一種普通小球藻及其培養方法和應用的製作方法

2023-10-27 06:02:42

專利名稱：一種普通小球藻及其培養方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及藻類技術領域，更具體地，涉及小球藻技術領域，特別是指一種普通小球藻及其培養方法和應用。
背景技術：
能源緊缺，環境汙染和糧食不足是當今三大世界難題。全球氣候變暖歸因於大氣中的主要溫室氣體CO2的增加，與普遍存在的由富營養化物質(如，氮和磷等)以及其它汙染物所導致的水汙染同屬於主要的環境問題之一。微藻對解決上述難題具有非常重要的作用。微藻是一種能進行光合自養的微生物，在生態系統中處於初級生產者，在整個物質循環中作用巨大，生產效率高，發展前景誘人。且微藻富含油脂、蛋白質、碳水化合物、微量元素及其它生物活性物質，因而其不僅可作為餌料，且是食品和生物能源的主要來源之一。微藻具有生長速率快、生產強度高、光利用率高等優點，利用微藻作為生物能源的原材料越來越受到多方面的關注。目前，已有的作為生物能源原料的微藻，主要是(X)2耐受能力較差，生產強度低，且採用高濃度的培養基進行培養，生產成本過高，產業化受阻。因此，需要提供一種微藻，其(X)2耐受能力強，生產強度高，而且很有必要把汙水處理和生產生物能源與其他副產品(如，蛋白質、化妝品原料及動物飼料等)相結合，降低生產成本，可達到廢物資源的綜合利用，實現節能減排的綠色生產。

發明內容
本發明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種普通小球藻及其培養方法和應用，該普通小球藻CO2耐受能力強，生產強度高，其培養方法把汙水處理和生產生物能源與其他副產品(如，蛋白質、化妝品原料及動物飼料等)相結合，降低生產成本，達到廢物資源的綜合利用，實現節能減排的綠色生產，設計巧妙獨特，適於大規模推廣應用。在本發明的第一方面，提供了一種普通小球藻，其特點是，所述普通小球藻是小球藻 C9-JN2010，保藏編號為=CCTCC NO =M 2010373。所述普通小球藻是從黃海海域的海水中分離並經過人工選育得到的，命名為小球藻C9-JN2010，為綠色、單個球形藻體、壁薄，學名分類為一種普通小球藻(Chlorellavulgaris)，其於2010年12月31日保藏在中國典型培養物保藏中心(China Center forType Culture Collection，簡稱 CCTCC)，菌種保藏登記號為 CCTCC NO :M 2010373。上述普通小球藻的分離與選育方式為取含有小球藻的黃海海水IOOmL,先用濾紙過濾除去大型顆粒物後將濾液放入離心管內，在5000r/min下離心15min。倒淨上清液，加入基礎培養基培養後，振蕩使藻細胞懸浮。再經離心倒去上清夜。按照上述清洗藻細胞步驟重複三次後。取IOmL藻懸浮液於f72培養基中先進行光照培養5d後，取樣IOmL再重新接種於新鮮f/2培養基中進行光照培養。重複光照培養3次後，取ImL培養物進行10—1、10-2、10-3、10-4、10-5、10_6梯度稀釋，取0. 2mL塗布於f/2固體培養基的平板上，其中，瓊脂含量為2%，置於25°C，光照強度為40001UX，光照周期為12h 12h，相對溼度為75%的人工氣候箱中培養，三至四周後，固體平板上長出綠色的單個藻落，隨後挑取單藻落在f/2固體培養基的平板上進行平板劃線分離，反覆5次後，得到純藻種，經鑑定後為普通小球藻。隨後，將以上獲得的普通小球藻再進行選育。取對數期生長的小球藻，分別稀釋10，100，1000和10000倍塗布於f/2固體培養基上，在25°C，光照40001UX，光照周期為12h 12h的條件下培養。7d後挑取深綠色單克隆藻菌落接種於液體培養液中，選用IOOmL三角瓶，內有50mL培養液。共挑取了 120個單克隆藻菌落，在與前相同的條件下培養，每天搖動2次。14d後，去除貼壁嚴重的和顏色發黃的，挑選出50株藻液顏色濃綠、不貼壁的小球藻。將這50株小球藻分別接種於新的液體培養液，2個平行樣，相同培養條件下，轉速為lOOrpm，以原有小球藻種作為對照，每天計算它們的細胞密度。8d後，根據其生長速度和最終生物量，挑選出15株小球藻，生長速度和生物量均大於對照，且藻液濃綠，無貼壁現象。