用於牛結核病診斷的重組蛋白及其應用的製作方法

2023-07-11 14:07:06

專利名稱：：用於牛結核病診斷的重組蛋白及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種重組蛋白，特別是涉及一種用於牛結核病診斷的重組蛋白及其應用。
背景技術：
：牛結核病(bovinetuberculosis)主要是由牛分技桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的一種牛慢性消耗性傳染病。該病一年四季均可發生，呈世界流行性，在流行嚴重的地區，感染率可達60%。世界上包括美國、加拿大、澳大利亞等十多個國家已經實現了無結核牛的報導，但近年來，由於野生動物以及人類結核病的發生與流行，使這些結核病控制良好國家的牛群也處在不斷檢疫和高度警惕之中。牛結核不僅導致了養牛業自身生產力的下降，更重要的是對人類健康構成了嚴重的威脅。人對牛結核比較敏感，很多病例與感染動物有接觸史。由於牛和人類的關係(牛奶、牛肉及製品等)較其他動物更為密切，因此約10%左右的人結核病是由牛分枝桿菌引起；有研究表明，在有結核病奶牛的地區，人的結核感染率可以高達750/。。要從根本上控制牛結核病的發生與流行，首先必須加強對本病的診斷學的研究，事實上，國內外學者也從未間斷過對牛結核病診斷方法的不斷改進。目前普遍採用結核菌素純蛋白衍生物(proteinpurifiedderivative,PPD)為抗原進行變態反應(皮內試驗，TST試驗)進行牛結核病的診斷。PPD試驗存在主觀性強、耗時耗力、短時間內不能進行重複檢測以及對免疫妥協患牛、近期受感染的個體敏感性很低等缺點。90年代後期囯外發展起來的以PPD為抗原的幹擾素(IFN)-Y釋放試驗明顯提高了牛結核分枝桿菌診斷的靈敏性，該方法避免了對機體的侵入性實驗，可以短時間內多次重複實驗，同時也摒棄了結核菌素試驗中操作和解釋上的主觀性，試驗中沒有抗原的滲入以及耗時縮短，目前國外已有商品化的診斷試劑盒生產。但是由於PPD包含的抗原成分複雜，這些抗原在環境分技桿菌、結核分枝桿菌、牛分技桿菌中廣泛存在，致使其特異性很差；同時有研究表明，PPD並不能安全區分BCG接種的個體和被環境分枝桿菌感染的個體，其特異性差等問題仍然存在。為了提高牛結核分技桿菌檢測的特異性，國內外學者做了大量研究以改進該檢測方法，他們利用基因重組和表達技術將牛結核分技桿菌ESAT6、MPB64、MPB70、MPB63、hsp65、Ag85B、CFP10等多種蛋白成份進行了重組表達，並以這些重組蛋白進行了牛結核病的診斷研究，雖然重組表達的單個抗原的特異性有所提高，但敏感性還不夠理想。本研究對以上各種蛋白進行了配伍，並用不同分枝桿菌感染的豚鼠進行動物模型試驗，結果發現，ESAT6和CFP10二者混合後不僅對牛結核的診斷具有良好的特異性，而且具有令人滿意的敏感性。以上研究結果在後來800頭牛的臨床試驗中得到了證實。雖然已有體外表達CFP10和ESAT6的研究報導，但目前尚未有人將2者的表達產物或共表達產物用作致敏原對牛進行皮試試驗(TST)，用以檢測牛結核感染。
發明內容本發明的目的是針對牛PPD存在的非特異性，及PPD製備繁瑣的不足，提供一種高特異性和高敏感性的PPD替代的重組蛋白，用於牛結核病的診斷。為達到上述目的，本發明的技術方案提供一種用於牛結核病診斷的重組蛋白，釆用如下方法得到提取牛結核分支桿菌基因組DNA作為PCR反應的模板擴增出CFP10和ESAT6基因片段，用基因拼接技術擴增出目的基因CFP10-ESAT6融合基因，將其經克隆、轉化後獲得的重組菌按常規方法誘導表達，表達產物純化後即得。本發明的重組蛋白，其中所述用基因拼接技術擴增出目的基因CFP10-ESAT6融合基因的方法，可以釆用重疊PCR的方法通過兩次PCR實現目的基因的拼接。其具體操作可以為(1)設計4條引物Pl為CFP10上遊引物，如SEQIDNo.l所示；P2第1-45位為連接序列Linker,後面為ESAT6基因下遊引物，如SEQIDNo.2所示；P3第1-45位為與引物P2連接序列互補的鹼基序列，後面為ESAT6基因上遊引物，如SEQIDNo.3所示；P4為ESAT6基因下遊引物，如SEQIDNo.4所示；(2)PCR擴增首先以P1、P2和P3、P4分別為引物，以牛結核分枝桿菌基因組DNA為模板，擴增出CFP10和ESAT6基因片段，回收PCR產物，再以等量的兩回收產物為模板，以Pl、P4為引物，擴增出CFP10-ESAT6融合基因，回收目的片段。