一種荒漠擬孢囊菌和奧利萬星中間體的製備方法與流程
2023-08-09 23:39:16 2
本發明屬於醫藥領域，具體涉及一種荒漠擬孢囊菌和奧利萬星中間體的製備方法。
背景技術：
：需氧革蘭陽性球菌是細菌性感染的重要病原菌，自20世紀80年代末以來，該類細菌所致感染呈持續上升的趨勢。然而革蘭陽性球菌耐藥性的日趨嚴重，給感染性疾病的治療帶來嚴峻挑戰。替考拉寧和萬古黴素是目前用於治療耐藥革蘭陽性菌感染的常用糖肽類藥物。但是，隨著臨床應用的日益廣泛，世界各地亦相繼出現了萬古黴素耐藥金葡菌(VISA、VRSA)以及萬古黴素耐藥腸球菌(VRE)。因此，替考拉寧和萬古黴素已不能完全滿足臨床需要，有必要開發應用新的糖肽類抗生素藥物。2014年8月6日，美國FDA批准Medicines公司開發的奧利萬星上市(Oritavancin，LY-333328)，商品名為Orbactiv，它是繼替考拉寧和萬古黴素後開發的第二代糖肽類抗生素。Orbactiv是美國FDA批准用於急性細菌性皮膚和皮膚結構感染(ABSSSIs)治療的首個和唯一的單劑量治療方案的抗生素。Orbactiv注射劑用於革蘭陽性菌敏感株導致的ABSSSIs成人患者的治療，包括：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，甲氧西林敏感和甲氧西林耐藥菌株)、化膿性鏈球菌(Mlicrococcusscarlatinae)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)、咽峽炎鏈球菌群(Streptococcusanginosus、Streptococcusintermedius和Streptococcusconstellatus)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis，萬古黴素敏感株)。奧利萬星的化學合成需要關鍵中間體A82846B，其由荒漠擬孢囊菌(Kibdelosporangiumaridum)發酵產生。目前，國內外對奧利萬星藥物活性進行了較多研究，而對中間體A82846B的研發和生產報導少。上世紀九十 年代禮來公司獲得的美國專利US5843437(授權日1998年12月1日)等對生產A82846B的菌種、發酵和提取工藝進行了描述，但其發酵效價低。而提高A82846B的發酵水平，對奧利萬星產業化具有重要的應用價值。ARTP(AtmosphericandRoomTemperaturePlasma)為常壓室溫等離子體，是近幾年來發展起來的一種新的等離子體源，能夠在常壓(1atm)下產生溫度在25～40℃之間的，具有高活性粒子(如處於激發態的氦原子、氧原子、氮原子、OH-自由基等)濃度的等離子體射流。研究表明，等離子體中適當劑量的活性粒子作用於微生物，能夠使微生物細胞壁和細胞膜的結構及通透性改變，並引起基因損傷，進而使微生物基因序列及其代謝網絡顯著變化，最終導致微生物產生突變。與傳統誘變方法相比，採用常壓室溫等離子體有效造成多樣性的DNA損傷、突變率高、易獲得遺傳穩定性良好的突變株等優點；與分子操作手段或其他化學誘變手段相比，常壓室溫等離子體進行微生物誘變育種具有操作簡便、成本低、無有毒有害物質參與誘變過程等優點。NTG(N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍)為微生物育種中常用的烷化劑，有超級誘變劑之稱。烷化劑帶有活性烷基，此基團能夠轉移到其它電子密度高的分子上去，使鹼基許多位置上增加了烷基，從而在多方面改變氫鍵。依靠NTG誘發的突變主要是GC-AT轉換，另外還有小範圍切除、移碼突變及GC對的缺失。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是，針對目前奧利萬星中間體(A82846B)發酵效價低的缺陷，提供一種荒漠擬孢囊菌及其發酵獲得A82846B的製備方法，所述的荒漠擬孢囊菌可以高產量生產奧利萬星中間體，發酵效率高；所述的製備方法可以以較低成本獲得大量的奧利萬星中間體，有利於產業化生產。本發明所述的A82846B的結構式如式(1)所示：本發明人把ARTP和NTG這兩種物理和化學的誘變手段結合起來進行複合誘變篩選，獲得了發酵效價高、遺傳性狀穩定的產A82846B的突變的荒漠擬孢囊菌。並對荒漠擬孢囊菌發酵獲得A82846B的方法的發酵培養基配方、工藝參數等進行優化。本發明的技術方案之一是：一種荒漠擬孢囊菌(Kibdelosporangiumaridum)，其保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為：CGMCCNo.10576。從海地土壤樣品中分離獲得菌種A.orientalisA82846，經自然分離得到的菌株HS807-O-13，菌株HS807-O-13經誘變篩選後得到菌株HS807-A-639，所述菌株HS807-A-639經ARTP和NTG複合誘變篩選，獲得具有高產A82846B的菌株CGMCCNo.10576。對該菌株進行鑑定，結果為荒漠擬孢囊菌(Kibdelosporangiumaridum)，命名為HS807-AN-2396。