將15株小球藻分別接種於新的液體培養液，換用250mL三角瓶，內裝150mL培養液，設置3個平行樣，培養條件同上。以原有藻種作為對照，每天計算細胞密度。培養14d後，各取IOOmL,在4°C離心並倒去上清，將餘下藻體在冷凍乾燥機中乾燥，冷井溫度為_35°C，乾燥4 後稱重，此後每Ih稱重1次，直至恆重。用氣相色譜測粗油脂，綜合油脂含量和生長速度挑選出紫外誘變的出發株。獲得優良小球藻C9-JN2010藻株。在本發明的第二方面，提供了一種普通小球藻培養方法，其特點是，在光反應器內，以市政汙水和/或工業汙水經汙水處理廠處理後的二級出水為培養基，接種上述的普通小球藻並進行培養，其中，初始接種密度為1. OX IO7CfuAil 6. OX IO7CfuAil，所述培養的條件為光照周期為IOh 14h 16h 8h，光照強度為50001UX 150001UX，培養溫度為20 30°C，pH為6. 5 8. 5，CO2氣體通氣量為0. 01 0. 2VVm,所述(X)2氣體的(X)2濃度為15% 30% (ν/ν) 0培養合適時間後，離心光反應器的培養液，收穫普通小球藻。所述汙水處理廠可以是任何汙水處理廠。較佳地，所述汙水處理廠是無錫市惠聯熱電有限公司的汙水廠。所述(X)2氣體可以是任何來源的(X)2氣體。較佳地，所述(X)2氣體是將工廠排放的廢氣與空氣混合而成。可以直接混合，也可以對廢氣做一定處理(如，除塵、除硫等)後再混合，從而有效利用廢氣，並減少汙染。所述二級出水是汙水處理廠二級處理工藝的二沉池出水，不同汙水處理廠的二級出水中氮磷等含量一般相差不大。一般地，所述二級出水中總氮為30 50. Omg/L，氨氮為10 16. 0mg/L,總磷濃度為 2. 0 4. 0mg/L, pH 為 6. 5 8. 0。培養時間根據需要確定，當處理汙水時，較佳地，培養480h後，所述光反應器內藻細胞濃度達1. OX IO8CfuAil 5. OX IO8CfuAil，且所述光反應器內的所述培養基的水質符合國家A類排放水標準(總氮濃度為15. 0mg/L，氨氮濃度為1. 0mg/L，總磷濃度為0. 5mg/L)。即其中的氮磷等含量符合國家A類排放水標準，實現汙水處理效果。採用本發明的普通小球藻處理汙水時，較佳地，培養至所述光反應器內的所述培養基中總氮濃度低於15. 0mg/L，氨氮濃度小於1. 0mg/L,總磷濃度低於0. 5mg/L。採用本發明的普通小球藻積累油脂時，較佳地，培養至所述光反應器內的所述普通小球藻的油脂含量達25% 40% (W)。在本發明的第三方面，提供了上述的普通小球藻在汙水處理中的應用。例如，以上述的普通小球藻即小球藻C9-JN2010為生物能源的原料，以市政汙水和工業汙水經汙水處理廠處理後的二級出水為培養基，通過小球藻C9-JN2010的深度處理，其中，水中總氮濃度低於15. Omg/L，氨氮濃度小於1. Omg/L，總磷濃度低於0. 5mg/L，汙水中的氮磷含量分別降低了 80. 0% 98. 0% (W)和 80.0% 99. 5% (W)，CO2 濃度降低 30. 0 75. 0% (ν/ν),ρΗ為 7· O 8· O。在本發明的第四方面，提供了上述的普通小球藻在油脂生產中的應用。例如，以小球藻C9-JN2010為生物能源的原料，以市政汙水和工業汙水經汙水處理廠處理後的二級出水為培養基，通過小球藻的生長積累油脂，藻細胞濃度可達1. OX 108CfU/ml 5. OX 108cfu/ml，油脂含量 25 % 40 % (W)。本發明的有益效果在於a.與其它作為生物能源原料的藻種相比較，本發明的普通小球藻主要是(X)2耐受能力強(15% 30% (v/v))，降汙能力強，生產強度高，且可以將市政汙水和工業汙水二級出水為培養基，不需要外加氮磷等營養元素，可以減輕水資源負擔和降低汙水處理及生物能源生產的成本。b.採用本發明的普通小球藻構建的城市汙水深度處理工藝，在進行汙水處理和CO2減排的同時可獲得生物能源，設計獨特巧妙，是一種綠色生產、低成本的汙水再利用與生物能源生產技術，適於大規模推廣應用。c.採用本發明的普通小球藻構建的城市汙水深度處理工藝，能實現氮、磷及0)2高去除效率(如，水中總氮濃度低於15. Omg/L，氨氮濃度小於1. Omg/L,總磷濃度低於0. 5mg/L，汙水中的氮磷含量分別降低了 80. 0%~ 98. 0% (W)和80. 0%~ 99. 5% (W), CO2濃度降低30.0% 75.0% (ν/ν))，並且藻濃度及油脂的含量高(分別為光反應器內的藻濃度達1.0Χ 108cfu/ml 5. 0 X 108cfu/ml，其油脂含量為25 % 40 % (W)),可達到保護環境和生物資源再生產的雙重效果，實現較高的經濟和社會綜合效益，適於大規模推廣應用。


