一種快速獲取樹突狀細胞疫苗的製備方法及其應用的製作方法
2023-11-03 14:27:27 1
專利名稱：一種快速獲取樹突狀細胞疫苗的製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種快速獲取樹突狀細胞疫苗的製備方法。本發明涉及的促進人外周血、骨髓和臍血中單個核細胞快速誘導並負載腫瘤特異糖蛋白為樹突狀細胞疫苗，高表達共刺激分子，具有激活機體效應性T淋巴細胞，可用於各類癌症包括實體瘤和血液腫瘤在內的免疫治療。
背景技術：
目前，癌症的細胞免疫治療給患者提供繼三大常規治療的「第四種模式」，沒有放
化療帶來的巨大毒副作用，達到了相對安全，提高了患者生活品質，有尊嚴的治療方式。樹突狀細胞在該細胞免疫治療中起著主要作用，並在臨床治療中應用。人體內每一個糖基轉移酶均有一個基因編碼，每個糖基轉移酶均催化特定的糖苷鍵的合成。如果合成糖鏈的糖基轉移酶的基因發生部分缺失、增加等突變，則可導致編碼異常的糖基轉移酶，從而使細胞發生癌變。這種變異的糖鏈能作為抗原並被相應的抗體識別，故稱其為糖鏈抗原。因其主要且大量的在癌細胞中產生，正常組織或良性病變幾乎不產生，故有學者將其稱為癌抗原。糖鏈抗原15-3是從轉移性乳腺癌中分離的一種腫瘤相關抗原，CA15-3水平與乳腺癌的復發轉移密切相關，當CA15-3 > 100U/ml時，可肯定有轉移。CA54-9也是乳腺癌的標誌物，可見於50%乳腺癌、卵巢癌、40%前列腺癌、33%肺
癌患者中。CA50是一種唾液酸酯和唾液酸糖蛋白，正常組織中一般不存在，當細胞惡變時，糖基化酶被激活，造成細胞表面糖基結構改變而成為CA50標誌物。許多惡性腫瘤患者血中皆可升高，如66. 6%的肺癌、88. 2%的肝癌、68. 9%的胃癌、88. 5%的卵巢或子宮頸癌、94. 4%胰或膽管癌，其他如直腸癌、膀胱癌等皆有70 %以上是升高的。CA125最初認為是卵巢癌特異的，但深入研究，它也是一種廣譜的腫瘤標誌物。CA19-9為唾液酸化的乳-N-巖藻戊糖II，是一種類粘蛋白的糖蛋白成分。血清內正常值 95% )，異常升高也是在多種腫瘤出現，如79%胰腺癌、58%結腸癌、49%肝癌、67%胃癌、67%膽囊癌、肺癌、乳腺癌皆有10%左右是升高的。CA72-4是一種高分子量糖蛋白，正常人血清中含量< 6X103U/L，異常升高在各種消化道腫瘤、卵巢癌均可產生。對於胃癌的檢測特異性較高，CA242是一種唾液酸化的鞘糖脂類抗原，幾乎總是和CA50 —起表達，但兩者受不同的單克隆抗體識別。對胰腺癌的診斷，CA242優於CA19-9，敏感性可達66% 100%，對大腸癌的敏感性也達60% 72%。CA242的敏感性由高至低依次為肝癌、胃癌、大腸癌、胰腺癌。TAG-72是一種分子量大於1，OOOKDa的粘液蛋白，除分泌腺上皮外，其它正常上皮一般不表達，主要用於結腸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、內膜癌和肺癌的研究。亦可用於肺癌(TAG-72+)和惡性間皮瘤(TAG-72_)的鑑別診斷。
針對以靶向腫瘤特異表達糖鏈抗原進行腫瘤臨床治療，發揮特異性的抗腫瘤免疫應答，本發明不需要進行腫瘤抗原表位多肽的篩選以及受HLA-A2陽性的限制，採用了體外GM-CSF和IFN-α誘導並直接負載一個或多個腫瘤特異糖鏈蛋白，快速、簡便獲取樹突狀細胞疫苗，從而促進樹突狀細胞具有更好的靶向抗腫瘤免疫應答作用。
發明內容