該菌株已於2015年3月11日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，並收到保藏中心登記入冊編號CGMCCNo.10576，其具有以下的微生物學特性：1、形態學的特性在顯微鏡下觀察在固體培養基中培養的菌株時，該菌呈長短不一的絲狀，菌絲直徑為0.1-1.0μm，產白色孢子，革蘭氏染色呈陽性。2、培養學的特性當在溫度14～37℃、pH5.0～7.5下，菌落生長良好，超過該範圍則會出現生長差或不生長的情況。3、生理特性可以很好地利用D-葡萄糖、麥芽糖、D-乳糖作為碳源，但不利用D-木糖、L-阿拉伯糖和甘氨酸。可以有效地利用銨鹽類氮源；但是難以利用硝酸鹽類氮源。可以在除腺嘌呤以外的降解物上生長良好；在降解方面，僅能夠降解酪蛋白和酪氨酸。並且能夠進行明膠液化並能夠產生硫化氫。本發明的技術方案之二是：一種製備奧利萬星中間體A82846B的方法，將所述的荒漠擬孢囊菌CGMCCNo.10576在發酵培養基發酵，從發酵液中獲得奧利萬星中間體A82846B。本發明所述發酵的時間為本領域常規的時間，較佳地為168～240小時，更佳地為192～212小時，最佳地為202～210小時。本發明所述發酵的溫度為本領域常規的溫度，較佳地為25～34℃，更佳地為28～32℃。所述發酵在搖瓶中進行，所述搖瓶的體積為本領域常規的體積，較佳地為250mL。轉速為本領域常規的轉速，較佳地為250rpm。所述振幅為本領域常規的振幅，較佳地為5cm。所述發酵的溼度為本領域常規的溼度，較佳地為40～60％。所述發酵在小試發酵罐中進行，所述小試發酵罐的體積為本領域常規的體積，較佳地為50L。攪拌轉速為本領域常規的轉速，較佳地為200～600rpm。溶氧量為本領域常規的溶氧量，較佳地為30～50％，所述的百分比為本領域常規，較佳地為發酵罐中發酵液的含氧量佔該溫度下飽和含氧量的百分比。空氣流量為本領域常規的空氣流量，較佳地為0.5～1.0vvm。所述發酵在中試發酵罐中進行，所述中試發酵罐的體積為本領域常規的體積，較佳地為5000L。攪拌轉速為本領域常規的轉速，較佳地為30～150rpm。 溶氧量為本領域常規的溶氧量，較佳地為30～40％，所述的百分比為本領域常規，較佳地為發酵罐中發酵液的含氧量佔該溫度下飽和含氧量的百分比。空氣流量為本領域常規的空氣流量，較佳地為0.2～1.0vvm。所述發酵在產業化發酵罐中進行，所述產業化發酵罐的體積為本領域常規的體積，較佳地為60m3。攪拌轉速為本領域常規的轉速，較佳地為30～120rpm。溶氧量為本領域常規的溶氧量，較佳地為30～35％，所述的百分比為本領域常規，較佳地為發酵罐中發酵液的含氧量佔該溫度下飽和含氧量的百分比。空氣流量為本領域常規的空氣流量，較佳地為0.1～0.8vvm。所述發酵的種子液的接種量為本領域常規的接種量，較佳地為10～12％，所述的百分比為體積百分比。所述種子液由包括如下的步驟的方法獲得：將所述的荒漠擬孢囊菌CGMCCNo.10576在種子培養基中培養。其中，所述培養的時間為本領域常規的時間，較佳地為37～44小時，更佳地為41～43小時。所述培養的溫度為本領域常規的溫度，較佳地為28～32℃。所述培養在搖瓶中進行，所述搖瓶的體積為本領域常規的體積，較佳地為250mL。轉速為本領域常規的轉速，較佳地為250rpm。所述振幅為本領域常規的振幅，較佳地為5cm。所述發酵的溼度為本領域常規的溼度，較佳地為40～60％。所述培養在小試種子罐中進行，所述小試種子罐的體積為本領域常規的體積，較佳地為15L。攪拌轉速為本領域常規的轉速，較佳地為200～600rpm。溶氧量為本領域常規的溶氧量，較佳地為30～50％，所述的百分比為本領域常規，較佳地為種子罐中種子培養基的含氧量佔該溫度下飽和含氧量的百分比。空氣流量為本領域常規的空氣流量，較佳地為0.5～1.5vvm。所述培養在中試種子罐中進行，所述中試種子罐的體積為本領域常規的體積，較佳地為500L。攪拌轉速為本領域常規的轉速，較佳地為30～150rpm。溶氧量為本領域常規的溶氧量，較佳地為30～40％，所述的百分比為本領域常規，較佳地為種子罐中種子培養基的含氧量佔該溫度下飽和含氧量的百分比。空氣流量為本領域常規的空氣流量，較佳地為0.2～1.0vvm。所述培養在產業化種子罐中進行，所述產業化種子罐的為本領域常規的體積，較佳地為15m3。攪拌轉速為本領域常規的轉速，較佳地為50～200rpm。溶氧量為本領域常規的溶氧量，較佳地為30～50％，所述的百分比為本領域常規，較佳地為種子罐中種子培養基的含氧量佔該溫度下飽和含氧量的百分比。空氣流量為本領域常規的空氣流量，較佳地為0.2～1.0vvm。所述的種子培養基為本領域常規的種子培養基，較佳地，其包括如下的組成成分(g/L)：葡萄糖5.0～15.0、可溶性澱粉10.0～30.0、黃豆餅粉10.0～30.0、酵母抽提粉2.0～8.0、水解酪蛋白2.0～8.0、氯化鈉0.1～0.5和碳酸鈣0.9～1.5，pH6.8～7.5；更佳地包括如下的組成成分(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性澱粉20.0、黃豆餅粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化鈉0.3和碳酸鈣1.2，pH7.2。