R1:1.330 ；37°C:0.6864cP R1:1.330，樣品池:DTS 1060C:清潔的一次性zeta樣品池
[0081]測量:自動運行3次，定位方法:尋找最佳位置，自動關注選擇，分析模型:一般用途
[0082]Zeta 參數:介電常數:25 °C 時 78.5 和 37 °C 時 74.4
[0083]模型:SmoluchowskiF(KA)值:1.5,測量:自動運行 3 次
[0084]自動關注選擇
[0085]樣品製備
[0086]肽氧化:將肽溶解在pH7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS) (Ph.Eur.)中至濃度低於1mM(2.75mg/mL),如5mg溶於IOmL緩衝液中(=0.5mg/mL)。溶液在37°C用純氧淨化5分鐘。37°C孵育2小時。
[0087]對於細菌裂解物，將ImL細菌裂解物用ρΗ7.4的PBS (Ph.Eur.)稀釋至10mL。
[0088]通過向ImL的細菌裂解物(=1.2mg大腸桿菌)中添加0.097714286mg的hLF將
其連接至裂解物顆粒。
[0089]將20 μ L的0.5mg/mL的肽溶液加到ImL預先稀釋的疫苗(0.12mg/mL)中，並且在100-150rpm的低速攪拌下於4°C孵育2小時，避免任何泡沫產生。
[0090]
【權利要求】
1.在哺乳動物生物體中遞送生物活性物質的藥物組合物的生產中用作抗原掩蔽劑的人乳鐵蛋白衍生肽，其中所述生物活性物質能夠誘導所述哺乳動物生物體產生不期望的免疫應答，其中所述藥物組合物包含所述生物活性物質和所述人乳鐵蛋白衍生肽的超分子聚集體，具有在所述藥物組合物遞送至所述哺乳動物生物體後不誘導或僅減弱誘導對所述生物活性物質的不期望的免疫應答的作用。
2.根據權利要求1所述的人乳鐵蛋白衍生肽，其中所述肽具有根據SEQ.1D.N0.1KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR的胺基酸序列或與該序列至少90%同源性的序列。
3.根據權利要求2所述的人乳鐵蛋白衍生肽，其中所述序列與序列SEQ=IDl具有至少90%同源性並且存在位置2和19處的半胱氨酸殘基。
4.根據權利要求1至3中一個或多個所述的人乳鐵蛋白衍生肽，其中所述不期望的免疫應答是IgG免疫應答。
5.根據權利要求1至3中一個或多個所述的人乳鐵蛋白衍生肽，其中所述不期望的免疫應答是IgE免疫應答。
6.根據權利要求1至5中一個或多個所述的人乳鐵蛋白衍生肽，其中所述能夠誘導所述哺乳動物生物體產生不期望的免疫應答的生物活性物質選自生物活性蛋白或生物活性肽、抗血清或多克隆抗體或單克隆抗體。
7.根據權利要求1至6中一個或多個所述的人乳鐵蛋白衍生肽，其中所述能夠誘導不期望的免疫應答的生物活性物質包含在輸送所述哺乳動物生物體的血液樣本中。
8.根據權利要求1至7中一個或多個所述的人乳鐵蛋白衍生肽，其中所述能夠誘導不期望的免疫應答的生物活性物質包含在移植至所述哺乳動物生物體的器官中或表面上。
9.根據權利要求1至8中一個或多個所述的人乳鐵蛋白衍生肽，其中所述生物活性物質和所述人乳鐵蛋白衍生肽在所述超分子聚集體中不相互共價連接。
10.根據權利要求1至8中一個或多個所述的人乳鐵蛋白衍生肽，其中所述生物活性物質和所述人乳鐵蛋白衍生肽在所述超分子聚集體中相互共價連接。
11.製備如權利要求1至10中任一項所述的藥物組合物的方法，通過在天然條件下混合所述人乳鐵蛋白衍生肽和所述生物活性試劑，孵育所述混合物以允許超分子聚集體形成並且將所述混合物添加到最終的藥物組合物中。
【文檔編號】C07K14/435GK103906760SQ201080070362
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2010年11月26日 優先權日:2010年11月26日
【發明者】B·哈特維希, J·託姆阿爾卡德, N·溫德哈伯, M·D·P·安蘇阿泰圭潘扎諾, M·J·瓦拉卡雷拉 申請人:贏創羅姆有限公司