現有技術主要通過兩步法外誘導和成熟過程獲得樹突狀細胞疫苗，培養時間為7天，操作複雜。本發明技術一步法獲取樹突狀細胞，不需要進行腫瘤抗原表位多肽的篩選以及受HLA-A2陽性的限制，通過體外直接誘導和負載一個或多個腫瘤特異糖鏈蛋白，激發樹突狀細胞更好的靶向抗腫瘤免疫應答作用。本發明涉及一種快速獲取樹突狀細胞疫苗的製備方法，其特徵在於，包括如下工序在人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、幹擾素-a (IFN- α )培養條件下，並直接負載一個或多個腫瘤特異糖鏈蛋白，獲取樹突狀細胞疫苗。 本發明所述的腫瘤特異糖鏈抗原優選CA72-4、CA50、CA24-2、CA 15-3, CA24-2、CA19-9、CA12-5、腫瘤相關糖蛋白-72 (Tumor-associated Glycoprotein-72, TAG-72)等。本發明所採用的培養瓶優選6孔培養板、25cm2或75cm2培養瓶，或選用塑料培養皿。優選地，本發明所述方法為單個核細胞用RPMI1640培養基重懸，並加入6孔板中貼壁；在37°C,5% CO2培養箱中孵育90min後，未貼壁細胞洗滌收集下來；貼壁細胞加入培養基誘導培養，該培養基含 1000IU-5000IU/mLGM-CSF、100IU-2000IU/mL IFN-α、1Χ 非必需胺基酸、I X丙酮酸鈉，以及體積比5%自體血清；於37°C、5% CO2培養箱中培養；在培養到第三天時細胞半量更換新鮮培養基，該新鮮培養基含1000IU-5000IU/mL GM-CSF,500IU-2000IU/mL IFN-α ;並添加50ng/mL-50ug/mL —個或多個腫瘤特異糖鏈抗原，負載於樹突狀細胞，於37°C、5% CO2培養箱中培養過夜；培養到第五天收穫樹突狀細胞疫苗；其高表達共刺激分子⑶80、⑶83和⑶86。其中，⑶80+/⑶Ilc+細胞為98. 0%，CD86+/CDllc 細胞為 85. 2%，CD83+/CDllc+ 細胞為 84. 3% (高表達)。更優選地，單個核細胞用RPMI1640培養基重懸，並加入6孔板中貼壁；在37°〇、5% CO2培養箱中孵育90min後，未貼壁細胞洗滌收集下來；貼壁細胞加入培養基誘導培養，該培養基含有1500IU/mLGM-CSF、500IU/mL IFN-α、1Χ非必需胺基酸、I X丙酮酸鈉、5%的自體血清；於37°C、5% CO2培養箱中培養；在培養到第三天時細胞半量更換新鮮培養基該新鮮培養基含1500IU/mLGM-CSF、500IU/mL IFN-α ;並添加200ng/mL—個或多個腫瘤特異糖鏈抗原，負載於樹突狀細胞，於37°C、5% CO2培養箱中培養過夜；培養到第五天收穫樹突狀細胞疫苗；其中，優選的細胞活率檢測方法為計算培養最後一天的活細胞數。取ImL最後一天培養的培養液，1000rpm、4°C下離心10分鐘，細胞用培養基重懸，取20ul細胞液用I XPBS稀釋20倍，稀釋液加入I倍體積的苔盼蘭溶液，混勻後加入到細胞計數板，於倒置顯微鏡下觀察計數，藍色染色的為死細胞，不染色的為活細胞，細胞活率達到98%以上。優選的細胞表型檢測方法為取苔盼蘭染色計數後的3X IO6細胞，分三組，第一組分別添加到有20 μ L FITC標記鼠抗人⑶80單抗、20 μ LPE標記鼠抗人HLA-DR單抗和20 μ LPerCP標記鼠抗人⑶I Ic單抗；第二組分別添加20 μ L FITC標記鼠抗人⑶86單抗、20 μ LPE標記鼠抗人⑶83單抗和20 μ LPerCP標記鼠抗人⑶I Ic單抗；第三組為同型對照，分別添加到有20 μ L FITC標記鼠IgGl、20 μ LPE標記鼠IgGl和20 μ LPerCP標記鼠IgGl。置於4°C冰箱染色30分鐘，然後用ImL的I X磷酸鹽緩衝液洗滌三次，最後用O. 5mL的I XPBS重懸洗滌後的細胞，所得洗滌後的細胞用FACSCalibur基本型流式細胞儀檢測。經檢測，CDllc+/HLA-DR+ 細胞為 98. O %，CD80+/CD1 Ic+ 細胞為 98. O %，CD86+/CD1 Ic 細胞為 85.2%，CD83+/CDlIc+細胞為84. 3% (高表達)。檢測結果表明通過本發明所述方法得到的細胞為成熟樹突狀細胞疫苗，並高表達各類共刺激分子。