較佳地，所述發酵在小試發酵罐、中試發酵罐或產業化發酵罐中進行，其還包括如下的步驟：補加L-酪氨酸；和/或，補加L-纈氨酸。其中，所述L-酪氨酸在所述發酵培養基的含量為0.0～30.0g/L，較佳地為4.0～6.0g/L。所述L-纈氨酸在所述發酵培養基的含量為0.0～20.0g/L，較佳地為2.0～4.0g/L。本發明的技術方案之三是：一種用於發酵所述的荒漠擬孢囊菌CGMCCNo.10576獲得奧利萬星中間體A82846B的發酵培養基，其包括如下的組成成分(g/L)：有機碳源75.0～155.0、有機氮源24.0～58.0和無機鹽1.9～6.3；所述的有機碳源為葡萄糖、麥芽糊精、蔗糖、糖蜜和玉米澱粉中的一種或多種；所述的有機氮源為黃豆餅粉、棉籽餅粉、水解酪蛋白、酵母抽提粉和蛋白腖中的一種或多種；所述的無機鹽為氯化鈉、碳酸鈣中的一種或兩種。較佳地，所述的發酵培養基所述的發酵培養基還包括如下的組成成分(g/L)中的一種或多種：微量元素0.04～0.22、胺基酸0.0～50.0和/或消泡劑0.2～0.8。所述的微量元素為四水硫酸錳和六水氯化鈷中的一種或兩種。所述的胺基酸為L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-穀氨酸和L-亮氨酸中的一種或多種，較佳地，所述的胺基酸為L-酪氨酸和L-纈氨酸中的一種或兩種。所述的消泡 劑為發酵用消泡劑，較佳地，所述的消泡劑為發酵用消泡劑THIX-298，購自煙臺恆鑫化工科技有限公司。所述的發酵培養基的pH為本領域常規的pH，較佳地為6.0～7.5，更佳地為6.5～7.8。更佳地，所述的發酵培養基包括如下的組成成分(g/L)：葡萄糖10.0～30.0、麥芽糊精60.0～100.0、糖蜜5.0～25.0、水解酪蛋白2.0～10.0、L-酪氨酸0～30.0、L-纈氨酸0～20.0、酵母抽提粉2.0～8.0、棉籽餅粉20.0～40.0、氯化鈉0.4～0.8、碳酸鈣1.5～5.5、四水硫酸錳0.02～0.14、六水氯化鈷0.02～0.08和消泡劑0.2～0.8，pH6.5～7.8；最佳地，所述的發酵培養基包括如下的組成成分(g/L)：葡萄糖20.0、麥芽糊精80.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸12.0、L-纈氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽餅粉30.0、氯化鈉0.6、碳酸鈣3.5、四水硫酸錳0.08、六水氯化鈷0.05和THIX-2980.2，pH7.5。本發明的技術方案之四是：一種獲得所述的荒漠擬孢囊菌CGMCCNo.10576的方法，其包括以下的步驟，在培養基中培養所述的荒漠擬孢囊菌CGMCCNo.10576即可。其中，所述的培養基為本領域常規的培養基，能夠生長所述的荒漠擬孢囊菌CGMCCNo.10576即可，較佳地為ISP2、高氏一號、YMS或ISP9培養基，更佳地為本發明說明書所述的發酵培養基，最佳地為本發明說明書所述的種子培養基。所述培養的溫度為本領域常規的溫度，能夠生長所述的荒漠擬孢囊菌CGMCCNo.10576即可，較佳地，為14～37℃，更佳地為25～34℃，最佳地為28～32℃。所述培養的pH為本領域常規的pH，能夠生長所述的荒漠擬孢囊菌CGMCCNo.10576即可，較佳地為5.0～7.5，更佳地為6.0～7.5，最佳地為6.5～7.8。在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。本發明所用試劑和原料均市售可得。本發明的積極進步效果在於：本發明提供的ARTP與NTG複合誘變 A82846B高產菌株CGMCCNo.10576，遺傳性狀穩定，重現性好，放大易於實現，具有優良的工業化應用價值。本發明所述的發酵製造A82846B的方法，綜合調整了發酵配方、發酵控制工藝，並且針對L-酪氨酸和L-纈氨酸進行補加和殘留量控制，實現60m3罐上發酵效價2315mg/L的高產量，在規模上和技術水平上高於現有文獻報導，有利於奧利萬星的產業化生產。生物材料保藏信息本發明的HS807-AN-2396，已於2015年3月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，郵編：100101，保藏編號為：CGMCCNo.10576，生物材料(株)為HS807-AN-2396，分類命名是Kibdelosporangiumaridum。附圖說明圖1為荒漠擬孢囊菌HS807-AN-2396選育譜系，圖1的數字表示該菌株相應的A82846B發酵效價。圖2為實施例1的發酵液HPLC圖譜(A82846B的Rt為5.588)。圖3為實施例1的發酵液ESI/MS圖譜。圖4為實施例15的60m3罐的發酵代謝曲線。具體實施方式下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。