圖1是本發明的普通小球藻的光學顯微鏡形態圖。圖2A是採用本發明的普通小球藻培養方法分割培養小球藻C9-JN2010處理汙水的氮、磷及(X)2去除效果示意圖。圖2B是採用本發明的普通小球藻培養方法分割培養小球藻C9-JN2010處理汙水的生物量及胞內脂肪積累效果示意圖。圖3A是採用本發明的普通小球藻培養方法連續培養小球藻C9-JN2010處理汙水的氮、磷及(X)2去除效果示意圖。圖;3B是採用本發明的普通小球藻培養方法連續培養小球藻C9-JN2010處理汙水的生物量及胞內脂肪積累效果示意圖。圖4A是採用本發明的普通小球藻培養方法分批培養小球藻C9-JN2010處理汙水的氮、磷及(X)2去除效果示意圖。圖4B是採用本發明的普通小球藻培養方法分批培養小球藻C9-JN2010處理汙水的生物量及胞內脂肪積累效果示意圖。
具體實施例方式為了能夠更清楚地理解本發明的技術內容，特舉以下實施例詳細說明。廢水中氮、磷的轉化率即去除率是衡量本工藝汙水處理效果的一項重要指標，計算方法如下所示氮、磷的轉化率(％) = (C1-C2) X 100% /C1式中=C1-廢水培養基中初始氮、磷的含量，mg ；C2-處理後廢水培養液中氮、磷的含量，mg。廢氣中(X)2的轉化率即(X)2減排量是衡量本工藝廢氣處理效果的一項重要指標，計算方法如下所示CO2 的轉化率(% ) = (C1-C2) X 100% /C1式中=C1-電廠廢氣中(X)2的體積濃度，％ ；C2-處理後廢氣中CO2的體積濃度，％。微藻油脂的含量或油脂的得率是衡量本工藝的綜合經濟效益的一項重要指標，計算方法如下所示油脂的得率(％) = Hi1AiciX 100%式中mQ-提取油脂的藻體乾重，g ；m「粗油脂的質量，g。實施例1採用分割法-二步法相耦合的發酵方式並以過濾除雜菌或雜藻後的市政汙水和工業汙水的經汙水處理廠處理的二級出水為培養基，向該培養基中接種小球藻C9-JN2010，其中，初始接密度為6.0X107cfu/ml，光照周期為16h 8h，光照強度為150001ux，培養溫度為301，？!1為7.0，0)2氣體的0)2濃度為30(% (ν/ν)，通氣量為0. lVVm，分割培養前，培養4 後所述光反應器內藻濃度高達2. OX 108cfu/ml，且所述光反應器內的氮、磷的含量符合國家A類排放水標準時進行發酵液分割，取出1/3 2/3所述發酵液進行濃縮獲得濃縮發酵液，將一部分所述濃縮發酵液返回所述光反應器中並往所述光反應器中補加新鮮的市政汙水，保持所述培養基的總量100%，繼續培養至所述光反應器內的藻濃度達5. OX IO8Cfu/ml。將剩餘的所述濃縮發酵液充入具有海鹽濃度為2. 5% (W)的汙水培養基的積油罐中在通氣量為0. 2VVm的CO2濃度為30.0% (ν/ν)的所述CO2氣體下二步發酵進行油脂積累48h，之後收集藻體提取藻油。利用上述工藝培養小球藻C9-JN2010，氮、磷及(X)2的去除率及油脂積累關係見圖2A-2B所示。由圖2A分析可知，在0 4 培養過程中，隨著培養時間延長，小球藻C9-JN2010對氮、磷及(X)2的消耗速度加快，在4 消耗速度最快，達到最大值分別為90. 0% (W)、93.0% (W)和70% (v/v)，且藻體濃度達到2.0X108cfu/ml，隨後進行分割，取出其中2/3發酵液進行濃縮後，將其中的1/3返回反應器並充入無鹽的新鮮市政汙水，保持培養基總量100%，另外一部分通入積油罐二次發酵積油48h。由圖2B分析可知，最終藻濃度達5. OX 108CfU/ml，油脂含量最高達到40.0% (W)。以後按上述再次進行分割培養，半連續培養，連續分割10次。實施例2