圖I表示本發明快速獲取的樹突狀細胞的流式細胞圖；圖2表示本發明製備樹突狀細胞疫苗與現有技術對腫瘤細胞的抗腫瘤免疫應答作用。
具體實施例方式本發明發現通過在GM-CSF和IFN- Y的存在下培養骨髓、臍帶血或外周血來源的單個核細胞，並直接負載一個或多個腫瘤特異糖鏈抗原一步法獲得樹突狀細胞，不僅高表達常見共刺激分子CD80、CD83和CD86，能激發有效的抗腫瘤細胞免疫應答尤其是長期抗腫瘤效應，不需篩選獲得腫瘤特異糖鏈抗原的表位多肽以及不受HLA-A2配型限制。對本發明涉及的一種快速獲取樹突狀細胞疫苗的製造方法進行具體說明。本發明涉及在GM-CSF和IFN- Y的誘導存在下並直接負載一個或多個腫瘤特異糖鏈抗原一步法獲得樹突狀細胞為特徵的製造方法。本發明方法的特徵在於，包含如下工序，即在人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、幹擾素-α (IFN-α)培養條件下，並直接負載一個或多個腫瘤特異糖鏈蛋白，獲取樹突狀細胞疫苗。本發明採用培養板，培養瓶或塑料培養皿，優選6孔板、25cm2或75cm2培養瓶。本發明涉及樹突狀細胞的體外培養方法單個核細胞在基礎培養基中(含1000IU-5000IU/mL GM-CSF、100IU-2000IU/mL IFN- α ,1 X 非必需胺基酸 IX 丙酮酸鈉，以及體積比5%自體血清)，在培養到第三天時細胞半量更換新鮮培養基，該新鮮培養基含1000IU-5000IU/mL GM-CSF、100IU_2000IU/mL IFN-α ;並添加 50ng/mL_50ug/mL —個或多個腫瘤特異糖鏈抗原，負載於樹突狀細胞，於37°C、5% CO2培養箱中培養過夜；培養到第五天收穫樹突狀細胞疫苗；高表達共刺激分子⑶40、⑶80、⑶83和⑶86。作為本發明製造方法中使用的含有能誘導得到樹突狀細胞的單個核細胞，可例舉，由外周血、骨髓、臍帶血等分離得到的單個核細胞。上述單個核細胞無論是從生物體採集的新鮮單個核細胞或冷凍保存過的單個核細胞，均可用於本發明。本發明的製造方法中對負載樹突狀細胞的腫瘤特異糖鏈抗原的濃度和數量沒有特殊限制，但優選例如為50ng/mL-50ug/mL、特別是100-500ng/mL ;負載的腫瘤特異糖鏈抗原數量為1-5個，特別是2-3個。本發明的快速獲取樹突狀細胞疫苗的製備方法中使用的培養基，沒有特殊限制，可以使用樹突狀細胞培養等中能使用的公知的培養基，例如可以適當地選擇使用市售培養基。上述培養基除其原有的構成成分外，還可以含有細胞因子類、適當的蛋白質及其他成分。通常，本發明使用含有GM-CSF和IFN-α的培養基。GM-CSF在培養基中的使用濃度為1000IU-5000IU/mL，更優選1500IU-2500IU/mL。IFN-α在培養基中的使用濃度為100IU-2000IU/mL,優選 200IU/mL-1000IU/mL。在培養基中可以添加血清或血漿進行培養。它們在培養基中的添加量不受特殊限制，如大於O容量％至20容量％，且可以根據不同的培養階段而改變血清或血漿的用量。例如，可以階段性減少血清或血漿濃度來使用。