實施例1高產菌株荒漠擬孢囊菌HS807-AN-2396(Kibdelosporangiumaridum)的製備從海地土壤樣品中分離獲得菌種A.orientalisA82846(菌種A.orientalisA82846參見：OliverPuk，PetraHuber，DanielBischoff，etc.,Glycopeptide BiosynthesisinAmycolatopsismediterraneiDSM5908:FunctionofaHalogenaseandaHaloperoxidase/Perhydrolase，Chemistry&Biology，Vol.9，225–235，February，2002)，然後自然分離得到HS807-O-13菌株，HS807-O-13菌株經誘變篩選後得到出發菌種HS807-A-639。製備HS807-A-639的菌懸液，並用濾紙過濾，鏡檢細胞分散度達到95％以上，確保大部分為單細胞，然後用於誘變處理。ARTP誘變處理：調整等離子體發生氣-氦氣流量為12.5L/min；等離子體發射口與盛樣品鐵片之間的距離為2mm；等離子體的照射功率為100w，照射時間為30s，得ARTP照射過的菌懸液。精確稱取10.0mg的NTG溶於1mL丙酮，加入上述ARTP照射過的菌懸液使NTG的終濃度達到1.0mg/L。4℃緩慢震蕩處理20min，離心棄上清，用無菌生理鹽水打散，重複洗滌2次，使其終止反應。吸取含有誘變過的液體培養基至含有750mg/LA82846B(從浙江海正藥業股份有限公司處獲得)的培養皿和含有2.0g/L的L-酪氨酸培養皿中進行塗布培養。培養溫度28～32℃，培養周期為8d。計算結果顯示複合誘變的致死率達到89％。從複合誘變後的抗性平板上挑取單菌落，進種子瓶培養，其中種子培養基為(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性澱粉20.0、黃豆餅粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化鈉0.3和碳酸鈣1.2，pH7.2，30℃培養3d，然後在250mL發酵搖瓶培養，其中，發酵培養基為(g/L)：葡萄糖20.0、麥芽糊精80.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸12.0、L-纈氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽餅粉30.0、氯化鈉0.6、碳酸鈣3.5、四水硫酸錳0.08、六水氯化鈷0.05和THIX-2980.2，pH7.5。30℃發酵8d，HPLC檢測A82846B含量。得到一株高產突變株HS807-AN-2396，搖瓶發酵效價為1325mg/L，復篩(即按照相同的條件再一次搖瓶，進行發酵培養)後搖瓶發酵效價1263mg/L，其HPLC圖譜如圖2所示。將發酵得到的發酵液進行分離提純(分離提純的步驟參見TsujiN.；T.Kamigauchi,M.Kobayashi&Y.Terui:Newglycopeptideantibiotics: II.Theisolationandstructuresofchloroorienticins.J.Antibiotics41:1506-1510,1988)，提純後的A82846B的ESI/MS圖譜如圖3所示。將出發菌種HS807-A-639，挑取單菌落，進種子瓶培養，其中種子培養基為(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性澱粉20.0、黃豆餅粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化鈉0.3和碳酸鈣1.2，pH7.2，30℃培養3d，然後在250mL發酵搖瓶培養，其中，發酵培養基為(g/L)：葡萄糖20.0、麥芽糊精80.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸12.0、L-纈氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽餅粉30.0、氯化鈉0.6、碳酸鈣3.5、四水硫酸錳0.08、六水氯化鈷0.05和THIX-2980.2，pH7.5。30℃發酵8d，HPLC檢測A82846B含量。搖瓶發酵效價為683mg/L，復篩(即按照相同的條件再一次搖瓶，進行發酵培養)後搖瓶發酵效價為656mg/L。從發酵結果來看，高產突變株HS807-AN-2396的發酵效價比出發菌株HS807-A-639提高了93％。將上述的高產突變株HS807-AN-2396，於2015年3月11日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，獲得保藏編號為：CGMCCNo.10576，生物材料(株)為HS807-AN-2396，分類命名是Kibdelosporangiumaridum。實施例2菌株HS807-AN-2396(CGMCCNo.10576)的形態學和培養學特徵參照《鏈黴菌鑑定手冊》、《放線菌的分類與鑑定》、《常見細菌系統鑑定手冊》及《分子克隆實驗指南》等書中的有關內容進行實驗。相關符號表示說明：0：無生長；1：生長很弱；2：能生長，有少量孢子；3：生長良好，有大量孢子；4：生長最好，有豐富孢子；+：陽性；-：陰性。培養特徵：採用ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、高氏一號、蘋果酸鈣、YMS和查氏九種培養基(從浙江海正藥業股份有限公司處獲得)，28℃培養6～8天後，觀察菌絲體的顏色及色素情況。