STRADB在哮喘早期診斷中的應用的製作方法

2023-07-31 10:20:16

本發明屬於生物醫藥領域，涉及stradb在哮喘早期診斷中的應用。

背景技術：

支氣管哮喘簡稱哮喘，是臨床診療中比較常見的呼吸系統疾病類型，其是一種複雜的綜合症，以下遊氣道的慢性炎症為主要特徵，通常還伴隨著肺部氣道狹小，氣道重塑，氣道高反應性，以及反覆發作的咳嗽，哮鳴，胸悶，氣急。根據這些這些症候出現的頻率和嚴重程度，人們把哮喘分為：輕微，中度，重度三種不同的等級。哮喘的反覆發作還會進一步誘發併發症，如：肺氣腫，慢性阻塞性肺病，肺心病，呼吸衰竭，心功能衰竭等。目前，全球有大約3億人口患有哮喘並且患病率還有逐年增加的趨勢。哮喘對患者的日常生活及工作都會產生嚴重影響，同時，哮喘也給個人和社會帶來了巨大的經濟負擔。哮喘有兩個最重要的兩個特徵是氣管平滑肌細胞的收縮性增強以及氣道的興奮性應答。由於哮喘的發病機制複雜，誘發以及參與發病的因素很多，至今尚未對其機制解釋清楚。

哮喘是由免疫、遺傳和環境等多重因素共同作用的結果，其發生發展過程中有多種細胞、炎症遞質等參與，且極易長期反覆發作。既往的研究多集中在th2介導的嗜酸性粒細胞性炎症。近幾年，隨著遺傳學和分子生物學的不斷發展，哮喘遺傳病因學成為研究的熱點。對哮喘遺傳機制及其相關基因研究已逐步深入，基因的改變在哮喘的發生發展過程中起著重要的作用。

哮喘的傳統治療主要使用糖皮質激素、支氣管擴張劑，但是部分患者的病情得不到緩解，因此改進對哮喘的診斷和監測以篩選出易感個體實施早期預防治療具有重要的意義。傳統的診斷技術依賴於臨床表現、肺功能檢查或峰流速測量，但是上述診斷方法不易檢出早期症狀不明顯的哮喘或者容易誤診。隨著生物技術的發展，生物標誌物的分析為哮喘的早期診斷提供了一種新途徑。

技術實現要素：

本發明的目的之一，提供一種哮喘的生物標誌物，應用於哮喘的早期診斷，以期實現哮喘的預防。

本發明的目的之二，提供一種診斷哮喘的產品，所述產品能夠實現哮喘患者的特異性診斷。

本發明提供了stradb基因在製備診斷哮喘的產品中的應用。其中，stradb基因在哮喘患者中表達下調。

進一步，所述產品包括檢測樣本中stradb表達水平的試劑。

進一步，所述試劑包括：通過rt-pcr、實時定量pcr、免疫檢測、原位雜交或晶片檢測stradb表達水平的試劑。

進一步，所述通過rt-pcr檢測stradb表達水平的試劑至少包括一對特異擴增stradb基因的引物；所述通過實時定量pcr檢測stradb表達水平的試劑至少包括一對特異擴增stradb基因的引物；所述通過免疫檢測stradb表達水平的試劑包括與stradb蛋白特異性結合的抗體和/或配體；所述通過原位雜交檢測stradb表達水平的試劑包括與stradb基因的核酸序列雜交的探針；所述通過晶片檢測stradb表達水平的試劑包括與stradb基因核酸序列雜交的探針、或與stradb蛋白特異性結合的抗體和/或配體。

在本發明中，「樣本」是包含細胞或細胞物質的可從中獲取核酸、多肽、或其它分析物的樣本。生物樣本的示例非限定性地包括：尿、血液、血清、血漿、腦脊髓液、胸膜液、支氣管灌洗、痰、腹腔液、膀胱衝洗、分泌物(例如，乳腺分泌物)、口腔衝洗、拭子(例如，口腔拭子)、分離細胞、組織樣本、觸碰準備物、以及細針穿刺物。優選的，所述樣本為人外周血。

本發明提供了一種診斷哮喘的產品，包括製劑、晶片或試劑盒，其中，所述製劑、晶片或試劑盒包括檢測stradb表達水平的試劑。

進一步，所述晶片中檢測stradb表達水平的試劑包括特異性識別stradb基因的探針，或特異性結合stradb編碼的蛋白的抗體或配體。所述晶片可用於檢測包括stradb在內的多個基因或蛋白(例如，與哮喘相關的多個基因或蛋白)的表達水平。