另外，作為血清或血漿的來源，可以是自己(意味著與所培養的細胞來源相同)或非自己(意味著與所培養的細胞的來源不同)中的任一種，從安全性的觀點出發，優選自己來源的血清或血漿。另外，也可以添加如人血清白蛋白之類經分離純化的血清成分。本發明的快速獲取樹突狀細胞疫苗的製備除了使用腫瘤特異糖鏈抗原外，使用上述各種成分及培養基來實施。本發明中使用的培養開始時的細胞數沒有特殊限制，例如優選 2X 106cell/mL-lX109cells/mL、更優選 5X106cell/mL-5X107cells/mL。另外，培養條件也沒有特殊限制，可以使用通常的細胞培養中使用的條件。例如，可在37°C、5%C02等條 件下培養。還可以實施如下等操作間隔適當的時間添加新鮮培養基來稀釋細胞培養液，或更換培養基，或更換細胞培養用器材等。本發明的製備方法中可以使用例如細胞培養板、培養皿、培養瓶、袋子等細胞培養用器材(容器)。作為細胞培養用器材，優選細胞培養板和培養瓶。本發明的快速獲取樹突狀細胞疫苗的製備方法中，對培養時間可以實施總天數為
3-6天、優選5天的培養。本發明還提供樹突狀細胞疫苗在生物體內發揮更強的抗腫瘤免疫應答，達到很好的治療效果。此外，上述樹突狀細胞還具有如下優點，即激活記憶性T淋巴細胞，產生長期抗腫瘤免疫效應，因此非常利於在治療上應用。以下，結合實施例對本發明做更具體的描述，但本發明不限於此。實施例一骨髓來源單個核細胞快速獲取樹突細胞疫苗的體外培養來自捐獻者的20mL骨髓經FicolΙ-Hypaque密度梯度離心，得到單個核細胞。外周血單個核細胞用RPMI1640培養基重懸，並加入6孔板中貼壁。在37°C、5% CO2培養箱中孵育60min後，未貼壁細胞洗滌收集下來。貼壁細胞加入完全培養基RPMI1640誘導培養，含有1500IU/mL GM_CSF、500IU/mLIFN-α、1Χ非必需胺基酸、I X丙酮酸鈉和5%的自體血清，放置37°C、5% CO2培養箱中培養。在培養到第三天時細胞半量更換新鮮培養基該新鮮培養基含1500IU/mL GM_CSF、500IU/mL IFN-α ;並添加200ng/mL —個或多個腫瘤特異糖鏈抗原，負載於樹突狀細胞，於37°C、5% CO2培養箱中培養過夜；培養到第五天收穫樹突狀細胞疫苗。所述的腫瘤特異糖鏈抗原選自CA72-4、CA50、CA24-2、CA 15-3, CA24-2、CA 19-9,CA12-5、TAG-72 等。計算培養最後一天的活細胞數。取ImL最後一天培養的培養液，1000rpm、4°C下離心10分鐘，細胞用RPMI1640培養基重懸，取20 μ L細胞液用lXPBS(pH7. 4)稀釋20倍，稀釋液加入I倍體積的苔盼蘭溶液，混勻後加入到細胞計數板，於倒置顯微鏡下觀察計數，藍色染色的為死細胞，不染色的為活細胞，細胞活率達到98%以上。取苔盼蘭染色計數後的3 X IO6細胞，分三組，第一組分別添加到有20 μ LFITC標記鼠抗人⑶80單抗、20 μ L PE標記鼠抗人HLA-DR單抗和20 μ L PerCP標記鼠抗人⑶IIc單抗；第二組分別添加20 μ L FITC標記鼠抗人⑶86單抗、20 μ L PE標記鼠抗人⑶83單抗和20 μ L PerCP標記鼠抗人⑶Ilc單抗；第三組為同型對照，分別添加到有20 μ L FITC標記鼠IgGl、20 μ L PE標記鼠IgGl和20 μ L PerCP標記鼠IgGl (BD公司)。置於4°C冰箱染色30分鐘，然後用ImL的IX磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌三次，最後用O. 5mL的IXPBS重懸洗滌後的細胞，所得洗滌後的細胞用FACSCalibur基本型流式細胞儀檢測。