表1菌株HS807-AN-2396在9種培養基上的培養特徵表1的結果說明，該改良菌種在ISP2、高氏一號、YMS上生長良好，並且在不同的培養基上，表現出不同的外觀、色素及產孢情況。實施例3菌株HS807-AN-2396(CGMCCNo.10576)的生理生化特徵培養條件均為28℃培養6～8天。a)碳源：採用ISP9作為基礎培養基，各種碳源的終濃度均為1.0％，所述的百分比為質量百分比。b)無機氮源：採用ISP9作為基礎培養基，硝酸鉀和硫酸銨的濃度均為0.1％。碳源和無機氮源的利用情況見表2，表2的結果說明，菌株HS807-AN-2396對不同的碳源利用程度不同，可以很好地利用D-葡萄糖、麥芽糖、D-乳糖，但不利用D-木糖、L-阿拉伯糖和甘氨酸。可以有效地利用銨鹽類氮源；但是難以利用硝酸鹽類氮源。表2菌株HS807-AN-2396的碳源和氮源的利用情況碳源生長情況碳源生長情況無機氮源生長情況D-葡萄糖3水楊苷2硫酸銨+D-棉子糖2D-乳糖3硝酸鉀-D-木糖0半乳糖2D-山梨醇2肌醇2L-阿拉伯糖0甘露醇2甘油2甘氨酸0麥芽糖3木聚糖2D-果糖1菊粉2D-蔗糖2鼠李糖2c)降解試驗：採用基礎培養基為GYEA(pH6.8)，各種降解物的濃度見表3。表3說明除腺嘌呤外，菌株HS807-AN-2396能夠在其他幾種降解物上生長良好；在降解方面，菌株HS807-AN-2396僅能夠降解酪蛋白和酪氨酸。表3中所述的百分比為質量百分比。表3菌株HS807-AN-2396的降解試驗結果降解物降解物濃度結果降解物降解物濃度結果腺嘌呤0.5％2，-酪蛋白1.0％4，+鳥嘌呤0.5％4，-酪氨酸1.0％4，+木聚糖0.4％4，-Tween-401.0％4，-次黃嘌呤0.4％4，-Tween-601.0％4，-Tween-801.0％4，-d)過氧化氫酶試驗採用YMS培養基。e)M.R和V-P實驗採用《常見細菌系統鑑定手冊》方法。表4說明，菌株HS807-AN-2396能進行明膠液化並能夠產生硫化氫。表4菌株HS807-AN-2396主要的生理生化特徵試驗項目結果試驗項目結果試驗項目結果明膠液化+牛奶腖化-纖維素利用-澱粉水解-硝酸鹽還原-過氧化氫酶-牛奶凝固-硫化氫產生+V.P實驗-M.R實驗-由實施例2～3的數據說明，所述荒漠擬孢囊菌CGMCCNo.10576具有以下的微生物學特性：1、形態學的特性在顯微鏡下觀察在固體培養基中培養的菌株時，細胞呈長短不一的絲狀，大小為0.4-1.0μm，產白色孢子，革蘭氏染色呈陽性。2、培養學的特性當在溫度14～37℃、pH5.0～7.5下，菌落生長良好，超過該範圍則會出現生長差或不生長的情況。3、生理特性可以很好地利用D-葡萄糖、麥芽糖、D-乳糖作為碳源，但不利用D-木糖、L-阿拉伯糖和甘氨酸。可以有效地利用銨鹽類氮源；但是難以利用硝酸鹽類氮源。可以在除腺嘌呤以外的降解物上生長良好；在降解方面，僅能夠降解酪蛋白和酪氨酸。並且能夠進行明膠液化並能夠產生硫化氫。實施例4菌株HS807-AN-2396(CGMCCNo.10576)的16SrDNA序列分析16SrDNA序列分析：菌株HS807-AN-2396的16SrDNA序列及與GenBank中相關序列進行BLAST比較，結果見表5。表5菌株HS807-AN-2396和相關菌株的同源性通過菌株HS807-AN-2396(CGMCCNo.10576)的表觀特徵試驗，發現該菌株和荒漠擬孢囊菌(Kibdelosporangiumaridum)的分類相關參數非常接近，同時對菌株HS807-AN-2396進行16SrDNA測序，測序結果如序列表SEQIDNo.1所示。將如序列表SEQIDNo.1所示的菌株HS807-AN-2396的16SrDNA序列與荒漠擬孢囊菌(Kibdelosporangiumaridum)的16SrDNA序列進行比對，比對結果發現，菌株HS807-AN-2396和荒漠擬孢囊菌(Kibdelosporangiumaridum)的同源性最高可達98.9％：菌株KibdelosporangiumaridumstrainDSM43828與菌株HS807-AN-2396的進化親源關係最為接近，兩者的同源性為98.9％。故菌株HS807-AN-2396鑑定為荒漠擬孢囊菌(Kibdelosporangiumaridum)。實施例5菌株HS807-AN-2396(CGMCCNo.10576)在250mL搖瓶中無胺基酸培養基中的發酵種子培養基(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性澱粉20.0、熱榨黃豆餅粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化鈉0.3和碳酸鈣1.2，pH7.2。種子瓶中種子培養基的裝量為20mL/250mL，培養溫度32℃，培養溼度50～60％，搖床振幅5cm，搖床轉速250rpm，培養周期39h。發酵培養基(g/L)：葡萄糖20.0、麥芽糊精70.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、酵母抽提粉5.0、棉籽餅粉30.0、氯化鈉0.6、碳酸鈣3.5、四水硫酸錳0.08和六水氯化鈷0.05，pH7.3。種子瓶至發酵瓶的移種量為10％，所述的百分比為體積百分比。