本發明的重組蛋白，上述方法擴增得到的CFP10-ESAT6融合基因的序列如SEQIDNo.5所示，其中第301-345位為重疊序列。本發明的重組蛋白，在得到目的基因CFP10-ESAT6融合基因後，後續的克隆和轉化可釆用常規方法，將目的基因表達。其中一種可選的方法是將目的基因CFP10-ESAT6融合基因片段連接入表達載體pET-32a並轉化入大腸埃希氏菌BL21(DE3)中，提取質粒，經雙酶切初步篩選陽性克隆，並經序列測定驗證克隆。得到的含陽性質粒的重組菌-大腸埃希氏菌誘導表達後的菌體4°C、5000-12000r/min離心10-20min，將沉澱以8-12倍濃縮比例重懸於PBS中，超聲波裂解菌體，取上清，過NI-NTA柱，通過咪唑濃度梯度洗脫法純化重組蛋白。其中超聲波功率優選200W,工作10s，間歇10s。上述得到的重組蛋白用作致敏原對牛進行皮試試驗(TST),用以檢測牛結核感染。一種重組蛋白皮試試驗的方法及結果判定可以如下述所示試驗方法將重組蛋白用生理鹽水稀釋成10-20pig/mL,不論牛隻大小，一律於頸中部上l/3處剪毛(或提前一天剪毛，以避免因剪毛不慎引起局部炎症而影響結果判定)，注射重組蛋白前先用卡尺測量擬注射部位的皮皺褶厚度(即雙層皮厚)，作好記錄。用酒精消毒注射部位後，皮內注射0.1亳升。(小於三月齡牛也可在肩胛部進行試驗。)注射後48小時，觀察注射部位有無炎性反應，並用卡尺測量皮皺褶厚度。結果判定將注射後48小時所測得的皮皺褶厚度減去注射前所測得的皮皺褶厚度後，再依據以下標準作結果判定。陽性反應試驗局部有明顯的炎症反應，皮厚差大於或等於3.0mm。疑似反應試驗局部炎性反應不明顯，皮厚差大於或等於2.0mm，小於3.0mm。陰性反應試驗局部無炎性反應，皮厚差小於2.0mm。凡是判定為疑似反應的牛隻，應於第一次試驗的60天後進行第二次試驗，如結果仍為疑似反應，則經過60天後再試驗，還為疑似反應，應判定為陽性反應。對於陰性和疑似反應的牛，應於注射後的72小時和96小時再分別觀察一次結果，以防個別牛出現較遲的變態反應。據此，本發明還提供一種牛結核病診斷試劑，其包含有10-20嗎/mL的上述所述的重組蛋白。本發明試劑產品分液體製品和凍幹製品，均在2-8'C保存，凍幹製品的有效期為IO年，液體製品的有效期為2年。本發明還提供一種牛結核病診斷試劑盒，其包含上述的診斷試劑。上述技術方案具有如下優點1、本發明中所用的診斷抗原為牛結核感染早期介導細胞免疫的主要優勢抗原，結核感染後該抗原在體內能持續存在，但禽結核、副結核、及卡介苗等極易幹擾牛結核診斷的細菌不表達該蛋白質。因此，該試劑不僅能及時診斷出牛結核的感染，在鑑別診斷上也有較大的意義。2、應用基因拼接(Genesplicingbyoverlapextension)的方法進行兩基因的連接，並且在兩基因的中間引入一段疏水胺基酸linker,能夠在連接的同時最大可能的保證兩抗原間的空間結構，以保持蛋白的天然活性，避免了分別表達2個蛋白，進行2種蛋白純化的工作，節省了生產成本。3、經典的TST試驗中需要使用PPD,而使用PPD時需要動用牛結核強毒株，增加了生物安全控制成本。本發明只需要用無致病性的大腸桿菌發酵即可獲得大量的靶蛋白。4、使用本發明提供的重組蛋白及診斷試劑診斷牛結核病成本低、速度快、高敏感性和特異性。圖la是本發明實施例l的基因PCR產物的電泳結果，其中l、2:ESAT6PCR條帶，大小為288bp;3、4:CFP10PCR條帶，大小為300bp;5:DL2000Marker。圖lb是本發明實施例1的基因PCR產物的電泳結果，其中1、2:為CFP10-ESAT6PCR產物；3:DL2000Marker。