採用連續發酵方式並以過濾除雜菌或雜藻後的市政汙水和工業汙水是經汙水處理廠處理的二級出水為培養基，向該培養基中接種小球藻C9-JN2010，其中，初始接密度為3. 5 XlO7CfuAil，光照周期為14h 10h，光照強度為50001ux，培養溫度為25°C，pH為8. 5，CO2氣體的(X)2濃度為25. 0% (ν/ν)，通氣量為0. 2VVm，連續培養480h，氮、磷去除效果，CO2的轉化率(％ (ν/ν))及油脂積累關係見圖3Α-;3Β所示。由圖3Α分析得知，在連續培養前期，隨著培養的時間延長，其對氮、磷及(X)2的利用加快。在0 120h氮的利用速度不斷加快，隨後去除率達到80. 0% (W)，在120 288h還不穩定，隨後氮去除率趨於穩定在80.0% (W)。在0 磷的利用速度不斷加快，隨後去除率達到80.0% (W)，96 21 還不穩定，隨後磷去除率趨於穩定在80.0% (W)。在0 96h CO2利用速度不斷加快，隨後去除率達到65. 0% (ν/ν)，在96 240h還不穩定，隨後(X)2去除率趨於穩定在65. 0% (ν/ν)。由圖;3Β分析得知，在連續培養前期，隨著培養的時間延長，藻細胞生長速率及油脂的積累速率加快。在0 藻體生長速度不斷加快，藻體濃度達3. OX 108Cfu/ml，在96 MOh還不穩定，隨後藻體濃度趨於穩定在3. OX 108cfu/ml。在0 19 油脂積累速度不斷加快且油脂含量高達25. 0% (W), 192h以後藻體油脂的含量趨於穩定在25. 0% (W)0實施例3採用分批發酵方式並以過濾除雜菌或雜藻後的市政汙水和工業汙水是經汙水處理廠二級出水為培養基，向該培養基中接種小球藻C9-JN2010，其中，初始接密度為1.0 XlO7CfuAil，光照周期為IOh 14h，光照強度為75001UX，培養溫度為20°C，pH為6. 5，CO2的濃度為15. 0% (ν/ν)，通氣量為0. OlVVm，分批培養480h，氮、磷去除效果，CO2的轉化率(％ (ν/ν))及油脂積累關係見圖4Α-4Β所示。由圖4Α分析得知，在培養前期，隨著培養的時間延長，其對氮、磷及(X)2的利用加快。在0 16 內氮的利用速度不斷加快且去除率高達98. 0% (W)，隨後在168 21 內一直保持在此水平，但在MOh開始下降為91.0% (W)，之後一直保持在此水平。在0 168h內磷的利用速度不斷加快且去除率高達99. 5% (W),隨後在168 內一直保持在此水平，但在觀他略有下降，為98. 0% (W)，之後一直保持在此水平。在0 16 內CO2利用速度不斷加快且去除率高達75. 0% (ν/ν)，並在168 MOh內保持穩定，隨後利用速度逐漸減慢，最終CO2去除率只有30.0% (ν/ν) 0由圖4Β分析得知，在分批培養前期，隨著培養的時間延長，藻細胞生長速率及油脂的積累速率加快。在分批培養過程中，在0 120h藻體生長不斷加快且藻體濃度最大達1. IX 108CfU/ml，在120h 16 內維持在此水平，隨後藻體濃度開始下降，最終為5. 2X 107CfU/ml。在0 16 內藻體油脂積累速度不斷加快且藻體油脂含量高達30. 0%(W)，隨後一直保持在此水平。因此，本發明的以市政汙水和工業汙水為培養基並利用普通小球藻C9-JN2010高密度培養工藝進行汙水處理，向該培養基中接種小球藻C9-JN2010，其中，初始接密度為 1.0X107cfu/ml 6. 0X107cfu/ml，光照周期為 IOh 14h 16h 8h，光照強度為50001ux 150001ux，培養溫度為 20 25°C，pH 為 6. 5 8. 5，CO2 (15. 0% 30. 0% (v/v))通氣量為0. 01 0. 2VVm,培養480h後，藻細胞濃度高，且所述光反應器內的氮、磷等含量符合國家A類排放水標準(總氮濃度為15. Omg/L，氨氮濃度為1.0mg/L，總磷濃度為0. 5mg/L)。通過小球藻的深度處理後，水中總氮濃度低於15. Omg/L，氨氮濃度小於1. Omg/L，總磷濃度低於0. 5mg/L,汙水中的氮磷含量分別降低了 80. O% 98. O% (W)和80. 0%~ 99. 5%(W)，CO2濃度降低30. O 75. 0% (ν/ν)，ρΗ為7. O 8. O。通過小球藻的生長積累油脂，最終光反應器內的藻濃度達1. 0X108Cfu/ml 5. O XlO8CfuAil，油脂含量可達25.0% 40.0% (W)。能實現CO2減排和生物能源生產、氮、磷及CO2高去除效率，並且藻濃度、油脂的含量高，達到保護環境和生產生物資源的雙重效果，操作簡便快速、成本低、無汙染、社會和經濟綜合效益高，適於大規模推廣應用。綜上所述，本發明的普通小球藻CO2耐受能力強，生產強度高，其培養方法把汙水處理和生產生物能源與其他副產品(如，蛋白質、化妝品原料及動物飼料等)相結合，降低生產成本，達到廢物資源的綜合利用，實現節能減排的綠色生產，設計巧妙獨特，適於大規模推廣應用。在此說明書中，本發明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發明的精神和範圍。因此，說明書和附圖應被認為是說明性的而非限制性的。
權利要求
1.一種普通小球藻，其特徵在於，所述普通小球藻是小球藻C9-JN2010，保藏編號為CCTCC NO :M 2010373。
2.—種普通小球藻培養方法，其特徵在於，在光反應器內，以市政汙水和/或工業汙水經汙水處理廠處理後的二級出水為培養基，接種根據權利要求1所述的普通小球藻並進行培養，其中，初始接種密度為1.0X107cfu/ml 6.0X107cfu/ml，所述培養的條件為光照周期為IOh 14h 16h 8h，光照強度為50001ux 150001ux，培養溫度為20 30°C，pH為6. 5 8. 5, CO2氣體通氣量為0. 01 0. 2VVm，所述(X)2氣體的(X)2濃度為15% 30%(ν/ν)。
3.根據權利要求2所述的普通小球藻培養方法，其特徵在於，所述汙水處理廠是無錫市惠聯熱電有限公司的汙水廠。
4.根據權利要求2所述的普通小球藻培養方法，其特徵在於，所述(X)2氣體是將工廠排放的廢氣與空氣混合而成。
5.根據權利要求2所述的普通小球藻培養方法，其特徵在於，所述二級出水中總氮為30. 0 50. Omg/L，氨氮為 10. 0 16. Omg/L,總磷濃度為 2. 0 4. Omg/L。
6.根據權利要求2所述的普通小球藻培養方法，其特徵在於，培養480h後，所述光反應器內藻細胞濃度達1. OX IO8CfuAil 5. OX 108cfu/ml，且所述光反應器內的所述培養基的水質符合國家A類排放水標準。
7.根據權利要求2所述的普通小球藻培養方法，其特徵在於，培養至所述光反應器內的所述培養基中總氮濃度低於15. Omg/L，氨氮濃度小於1. Omg/L,總磷濃度低於0. 5mg/L。
8.根據權利要求2所述的普通小球藻培養方法，其特徵在於，培養至所述光反應器內的所述普通小球藻的油脂含量達25. 0% 40. 0% (W)。
9.根據權利要求1所述的普通小球藻在汙水處理中的應用。
10.根據權利要求1所述的普通小球藻在油脂生產中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種普通小球藻，為小球藻C9-JN2010，保藏編號為CCTCC NOM2010373，還提供了其培養方法，以市政汙水和/或工業汙水經汙水處理廠處理後的二級出水為培養基，接種後進行培養，初始接種密度為1.0×107cfu/ml～6.0×107cfu/ml，培養條件為光照周期為10h∶14h～16h∶8h，光照強度為5000lux～15000lux，培養溫度為20～30℃，pH為6.5～8.5，CO2氣體通氣量為0.01～0.2VVm，CO2濃度為15.0％～30.0％(v/v)，還提供了普通小球藻在汙水處理和油脂生產中的應用，本發明的普通小球藻CO2耐受能力強，生產強度高，其培養方法把汙水處理和生產生物能源與其他副產品(如，蛋白質、化妝品原料及動物飼料等)相結合，降低生產成本，達到廢物資源的綜合利用，實現節能減排的綠色生產，設計巧妙獨特，適於大規模推廣應用。
文檔編號C02F3/32GK102586116SQ20111000751
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月14日 優先權日2011年1月14日
發明者夏小樂, 張玲, 李宇佶, 李昌靈, 楊海麟, 王武, 辛瑜 申請人:江南大學