圖I結果顯示，CDllc+/HLA-DR+ 細胞為 98. 0%，CD80+/CDllc+ 細胞為 98. 0%，CD86+/CDllc 細胞為85.2%,⑶83+/⑶Ilc+細胞為84. 3% (高表達)，表明通過本發明技術得到細胞為成熟樹突狀細胞疫苗，並高表達共刺激分子。實施二外周血來源單個核細胞快速獲取樹突細胞疫苗的體外培養 來自捐獻者的50mL外周血經Ficoll-Hypaque密度梯度離心，得到單個核細胞。外周血單個核細胞用RPMI1640培養基重懸，並加入6孔板中貼壁。在37°C、5% CO2培養箱中孵育60min後，未貼壁細胞洗滌收集下來。貼壁細胞加入完全培養基RPMI1640誘導培養，含有1500IU/mL GM_CSF、500IU/mLIFN-α、1Χ非必需胺基酸、I X丙酮酸鈉和5%的自體血清，放置37°C、5% CO2培養箱中培養。在培養到第三天時細胞半量更換新鮮培養基，該新鮮培養基含1500IU/mL GM_CSF、500IU/mL IFN-α ;並添加200ng/mL —個或多個腫瘤特異糖鏈抗原，負載樹突狀細胞，於37°C、5% CO2培養箱中培養過夜；培養到第五天收穫樹突狀細胞疫苗。所述的腫瘤特異糖鏈抗原選自CA72-4、CA50、CA24-2、CA 15-3, CA24-2、CA 19-9,CA12-5、TAG-72 等。採用實施例一中苔盼蘭染色計算培養最後一天的樹突狀細胞數和細胞活率，以及樹突狀細胞通過流式抗體染色和流式細胞儀檢測，分析細胞表型。表一
患者樹突狀細胞活率 CDllc+/ CD80+/ CD86+/ CD83+/__^___HLA-DR+ CDllc+ CDllc+ CDllc+
患者一 8.4 X IO6 99.1% 98.5%97.7% 92.4% 90.4%
患者二 9.5 X IO6 99.6% 95.7%94.5% 87.5% 86.7%
患者三 10.6 X IQ6 98.4% 95.5%95.0% 86.8% 85.8%
患者四 9.8 X IO6 98.7% 96.1%__94.2% 89.5% 87.1%實施三本發明獲得樹突狀細胞的抗腫瘤免疫應答(與現有技術比對)應用本發明中實施例一或二，製備獲得樹突狀細胞進行細胞毒性活性實驗(CTL)。應用現有技術製備獲得樹突狀細胞主要為兩步法，即第一步通過GM-CSF和白介素4體外培養，誘導得到未成熟樹突狀細胞，第二步將腫瘤抗原負載樹突狀細胞，並在脂多糖或腫瘤壞死因子α等作用獲得成熟樹突狀細胞，共培養7-10天。在6孔板內，仍以含5%小牛血清的RPMI1640為培養基，按上述抗原負載的成熟樹突狀細胞T細胞=1 20的比例混合上述抗原負載的成熟樹突狀細胞和T細胞，同時加入GM-CSF (終濃度為800IU/mL)和IL_4(終濃度為500IU/mL)，共培養7天，其間每隔I天均半量換液(含5%小牛血清、終濃度為800U/mL的GM-CSF和終濃度為50IU/mL的IL-4的RPMI1640培養基)，得到CTL細胞。選擇相應的腫瘤細胞(如肝癌MMC-7721和肺癌A549)作為靶細胞，用51Cr標記，即靶細胞(2X 106/mL)通過與300 μ Ci51Cr在RPMI1640培養基中37°C孵育2小時。標記好的靶細胞用IXPBS洗滌三次，並最終用RPMI 1640(含10%小牛血清)重懸到2 X IO5的濃度。以每孔2X IO4個標記的靶細胞(O. ImL)添加到96孔板的孔中。將上述產生的CTL細胞(效應細胞)分別以2.5 1、5 UlO 1、20 I和40 I的效靶比加入對應的孔中，在37°C孵育4小時。孵育後，取上清75 μ L組分用α放 射計數器計數。特異的51Cr釋放的百分比根據下述的公式進行計算。