圖2是重組菌的誘導表達產物及純化產物的SDS-PAGE結果，其中1:中等蛋白分子Marker;2:含pET-32a質粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌體裂解物上清，未經IPTG誘導；3:含pET-32a質粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌體裂解物上清，經IPTG誘導；4:含pCFP10-ESAT6重組質粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌體裂解物上清，未經IPTG誘導；5:含pET-CFP10-ESAT6重組質粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌體裂解物上清，經IPTG誘導；6:經M-NTA柱純化後的重組表達產物。具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例l:1、目的基因的擴增本發明釆用基因拼接技術(Genesplicingbyoverlapextension)，即重疊PCR的方法通過兩次PCR實現目的基因的拼接。共設計4條引物，PI為CFP10上遊引物；P2前半段(劃線部分)為連接序列(Linker,編碼15個疏水胺基酸)，後半段為ESAT6基因下遊引物；P3前半段(劃線部分)是與引物P2劃線部分互補的鹼基序列(Linker)，後半段為ESAT6基因上遊引物；P4為ESAT6基因下遊引物。首先用引物P1、P2擴增出CFP10基因，用引物P3、P4擴增出ESAT6基因，然後取2種基因產物等體積混合後作為模板，用引物PI和P4擴增出CFP10-ESAT6基因。具體操作方法如下1.1引物設計根據GenBank中的鄉co^c&n'wm6ov&AF2122/97(登陸號NC002945)設計引物Pl:5，-GCGAATTCATGGCAGAGATGAAG-3，，如SEQIDNo.l所示；P2:5,-GCTTCCACCTCCTCCGCTTCCACCACCTCCGCTTCCACCGCCACCGAAGCCCATTTGCG-3，，如SEQIDNo.2所示；P3:5，-GGTGGCGGTGGAAGCGGAGGTGGTGGAAGCGGAGGAGGTGGAAGCATGACAGAGCAGCAG-3，,如SEQIDNo.3所示；P4:5'-CCCTCGAGTTACTATGCGAACATCCCAGTG-3，，如SEQIDNo.4所示；Pl、P4劃線部分分別為、7//w/m酶切位點，P2、P3劃線部分為互補的45個鹼基的linker。1.2目的片段的擴增PCR擴增條件為:94。C/10min，94。C/30s、55°C/30s、72°C/2min(30個循環)，72°C/10min。首先以P1、P2和P3、P4分別為引物，以牛結核分枝桿菌基因組DNA為模板，擴增出CFP10和ESAT6基因片段(見圖la)，回收PCR產物，再以等量的兩回收產物為模板，以Pl、P4為引物，擴增出CFP10-ESAT6融合基因(見圖lb)。PCR產物純化試劑盒回收目的片段。2、重組表達質粒pCFP10-ESAT6的構建用I、///>^///分別雙酶切回收的CFP10-ESAT6PCR產物及pET-32a，將兩酶切產物回收後按100:l(摩爾比)連接，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)，提取質粒，經雙酶切初步篩選陽性克隆，並經序列測定驗證克隆。3、重組蛋白的誘導表達及SDS-PAGE分析將含陽性質粒的重組菌一一大腸埃希氏菌pCFP10-ESAT6株菌(2009年7月6日本菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCCNo.3168)在LB液體培養基中37。C振蕩培養過夜，按1:100接種LB培養基，37。C振蕩培養3h，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，30。C繼續培養6h。收集未誘導及6h誘導的菌液lmL,離心取沉澱，用200pL的pH7.4的PBS重懸，加入50|iL的5xloadingBuffer，混勻後煮沸5min，各取lO(iL上清液與標準分子量蛋白Maker進行SDS-PAGE電泳(見圖2),後用考馬斯亮藍染色。