進一步，所述試劑盒中檢測stradb表達水平的試劑包括異性擴增stradb基因的引物；或特異性識別stradb基因的探針；或特異性結合stradb編碼的蛋白的抗體或配體。

在本發明的具體實施例中，所述特異性擴增stradb基因的引物序列如seqseqidno.3和seqidno.4所示。

進一步，所述試劑還包括sybrgreen聚合酶鏈式反應體系、用於擴增管家基因的引物對；所述sybrgreen聚合酶鏈式反應體系包含：pcr緩衝液、dntps、sybrgreen螢光染料。

進一步，所述檢測試劑盒還包括使用說明書或標籤。

在本發明中，所述試劑盒可用於檢測包括stradb在內的多個基因或蛋白(例如，與哮喘相關的多個基因或蛋白)的表達水平。

附圖說明

圖1是利用qpcr檢測stradb基因在哮喘患者中的表達情況圖；

圖2是利用免疫印跡在蛋白水平上檢測stradb基因的差異表達的圖。

具體實施方式

本發明經過廣泛而深入的研究，首次發現了stradb在哮喘患者和正常人中呈現顯著性差異表達，為哮喘的早期檢測尋找更好的途徑和方法。

生物標誌物

「生物標誌物」也稱為「分子標誌物」，是在組織或細胞中的表達水平與正常或健康細胞或組織的表達水平相比發生改變的任何基因或蛋白。

本領域技術人員將認識到，本發明的實用性並不局限於對本發明的標誌物基因的任何特定變體的基因表達進行定量。作為非限制性的實例，stradb包括包含seqidno.2的多肽和其它stradb天然序列多肽，諸如天然存在變體和天然序列多肽，其由seqidno.1所示的核苷酸序列編碼。

本發明所述的分子標誌物包括基因和蛋白。此類標誌物包括含有編碼分子標誌物的核酸序列或此序列的互補序列的完整或部分序列的dna。分子標誌物核酸還包括含有所關注的任何核酸序列的完整或部分序列的rna。分子標誌物蛋白是由本發明的dna分子標誌物編碼的或對應於本發明的dna分子標誌物的蛋白。分子標誌物蛋白包含任何分子標誌物蛋白或多肽的完整或部分胺基酸序列。分子標誌物基因和蛋白的片段和變體也包括在本發明的範圍內。

檢測技術

本發明可以使用本領域普通技術人員已知的多種核酸以及蛋白技術進行檢測，這些技術包括但不限於：核酸測序、核酸雜交、核酸擴增技術、蛋白免疫技術。

本發明可在檢測前或與檢測同時地對核酸進行擴增。核酸擴增技術的示例性非限制性實例包括但不限於：聚合酶鏈式反應(pcr)、逆轉錄聚合酶鏈式反應(rt-pcr)、轉錄介導的擴增(tma)、連接酶鏈式反應(lcr)、鏈置換擴增(sda)和基於核酸序列的擴增(nasba)。本領域的普通技術人員將認識到，某些擴增技術(例如，pcr)需要在擴增前將rna逆轉錄成dna(例如，rt-pcr)，而其他擴增技術則直接擴增rna(例如，tma和nasba)。

通常，pcr使用變性、引物對與相反鏈的退火以及引物延伸的多個循環，以指數方式增加靶核酸序列的拷貝數；rt-pcr則將逆轉錄酶(rt)用於從mrna製備互補的dna(cdna)，然後將cdna通過pcr擴增以產生dna的多個拷貝；tma在基本上恆定的溫度、離子強度和ph的條件下自身催化地合成靶核酸序列的多個拷貝，其中靶序列的多個rna拷貝自身催化地生成另外的拷貝，tma任選地包括使用阻斷，部分、終止部分和其他修飾部分，以改善tma過程的靈敏度和準確度；lcr使用與靶核酸的相鄰區域雜交的兩組互補dna寡核苷酸。dna寡核苷酸在熱變性、雜交和連接的重複多個循環中通過dna連接酶共價連接，以產生可檢測的雙鏈連接寡核苷酸產物；sda使用以下步驟的多個循環：引物序列對與靶序列的相反鏈進行退火，在存在dntpαs下進行引物延伸以產生雙鏈半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸產物，半修飾的限制性內切酶識別位點進行的核酸內切酶介導的切刻，以及從切口3』端進行的聚合酶介導引的物延伸以置換現有鏈並產生供下一輪引物退火、切刻和鏈置換的鏈，從而引起產物的幾何擴增。