(檢測的每分脈衝數自發釋放的每分脈衝數)
權利要求
1.ー種快速獲取樹突狀細胞疫苗的製備方法，其特徵在於，單個核細胞用RPMI1640培養基重懸，並加入6孔板中貼壁；在37°C、5% CO2培養箱中孵育60min後，未貼壁細胞洗滌收集下來；貼壁細胞加入培養基誘導培養，該培養基含有1500IU/mLGM-CSF、500IU/mLIFN-a、1X非必需胺基酸、IX丙酮酸鈉和5%的自體血清；於37で、5%0)2培養箱中培養；在培養到第三天時細胞半量更換新鮮培養基，該新鮮培養基含1500IU/mL GM-CSF、500IU/mLIFN- a ;並添加200ng/mL—個或多個腫瘤特異糖鏈抗原，負載於樹突狀細胞，於37°C、5% CO2培養箱中培養過夜；培養到第五天收穫具有抗腫瘤作用的樹突狀細胞疫苗； 所述的樹突狀細胞疫苗高表達共刺激分子⑶80、⑶83和⑶86 ； 將所述的樹突狀細胞疫苗進行細胞活率和細胞表型檢測； 所述細胞活率檢測方法為計算培養最後一天的活細胞數；取ImL最後一天培養的培養液，1000rpm、4°C下離心10分鐘，細胞用培養基重懸，取20ul細胞液周I XPBS稀釋20倍，稀釋液加入I倍體積的苔盼蘭溶液，混勻後加入到細胞計數板，於倒置顯微鏡下觀察計數，藍色染色的為死細胞，不染色的為活細胞，細胞活率達到98%以上； 所述細胞表型檢測方法為取苔盼蘭染色計數後的3X IO6細胞，分三組，第一組分別添加到有20 ii L FITC標記鼠抗人CD80單抗、20 ii LPE標記鼠抗人HLA-DR單抗和20 ii L PerCP標記鼠抗人⑶I Ic單抗；第二組分別添加20 u LFITC標記鼠抗人⑶86單抗、20 u L PE標記鼠抗人⑶83單抗和20 ii L PerCP標記鼠抗人⑶Ilc單抗；第三組為同型對照，分別添加到有20iiL FITC標記鼠IgGl、20 ii LPE標記鼠IgGl和20 y L PerCP標記鼠IgGl ;置於4°C冰箱染色30分鐘，然後用ImL的I X磷酸鹽緩衝液洗滌三次，最後用0. 5mL的I XPBS重懸洗滌後的細胞，所得洗滌後的細胞用FACSCalibur基本型流式細胞儀檢測。
2.根據權利要求I所述的製備方法，其特徵在幹，所述的腫瘤特異糖鏈抗原包括CA72-4、CA50、CA24-2、CA 15-3, CA24-2、CA 19-9, CA12-5、腫瘤相關糖蛋白-72 等。
3.根據權利要求1-2所述方法製備的樹突狀細胞疫苗在基礎研究和臨床抗腫瘤中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種快速獲取樹突狀細胞疫苗的製備方法，其中包括如下工序在人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和幹擾素α培養條件下，並負載一個或多個腫瘤特異糖蛋白，快速、簡便獲得具有抗腫瘤作用的樹突狀細胞疫苗。該樹突狀細胞疫苗高表達共刺激分子CD80、CD83和CD86。其中，CD80+/CD11c+細胞為98.0％，CD86+/CD11c細胞為85.2％，CD83+/CD11c+細胞為84.3％。本發明還提供了一種含通過上述方法而得到的樹突狀細胞疫苗的基礎研究和臨床應用中。
文檔編號A61P35/00GK102813916SQ20121032470
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月5日 優先權日2012年9月5日
發明者李一民, 李一漢 申請人:北京希普生國際生物醫學研究院