4、重組蛋白的純化將表達後菌體4°C5000r/min離心15min或12000r/min離心10min，棄上清，將沉澱以10倍濃縮比例重懸於pH7.4PBS中，超聲波(功率200W，工作10s，間歇lOs)裂解菌體20min,再次4°C5000r/min離心20min,收集上清，經0.45pm濾膜過濾後，過NI-NTA柱，通過咪唑濃度梯度洗脫法純化重組蛋白，並根據Bradford法確定重組蛋白濃度。5、重組蛋白皮試試驗方法將重組蛋白用生理鹽水稀釋成10-20昭/mL,不論牛隻大小，一律於頸中部上l/3處剪毛(或提前一天剪毛，以避免因剪毛不慎引起局部炎症而影響結果判定)，注射重組蛋白前先用卡尺測量擬注射部位的皮皺褶厚度(即雙層皮厚)，作好記錄。用酒精消毒注射部位後，皮內注射O.l亳升。(小於三月齡牛也可在肩胛部進行試驗。)注射後48小時，觀察注射部位有無炎性反應，並用卡尺測量皮皺褶厚度。6、結果判定標準將注射後48小時所測得的皮鈹褶厚度減去注射前所測得的皮鮍褶厚度後，再依據以下標準作結果判定。陽性反應試驗局部有明顯的炎症反應，皮厚差大於或等於2,5mm。疑似反應試驗局部炎性反應不明顯，皮厚差大於或等於1.5mm，小於2.5mm。陰性反應試驗局部無炎性反應，皮厚差小於1.5mm。凡是判定為疑似反應的牛隻，應於第一次試驗的60天後進行第二次試驗，如結果仍為疑似反應，則經過60天後再試驗，還為疑似反應，應判定為陽性反應。對於陰性和疑似反應的牛，應於注射後的72小時和96小時再分別觀察一次結果，以防個別牛出現較遲的變態反應。試驗例地點山東某奶牛場。時間2007.4試驗頭數28頭檢驗方法將實施例l提供的重組蛋白用生理鹽水稀釋成20pg/mL，不論牛隻大小，一律於頸中部上l/3處剪毛(或提前一天剪毛，以避免因剪毛不慎引起局部炎症而影響結果判定)，注射重組蛋白前先用卡尺測量擬注射部位的皮皺褶厚度(即雙層皮厚)，作好記錄。用酒精消毒注射部位後，皮內注射0.1毫升。(小於三月齡牛也可在肩胛部進行試驗。)注射後48小時，觀察注射部位有無炎性反應，並用卡尺測量皮皺褶厚度。試驗同時在牛頸中部上同一側進行常規PPD對照。試驗結果見表l表ltableseeoriginaldocumentpage12tableseeoriginaldocumentpage13根據本專利中確定的陰、陽性判斷標準，4#、5#、10#、11#、13#判為陽性，1#、8#、18#、19#、24#判為可疑。根據PPD的判斷標準，5#、10#、13#、19#、24#判為可疑。用進口試劑盒檢測，結果4#、5#、10#、11#、13#、19#為陽性，與本專利中申報的重組蛋白檢驗結果吻合性最好，陽性樣品100%吻合，只有第19#樣品用重組蛋白檢驗判為可疑，而試劑盒檢測為陽性。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。序列表廣東大華農動物保健品有限公司用於牛結核病診斷的重組蛋白及其應用KHP09112896.65〈170>Patentlnversion3.51〈211>23畫人工序列1gcgaattcatggcsgagstgaag23〈210>259畫〈213>人工序列2gcttccacctcctccgcttccaccacctccgcttccaccgccaccgaagcccatttgcg59360〈212>DNA人工序列3ggtggcggtggaagcggaggtggtggaagcgg鄉aggtggaagcatgacagagcagcag604〈211>30〈212>DNA人工序列〈400〉4ccctcgagttactatgcgaacatcccagtg〈210>5〈211>633〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉5atggcagagatgaagaccgatgccgctaccctcgcgcaggatctccggcgacctgaaaacccagatcgaccaggtggagtggccagtggcgcggcgcggcggggacggccgcccaggccggcagccaataagcatgaagcaggaactcgatcgagatctcgagtcc犯tactcgagggccgacgaggagcagcagcaggcgcggtggcggtgg犯tcggaggtggtgg卿cgg鄉aggtgtggaatttcgcgggtatcgaggccgcggcaagcgcaatcccattccctccttgacgaggggaagcagtccctgaccaagcagcggttcggaggcgtaccagggtgtccagc肌aaatgggaacaacgcgctgcagaacctggcgcggacgatcagggaagaccgaaggcaacgtcactgggatgttcgcatag3ggC3ggt犯cgacggcaggcggtggtgcgcgaatattcgtgtcctcgcag犯gcatgax;鄉g3組gttcgcagcggcacgccacggcccggtcaggctttcg3gcggttcgttgcagcttcca3g犯tcaggccggcaatgggcttccacgtccattctggggcggttaccgagctg犯tggcttcg306012018024030036042048054060063權利要求1、一種用於牛結核病診斷的重組蛋白，其特徵在於，是採用如下方法得到的提取牛結核分支桿菌基因組DNA作為PCR反應的模板擴增出CFP10和ESAT6基因片段，用基因拼接技術擴增出目的基因CFP10-ESAT6融合基因，將其經克隆、轉化後獲得的重組菌按常規方法誘導表達，表達產物純化後即得。2、如權利要求1所述的重組蛋白，其特徵在於，所述用基因拼接技術擴增出目的基因CFP10-ESAT6融合基因的方法，是釆用重疊PCR的方法通過兩次PCR實現目的基因的拼接。3、如權利要求2所述的重組蛋白，其特徵在於，所述兩次PCR包括以下操作(1)設計4條引物Pl為CFP10上遊引物，如SEQIDNo.l所示；P2第1-45位為連接序列Linker,後面為ESAT6基因下遊引物，如SEQIDNo,2所示；P3第1-45位為與引物P2連接序列互補的鹼基序列，後面為ESAT6基因上遊引物，如SEQIDNo.3所示；P4為ESAT6基因下遊引物，如SEQIDNo.4所示；(2)PCR擴增首先以P1、P2和P3、P4分別為引物，以牛結核分枝桿菌基因組DNA為模板，擴增出CFP10和ESAT6基因片段，回收PCR產物，再以等量的兩回收產物為模板，以Pl、P4為引物，擴增出CFP10-ESAT6融合基因，回收目的片段。4、如權利要求3所述的重組蛋白，其特徵在於，所述擴增得到的CFP10-ESAT6融合基因的序列如SEQIDNo.5所示。5、如權利要求1-4任一項所述的重組蛋白，其特徵在於，將得到的目的基因CFP10-ESAT6融合基因的片段連接入表達載體pET-32a並轉化入大腸埃希氏菌BL21(DE3)中，提取質粒，經雙酶切初步篩選陽性克隆，並經序列測定驗證克隆。6、如權利要求5所述的重組蛋白，其特徵在於，將得到的含陽性質粒的重組菌-大腸埃希氏菌誘導表達後的菌體4'C、5000-12000r/min離心10-20min,將沉澱以8-12倍濃縮比例重懸於PBS中，超聲波裂解菌體，取上清，過NI-NTA柱，通過咪唑濃度梯度洗脫法純化重組蛋白。7、如權利要求6所述的重組蛋白，其特徵在於，所述超聲波功率200W，工作10s,間歇10s。8、權利要求1-7任一項所述的重組蛋白在製備檢測牛結核感染的致敏原中的應用。9、一種牛結核病診斷試劑，其特徵在於，包含10-20pg/mL的權利要求l-7任一項所述的重組蛋白。10、一種牛結核病診斷試劑盒，其特徵在於，包含權利要求9所述的診斷試劑。全文摘要本發明公開了一種用於牛結核病診斷的重組蛋白，採用如下方法得到提取牛結核分支桿菌基因組DNA作為PCR反應的模板擴增出CFP10和ESAT6基因片段，用基因拼接技術擴增出目的基因CFP10-ESAT6融合基因，將其經克隆、轉化後獲得的重組菌按常規方法誘導表達，表達產物純化後即得。使用本發明所提供的重組蛋白及診斷試劑診斷牛結核病成本低、速度快、高敏感性和特異性。文檔編號C12P19/00GK101684160SQ200910089180公開日2010年3月31日申請日期2009年8月3日優先權日2009年8月3日發明者徐家華,陳瑞愛申請人:廣東大華農動物保健品股份有限公司