本發明中非擴增或擴增的核酸可通過任何常規的手段檢測。

本發明中的核酸雜交技術包括但不限於原位雜交(ish)、微陣列和southern或northern印跡。原位雜交(ish)是一種使用標記的互補dna或rna鏈作為探針以定位組織一部分或切片(原位)或者如果組織足夠小則為整個組織(全組織包埋ish)中的特異性dna或rna序列的雜交。dnaish可用於確定染色體的結構。rnaish用於測量和定位組織切片或全組織包埋內的mrna和其他轉錄本(例如，ncrna)。通常對樣本細胞和組織進行處理以原位固定靶轉錄本，並增加探針的進入。探針在高溫下與靶序列雜交，然後將多餘的探針洗掉。分別使用放射自顯影、螢光顯微術或免疫組織化學，對組織中用放射、螢光或抗原標記的鹼基標記的探針進行定位和定量。ish也可使用兩種或更多種通過放射性或其他非放射性標記物標記的探針，以同時檢測兩種或更多種轉錄本。

將southern和northern印跡分別用於檢測特異性dna或rna序列。使從樣本中提取的dna或rna斷裂，在基質凝膠上通過電泳分離，然後轉移到膜濾器上。使濾器結合的dna或rna與和所關注的序列互補的標記探針雜交。檢測結合到濾器的雜交探針。該程序的一種變化形式是反向northern印跡，其中固定到膜的底物核酸為分離的dna片段的集合，而探針是從組織提取並進行了標記的rna。

蛋白免疫技術包括夾心免疫測定，例如夾心elisa，其中使用識別生物標誌物上不同表位的兩種抗體進行該生物標誌物的檢測；放射免疫測定(ria)、直接、間接或對比酶聯免疫吸附測定(elisa)、酶免疫測定(eia)、螢光免疫測定(fia)、蛋白質印跡法、免疫沉澱法和基於任何顆粒的免疫測定(如使用金顆粒、銀顆粒或乳膠顆粒、磁性顆粒或量子點)。可例如在微量滴定板或條的形式中實施免疫法。

根據本發明的免疫法可基於，例如，以下方法中的任一種。

免疫沉澱法是最簡單的免疫測定方法；這種方法測量沉澱物的量，在試劑抗體已與樣本一起孵育並與其中存在的靶抗原反應以形成不溶性團聚體之後形成所述沉澱。免疫沉澱反應可以是定性的或是定量的。

在顆粒免疫測定中，多種抗體與該顆粒連接，且所述顆粒能夠同時結合很多抗原分子。這大大地加速了可見反應的速度。這允許生物標誌物的快速且靈敏的檢測。

在免疫比濁法(immunonephelometry)中，抗體和生物標誌物上的靶抗原的相互作用引起免疫複合物的形成，所述免疫複合物太小而不能沉澱。但是，這些複合物將散射入射光，這可使用比濁計來測量。可在反應的幾分鐘之內測定抗原(即生物標誌物)的濃度。

放射免疫測定(ria)法使用放射性同位素例如i125來標記抗原或抗體。所使用的同位素髮射γ射線，通常在除去非結合的(游離的)放射性標記之後測量所述射線。與其它的免疫測定相比較，ria的主要優勢在於更高的靈敏度、容易的信號檢測和確認的、快速的測定。主要的劣勢在於由放射物的使用引起的健康和安全風險和與維護許可放射物安全和處理程序相關的時間和費用。出於該原因，在常規臨床實驗室實踐中，ria已很大程度上被酶免疫測定所取代。

酶免疫測定(eia)發展為放射免疫測定(ria)的替代物。這些方法使用酶來標記抗體或靶抗原。eia的靈敏度接近ria的靈敏度，且不存在由放射性同位素引起的危險。用於檢測的最廣泛使用的eia方法之一是酶聯免疫吸附測定(elisa)。elisa方法可使用兩種抗體，其一對於靶抗原是特異性的，而另一與酶偶聯，酶底物的添加引起化學發光信號或螢光信號的產生。