發酵瓶中發酵培養基的裝量為20mL/250mL，培養溫度28℃，培養溼度40～50％，搖床振幅5cm，搖床轉速250rpm，培養周期212h。發酵結束後HPLC檢測發酵效價，A82846B達到923mg/L。實施例6菌株HS807-AN-2396(CGMCCNo.10576)在250mL搖瓶中添加L-酪氨酸、L-纈氨酸培養基中的發酵。種子培養基(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性澱粉20.0、熱榨黃豆餅粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化鈉0.3和碳酸鈣1.2，pH7.2。種子瓶的裝量為20ml/250ml，培養溫度28℃，培養溼度40～50％，搖床振幅5cm，搖床轉速250rpm，培養周期37h。發酵培養基(g/L)：葡萄糖20.0、麥芽糊精70.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸12.0、L-纈氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽餅粉30.0、氯化鈉0.6、碳酸鈣3.5、四水硫酸錳0.08和六水氯化鈷0.05，pH7.3。種子瓶至發酵瓶的移種量為10％，所述的百分比為體積百分比。發酵瓶中發酵培養基的裝量為20mL/250mL，培養溫度32℃，培養溼度50～60％，搖床振幅5cm，搖床轉速250rpm，培養周期210h。發酵結束後HPLC檢測發酵效價，A82846B達到1210mg/L。實施例7菌株HS807-AN-2396(CGMCCNo.10576)在50L罐上的發酵小試工藝研究以250ml搖瓶獲得的工藝參數為基礎，根據實施例1所述菌株HS807-AN-2396的特性，設計50L罐發酵工藝並進行優化，考察突變株生長代謝情況和A82846B的最佳產素能力。種子培養基(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性澱粉20.0、熱榨黃豆餅粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化鈉0.3、碳酸鈣1.2、THIX-298(購自煙臺恆鑫化工科技有限公司)0.2，pH7.2。其中，種子罐中種子培養基的裝量為10L/15L。種子罐控制工藝：培養溫度28～32℃，攪拌轉速200～600rpm，溶氧30％～50％，空氣流量0.5～1.5vvm，培養周期43h。發酵培養基(g/L)：葡萄糖20.0、麥芽糊精70.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸12.0、L-纈氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽餅粉30.0、氯化鈉0.6、碳酸鈣3.5、四水硫酸錳0.08、六水氯化鈷0.05、THIX-2980.6，pH7.3。種子罐至發酵罐的移種量為12％，所述的百分比為體積百分比。發酵罐中發酵培養基的裝量為35L，培養溫度28～32℃，攪拌轉速200～600rpm，溶氧30～50％，空氣流量0.5～1.0vvm，培養周期206h。發酵補料控制：流加L-酪氨酸，控制L-酪氨酸殘留量在4.0～6.0g/L。發酵過程中同時進行總糖、還原糖、氨基氮、菌絲濃度及發酵效價等的檢測。發酵結束後HPLC檢測發酵效價，A82846B達到2156mg/L。實施例8菌株HS807-AN-2396(CGMCCNo.10576)在50L罐上的發酵小試工藝研究種子培養基(g/L)：葡萄糖5.0、可溶性澱粉10.0、黃豆餅粉10.0、酵母抽提粉2.0、水解酪蛋白2.0、氯化鈉0.1、碳酸鈣0.9、THIX-2980.2，pH7.5。種子罐控制工藝：培養溫度28～32℃，攪拌轉速200～600rpm，溶氧30％～50％，空氣流量0.5～1.5vvm，培養周期41h。其中，種子罐中種子培養基的裝量為10L/15L。發酵培養基(g/L)：葡萄糖10.0、玉米澱粉100.0、蔗糖5.0、水解酪蛋白2.0、L-穀氨酸30.0、L-亮氨酸20.0、酵母抽提粉2.0、黃豆餅粉20.0、碳酸鈣5.5、四水硫酸錳0.02、THIX-2980.8，pH6.5。發酵罐中發酵培養基的裝量為35L，培養溫度28～32℃，攪拌轉速200～600rpm，溶氧30～50％，空氣流量0.5～1.0vvm，培養周期168h。發酵補料控制：流加L-纈氨酸，控制L-纈氨酸殘留量在0.0～20.0g/L。發酵過程中同時進行總糖、還原糖、氨基氮、菌絲濃度及發酵效價等的檢測，上述的發酵條件能夠發酵獲得A82846B。發酵結束後HPLC檢測發酵效價，A82846B達到2110mg/L。實施例9菌株HS807-AN-2396(CGMCCNo.10576)在50L罐上的發酵小試工藝研究種子培養基(g/L)：葡萄糖15.0、可溶性澱粉30.0、黃豆餅粉30.0、酵母抽提粉8.0、水解酪蛋白8.0、氯化鈉0.5、碳酸鈣1.5、THIX-2980.2，pH6.8。種子罐控制工藝：培養溫度28～32℃，攪拌轉速200～600rpm，溶氧30％～50％，空氣流量0.5～1.5vvm，培養周期41h。其中，種子罐中種子培養基的裝量為10L/15L。發酵培養基(g/L)：葡萄糖30.0、麥芽糊精60.0、糖蜜25.0、水解酪蛋白10.0、酵母抽提粉8.0、棉籽餅粉40.0、氯化鈉0.8、六水氯化鈷0.02、THIX-2980.8，pH7.8。發酵罐中發酵培養基的裝量為35L，培養溫度28～32℃，攪拌轉速200～600rpm，溶氧30～50％，空氣流量0.5～1.0vvm，培養周期240h。發酵補料控制：流加L-酪氨酸，控制L-酪氨酸殘留量在0.0～30.0g/L。發酵過程中同時進行總糖、還原糖、氨基氮、菌絲濃度及發酵效價等的檢測，上述的發酵條件能夠發酵獲得A82846B。發酵結束後HPLC檢測發酵效價，A82846B達到1967mg/L。實施例10菌株HS807-AN-2396(CGMCCNo.10576)在50L罐上的發酵小試工藝研究種子培養基(g/L)：葡萄糖15.0、可溶性澱粉30.0、黃豆餅粉30.0、酵母抽提粉8.0、水解酪蛋白8.0、氯化鈉0.5、碳酸鈣1.5、THIX-2980.2，pH6.8。種子罐控制工藝：培養溫度28～32℃，攪拌轉速200～600rpm，溶氧30％～50％，空氣流量0.5～1.5vvm，培養周期41h。其中，種子罐中種子培養基的裝量為10L/15L。發酵培養基(g/L)：葡萄糖30.0、麥芽糊精100.0、糖蜜5.0、水解酪蛋白10.0、酵母抽提粉8.0、棉籽餅粉20.0、氯化鈉0.4、碳酸鈣1.5、四水硫酸錳0.14、六水氯化鈷0.08，pH7.5。發酵罐中發酵培養基的裝量為35L，培養溫度28～32℃，攪拌轉速200～600rpm，溶氧30～50％，空氣流量0.5～1.0vvm，培養周期240h。發酵補料控制：流加L-酪氨酸，控制L-酪氨酸殘留量0.0～30.0g/L。發酵過程中同時進行總糖、還原糖、氨基氮、菌絲濃度及發酵效價等的 檢測，上述的發酵條件能夠發酵獲得A82846B。發酵結束後HPLC檢測發酵效價，A82846B達到2016mg/L。實施例11菌株HS807-AN-2396(CGMCCNo.10576)在50L罐上的發酵小試工藝研究種子培養基(g/L)：葡萄糖15.0、可溶性澱粉30.0、黃豆餅粉30.0、酵母抽提粉8.0、水解酪蛋白8.0、氯化鈉0.5、碳酸鈣1.5、THIX-2980.2，pH6.8。種子罐控制工藝：培養溫度28～32℃，攪拌轉速200～600rpm，溶氧30％～50％，空氣流量0.5～1.5vvm，培養周期41h。其中，種子罐中種子培養基的裝量為10L/15L。發酵培養基(g/L)：葡萄糖30.0、麥芽糊精60.0、糖蜜25.0、水解酪蛋白10.0、酵母抽提粉8.0、棉籽餅粉40.0、氯化鈉0.4、碳酸鈣1.5，pH5.0。發酵罐中發酵培養基的裝量為35L，培養溫度28～32℃，攪拌轉速200～600rpm，溶氧30～50％，空氣流量0.5～1.0vvm，培養周期240h。發酵補料控制：流加L-酪氨酸，控制L-酪氨酸殘留量在2.0～6.0g/L。發酵過程中同時進行總糖、還原糖、氨基氮、菌絲濃度及發酵效價等的檢測，上述的發酵條件能夠發酵獲得A82846B。發酵結束後HPLC檢測發酵效價，A82846B達到1954mg/L。實施例12菌株HS807-AN-2396(CGMCCNo.10576)在50L罐上的發酵小試工藝研究種子培養基(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性澱粉20.0、熱榨黃豆餅粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化鈉0.3、碳酸鈣1.2、THIX-298(購自煙臺恆鑫化工科技有限公司)0.2，pH7.2。其中，種子罐中種子培養基的裝量為10L/15L。種子罐控制工藝：培養溫度28～32℃，攪拌轉速200～600rpm，溶氧30％～50％，空氣流量0.5～1.5vvm，培養周期43h。其中，種子罐中種子培養基的裝量為10L/15L。發酵培養基(g/L)：葡萄糖20.0、麥芽糊精70.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸3.0、L-纈氨酸3.0、L-穀氨酸3.0、L-亮氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽餅粉30.0、氯化鈉0.6、碳酸鈣3.5、四水硫酸錳0.08、六水氯化鈷0.05、THIX-2980.2，pH7.5。種子罐至發酵罐的移種量為12％，所述的百分比為體積百分比。發酵罐中發酵培養基的裝量為35L，培養溫度25℃，攪拌轉速200～600rpm，溶氧30～50％，空氣流量0.5～1.0vvm，培養周期206h。發酵補料控制：流加L-酪氨酸，控制L-酪氨酸殘留量在4.0～6.0g/L。發酵過程中同時進行總糖、還原糖、氨基氮、菌絲濃度及發酵效價等的檢測。發酵結束後HPLC檢測發酵效價，A82846B達到1791mg/L。實施例13菌株HS807-AN-2396(CGMCCNo.10576)在50L罐上的發酵小試工藝研究種子培養基(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性澱粉20.0、熱榨黃豆餅粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化鈉0.3、碳酸鈣1.2、THIX-298(購自煙臺恆鑫化工科技有限公司)0.2，pH7.2。