螢光免疫測定(fia)指使用螢光標記或酶標記的免疫測定，所述螢光標記或酶標記作用在底物上以形成螢光產物。螢光測量固有地比比色(分光光度法的)測量更加靈敏。因此，fia方法具有比利用吸收(光密度)測量的eia方法更高的分析靈敏度。

化學發光免疫測定使用化學發光標記，當其被化學能激發時產生光；使用光檢測器測量發射。

因此，可使用熟知的方法進行根據本發明的免疫法。在本發明的生物標誌物的檢測中可使用任何直接(如使用傳感器晶片)或間接的方法。

晶片、試劑盒

術語「晶片」也稱為「陣列」，指包含連接的核酸或肽探針的固體支持物。陣列通常包含按照不同的已知位置連接至基底表面的多種不同的核酸或肽探針。這些陣列，也稱為「微陣列」，通常可以利用機械合成方法或光引導合成方法來產生這些陣列，所述光引導合成方法合併了光刻方法和固相合成方法的組合。陣列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝膠、聚合物表面、諸如光纖的纖維、玻璃或任何其它合適的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式來包裝陣列，從而允許進行全功能裝置的診斷或其它方式的操縱。

「微陣列」是雜交陣列原件有序排列在基質上，所述雜交陣列原件諸如聚核苷酸探針(例如寡核苷酸)或結合劑(例如抗體)。所述基質可以是固體基質，例如，玻璃或二氧化矽玻片、珠、纖維光學粘結劑或半固態基質，例如硝酸纖維素膜。核苷酸序列可以是dna、rna或其中的任何排列。

各種探針陣列已經描述在文獻中並且可以用於本發明上下文中檢測可能與本文所述表型相關的標誌物。例如，dna探針陣列晶片或較大的dna探針陣列晶片(否則，可以通過打斷晶片而獲得各個體晶片)用於本發明的一個實施方案。dna探針陣列晶片一般包含玻璃晶片，其上放置了高密度dna探針(短dna片段)陣列。這些晶片各自可以保持例如約6000萬個用於識別較長樣品dna序列(例如，來自個體或群體，例如，包含所關注的標誌物)的dna探針。用玻璃晶片上的dna探針組識別樣品dna通過dna雜交進行。當dna樣品與dna探針陣列雜交時，樣品結合於樣品dna序列互補的那些探針。通過評價個體樣品dna與那些探針更穩固地雜交，有可能確定已知的核酸序列是否存在於樣品中，由此確定核酸中發現的標誌物是否存在。還可以使用這一手段通過控制雜交條件以允許區別單一核苷酸，例如，用於snp鑑定和一種或多種snp的樣品基因分型來進行ash。陣列提供了一種同時(或串連)檢測多個多態性標誌物的便利性實施方案。

在本發明中，晶片包括基因晶片、蛋白晶片；所述基因晶片包括固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對應於stradb所示的部分或全部序列。所述蛋白晶片包括固相載體，以及固定在固相載體上的stradb編碼的蛋白的特異性抗體或配體。

「探針」指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結合的分子。除非另有指出，術語「探針」通常指能通過互補鹼基配對與另一多核苷酸(往往稱為「靶多核苷酸」)結合的多核苷酸探針。根據雜交條件的嚴格性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結合。探針可作直接或間接的標記，其範圍包括引物。雜交方式，包括，但不限於：溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。

上述探針具有與靶點基因的特定的鹼基序列互補的鹼基序列。這裡，所謂「互補」，只要是雜交即可，可以不是完全互補。這些多核苷酸通常相對於該特定的鹼基序列具有80％以上、優選90％以上、更優選95％以上、特別優選100％的同源性。這些探針可以是dna，也可以是rna，另外，可以為在其一部分或全部中核苷酸通過pna、lna、ena、gna、tna等人工核酸置換得到的多核苷酸。

本發明的配體可包含能夠特異性結合stradb的肽、抗體或其片段、或適配體或寡核苷酸。本發明中使用的針對上述stradb蛋白質的抗體以最廣義使用，而且具體涵蓋例如單克隆抗體、多克隆抗體、具有多表位特異性的抗體，多特異性抗體和抗體片段。此類抗體可以是嵌合的，人源化的，人的和合成的。