其中，種子罐中種子培養基的裝量為10L/15L。種子罐控制工藝：培養溫度28～32℃，攪拌轉速200～600rpm，溶氧30％～50％，空氣流量0.5～1.5vvm，培養周期43h。其中，種子罐中種子培養基的裝量為10L/15L。發酵培養基(g/L)：葡萄糖20.0、麥芽糊精70.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸30.0、L-纈氨酸20.0、蛋白腖5.0、棉籽餅粉30.0、氯化鈉0.6、碳酸鈣3.5、四水硫酸錳0.08、六水氯化鈷0.05、THIX-2980.2，pH6.0。種子罐至發酵罐的移種量為12％，所述的百分比為體積百分比。發酵罐中發酵培養基的裝量為35L，培養溫度34℃，攪拌轉速200～600rpm，溶氧30～50％，空氣流量0.5～1.0vvm，培養周期206h。發酵補料控制：流加L-酪氨酸，控制L-酪氨酸殘留量在4.0～6.0g/L。發酵過程中同時進行總糖、還原糖、氨基氮、菌絲濃度及發酵效價等的 檢測。發酵結束後HPLC檢測發酵效價，A82846B達到1563mg/L。實施例14菌株HS807-AN-2396(CGMCCNo.10576)在5000L罐上的發酵中試工藝研究以50L發酵罐獲得的工藝參數為基礎，根據實施例1所述菌株HS807-AN-2396的特性，設計5000L罐發酵工藝並進行優化，考察突變株生長代謝情況和A82846B的最佳產素能力。種子培養基(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性澱粉20.0、熱榨黃豆餅粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化鈉0.3、碳酸鈣1.2、THIX-2980.2，pH7.2。種子罐控制工藝：培養溫度28～32℃，攪拌轉速30～150rpm，溶氧30～40％，空氣流量0.2～0.1vvm，培養周期41h。其中，種子罐中種子培養基的裝量為300L/500L。發酵培養基(g/L)：葡萄糖20.0、麥芽糊精80.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽餅粉30.0、氯化鈉0.6、碳酸鈣3.5、四水硫酸錳0.08、六水氯化鈷0.05和消泡劑THIX-2980.4，pH7.5。種子罐至發酵罐的移種量為10％，所述的百分比為體積百分比。發酵罐中發酵培養基的裝量為3500L：培養溫度28～32℃，攪拌轉速30～150rpm，溶氧30～40％，空氣流量0.2～1.0vvm，培養周期202h。發酵補料控制：流加L-酪氨酸，控制L-酪氨酸殘留量在4.0～6.0g/L。發酵過程中同時進行總糖、還原糖、氨基氮、菌絲濃度及發酵效價等的檢測。發酵結束後HPLC檢測發酵效價，A82846B達到2199mg/L。實施例15菌株HS807-AN-2396(CGMCCNo.10576)在60m3罐上的發酵產業化放大以5000L發酵罐獲得的工藝參數為基礎，根據實施例1所述菌株HS807-AN-2396的特性，設計60m3罐發酵工藝並進行優化，考察突變株生長代謝情況和A82846B的最佳產素能力。種子培養基(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性澱粉20.0、熱榨黃豆餅粉20.0、 酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化鈉0.3、碳酸鈣1.2、THIX-2980.2，pH7.2。種子罐控制工藝：培養溫度28～32℃，攪拌轉速50～200rpm，溶氧30～50％，空氣流量0.2～1.0vvm，培養周期41h。其中，種子罐中種子培養基的裝量為5m3/15m3。發酵培養基(g/L)：葡萄糖20.0、麥芽糊精80.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸12.0、L-纈氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽餅粉30.0、氯化鈉0.6、碳酸鈣3.5、四水硫酸錳0.08、六水氯化鈷0.05、THIX-2980.2，pH7.5。種子罐至發酵罐的移種量為12％，所述的百分比為體積百分比。發酵罐中發酵培養基的裝量為42m3：培養溫度28～32℃，攪拌轉速30～120rpm，溶氧30～35％，空氣流量0.1～0.8vvm，培養周期192h。發酵補料控制：流加L-酪氨酸，控制L-酪氨酸殘留量在4.0～6.0g/L。發酵過程中同時進行總糖、還原糖、氨基氮、菌絲濃度及發酵效價等的檢測。60m3罐中按上述培養發酵條件發酵菌株HS807-AN-2396的發酵代謝曲線參見圖4。發酵結束後HPLC檢測發酵效價，A82846B達到2315mg/L。應理解，在閱讀了本發明的上述內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。當前第1頁1 2 3