「單克隆抗體」在用於本文時指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體相同和/或結合相同表位，除了生產單克隆抗體的過程中可能產生的可能變體外，此類變體一般以極小量存在。此類單克隆抗體典型的包括包含結合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結合多肽序列在內的過程得到的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組dna克隆的集合中選擇獨特克隆。應當理解，選定的靶物結合序列可進一步改變，例如為了提高對靶物的親和力、將靶物結合序列人源化、提高其在細胞培養物中的產量、降低其在體內的免疫原性、創建多特異性抗體等，而且包含改變後的靶物結合序列的抗體也是本發明的單克隆抗體。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製備物不同，單克隆抗體製備物的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性以外，單克隆抗體製備物的優勢在於它們一般未受到其它免疫球蛋白的汙染。修飾語「單克隆」指示抗體從基本上同質的抗體群獲得的特徵，不應解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，有待依照本發明使用的單克隆抗體可通過多種技術來生成，包括：雜交瘤法、重組dna法、噬菌體展示技術、、及用於自具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物生成人或人樣抗體的技術。

單克隆抗體在本文中明確包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現出期望的生物學活性。

非人(例如鼠)抗體的「人源化」形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段諸如fv、fab、fab』、f(ab』)2或抗體的其它抗原結合子序列。

「抗體片段」包含全長抗體的一部分，一般是其抗原結合區或可變區。抗體片段的例子包括fab、fab′、f(ab′)2和fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。

「fv」是包含完整抗原識別和結合位點的最小抗體片段。該片段由緊密、非共價結合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。從這兩個結構域的摺疊結構中散發出六個高變環(重鏈和輕鏈各3個環)，促成結合抗原的胺基酸殘基並賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使是單個可變域(或是只包含對抗原特異的三個cdr的半個fv)也可具有識別和結合抗原的能力，只是親和力低於完整結合位點。

本發明的抗體的「功能性片段」指那些保留與衍生它們的完整全鏈分子以基本上相同的親和力結合多肽且在至少一種測定法中有活性(例如抑制th2誘導的哮喘途徑，諸如在小鼠模型中，或在體外抑制抗體片段結合的抗原的生物學活性)的片段。

本發明中，試劑盒可用於檢測stradb基因或蛋白的表達水平，包含用於stradb檢測和/或定量的本發明的配體、和/或晶片。任選的與試劑盒的說明書在一起。

試劑盒包括一種或多種無菌容器，這樣的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包裝、或本領域已知的其它合適的容器形式。這樣的容器可以由塑料、玻璃、層壓紙、金屬箔、或適於容器藥物的其它材料。

在本發明中，術語「包括」用於指短語「包括但不限於」，並與短語「包括但不限於」可以互換使用。

統計學方法

在本發明中，實驗至少採用3次重複實驗，結果數據都是以平均值±標準差的方式來表示，使用spss18.0統計軟體來進行統計分析的，兩者之間的差異採用t檢驗，認為當p<0.05時具有統計學意義。

實施例

下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。

實施例1篩選與哮喘相關的基因標誌物

1、樣品收集

按照支氣管哮喘診斷與防治指南的診斷標準，各收集10例正常人血液和哮喘患者血液外周靜脈血3ml，患者均知情同意，上述所有標本的取得均通過倫理委員會的同意。

2、rna樣品的製備及質量分析

2.1rna樣品的製備

使用promega公司的rna提取試劑盒提取總rna。具體步驟如下：

1)取1ml收集在肝素或edta處理過的試管中的全血，放進無菌離心管中；

2)3000rpm(400g)離心5min，小心地從樣品頂部吸走上清；

3)加1ml血細胞裂解液，小心吸放4-5次，重懸沉澱物，3000rpm離心5min；

4)重複步驟3兩次(共三次)；

5)避開細胞沉澱物，小心吸走幾乎所有上清，只保留100μl上清液；確認一下bme已經加到rna裂解液中，然後加175μlrna裂解液到細胞中，吸放重懸並裂解細胞；

6)加350μlrna稀釋液，顛倒混合3-4次，室溫下13000g離心10min，將清亮裂解物轉移到一支無菌離心管中；

7)向澄清裂解液中加入200μl95％乙醇，用移液槍吸放3-4次以混合；將此混合物轉移到離心柱裝配體中，13000g離心1min；

8)從離心柱裝配體上拿下離心柱，棄去收集管中的液體，將離心柱裝回到收集管上，加600μlrna洗滌液於離心柱裝配體，13000g離心1min；

9)棄去收集管中的液體，將離心柱裝回到收集管上，將50μl新鮮製備的dnase孵育混合物直接加到離心柱內的膜上；

10)室溫下孵育15min，向離心柱中加入200μldna酶終止緩衝液(確認已加入乙醇)，13000g離心1min；

11)加入600μlrna洗滌液(已加入乙醇)，13000g，離心1min；

12)清空收集管，向離心柱內加入250μlrna洗滌液(已加入乙醇)，高速離心2min；

13)將離心柱從收集管上轉移到洗脫管上，向膜上加100μl無核酸酶水，將離心柱裝配體放進離心機並使洗脫管的蓋子朝外，13000g離心1min，丟棄離心柱，蓋好盛有rna的洗脫管，存於-70℃。

2.2rna樣品的質量分析

利用nanodrop2000對所提取的rna濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna完整性，agilent2100測定rin值。濃度≥200ng/μl，od260/280介於1.8～2.2之間。

3、去除rrna

使用ribo-zero試劑盒除去總rna中的核糖體rna。

4、構建cdna文庫

利用利用illumina的truseqrnasampleprepkit進行cdna文庫的構建，具體操作按說明書進行。

5、上機測序

使用hiseq4000測序平臺對cdna文庫進行測序，具體操作按說明書進行。

6、高通量轉錄組測序數據分析

對測序結果進行生物信息學分析，利用tophatv1.3.1進行rna-seq讀段定位，通過cufflinksv1.0.3將rna-seq片段數目進行標準化計算轉錄本的相對豐度，利用cuffdiff檢測差異表達，當fdr<0.05時，認為mrna顯著差異表達。

7、結果

rna-seq結果顯示，stradb基因在哮喘患者血液中的表達量顯著低於正常人的表達量。

實施例2qpcr測序驗證stradb基因的差異表達

1、根據高通量測序的檢測結果選擇stradb基因進行大樣本qpcr驗證。按照實施例1中的方法收集選擇哮喘患者血液和正常人血液樣本各80例。

2、rna提取步驟同實施例1。

3、逆轉錄：使用takara公司的反轉錄試劑盒進行操作。具體步驟如下：

(1)取總rna2μg進行逆轉錄，加入oligo(dt)2μl，充分混勻；70℃水浴5min後立即冰浴2-3min；

(2)構建25μl反應體系，其中包括5×逆轉錄緩衝液5μl，dntp(2.5mm)5μl，rnasin40u/μl，m-mlv200u/μl，補無核酶水至25μl；

(3)42℃水浴60min後，95℃水浴5min以滅活m-mlv；

(4)-20℃儲存備用。

4、qpcr擴增

(1)引物設計

根據genebank中stradb基因和gapdh基因的編碼序列設計qpcr擴增引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。其中，擴增stradb基因的引物序列對如seqidno.3～4所示，擴增內參基因gapdh的引物序列對如seqidno.5～6所示。

(2)配製25μlpcr反應體系：

向無菌ep管中加入去離子水8.5μl、sybrgreen聚合酶鏈式反應體系12.5μl、正(反)向引物1μl、sybrgreen聚合酶鏈式反應體系12.5μl、模板2μl混合均勻；其中，sybrgreen聚合酶鏈式反應體系購自invitrogen公司。

(3)pcr反應條件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45個循環。以sybrgreen作為螢光標記物，在lightcycler螢光定量pcr儀上進行pcr反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。

5、結果

結果如圖1所示，與正常人血液相比，stradb基因在哮喘患者血液中的表達下調，差異具有統計學意義(p<0.05)，同rna-sep結果一致。

實施例3蛋白水平驗證stradb的差異表達

1、按照ripa蛋白裂解液試劑盒說明書提取各組蛋白，使用bca蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品中蛋白濃度。

2、以常規western-blot方法檢測stradb蛋白變化，各組實驗均重複3次，以β-actin為內參，做stradb蛋白條帶吸光度定量分析，表達量以stradb蛋白/β-actin吸光度的比值代表。

3、結果

結果如圖2所示，與正常人相比，哮喘患者中stradb的蛋白水平顯著下調，差異具有統計學意義(p<0.05)。

上述實施例的說明只是用於理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發明權利要求的保護範圍內。

sequencelisting

常州市第二人民醫院

stradb在哮喘早期診斷中的應用

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2

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人源

2

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3

19

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人工序列

3

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4

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人工序列

4

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人工序列

5

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6

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人工序列

6

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