擴增的核酸方法

2023-07-31 12:07:01 1

專利名稱：：擴增的核酸方法
技術領域：
：本發明涉及一種核酸的擴增方法。更具體地說，本發明涉及一種核酸的擴增方法，其特徵是，採用DNA聚合酶，通過對反應溶液進行孵育，進行聚合酶反應。
背景技術：
：在分子生物學的研究中，一般來說，核酸的擴增是通過利用DNA聚合酶採用酶學方法來進行的。作為核酸的擴增方法，聚合酶鏈反應(PCR)是一種公知的方法。為了對作為目標的目標核酸序列進行擴增，PCR法由以下3個工序構成將作為模板的雙鏈DNA變性為單鏈DNA的工序(變性工序)；將引物退火到單鏈DNA上的工序(退火工序)；以及，以引物作為起點使互補鏈延伸的工序(延伸工序)。在通常的PCR法中，在使用擴增儀(ThermalCycler)時，變性工序、退火工序、延伸工序分別在不同的溫度下進行。但是，在3種不同的溫度下進行核酸擴增反應時，溫度控制麻煩，並且還會造成這樣的問題消耗的時間會隨著循環次數的增加而成比例地增加。因此，人們開發了可以在恆溫狀態下實施的核酸擴增方法。例如可以列舉，RCA(滾環擴增，RollingCircleAmplification,參見Proc.Natl.Acad.Sci，vol.92，4641-4645(1995))、ICAN(恆溫和嵌合引物引發的核酸擴增，IsothermalandChimericprimer-initiatedAmplificationofNucleicacids)、LAMP(環介導的DNA恆溫擴增，Loop-MediatedIsothermalAmplificationofDNA，參見BioIndustry,第18巻、第2期(2001))、NASBA(基於核酸序列的擴增方法，NucleicacidSequence-basedAmplificationmethod,參見Nature,350，91(1991))、TMA(轉錄介導的擴增方法，Transcriptionmediatedamplificationmethod,參見J.ClinMicrobiol.第31巻、3270(1993))等。SDA法(日本特開平5-130870號公報)是採用外切核酸酶的循環分析法，其為利用聚合酶延伸反應使靶核酸片段的目的部位擴增的一種方法。該方法是這樣一種方法以特異性地雜合到靶核酸片段的目的部位上的引物作為起點進行聚合酶延伸反應，同時使5'—3'外切核酸酶發生作用，從而將引物從相反方向降解。新的引物代替降解的引物進行雜合，並再次通過DNA聚合酶進行延伸反應。該通過聚合酶進行的延伸反應與通過外切核酸酶(該外切核酸酶將之前已延伸的鏈除去)進行的降解反應依次地、周期性地反覆進行。這裡，通過聚合酶進行的延伸反應與通過外切核酸酶進行的降解反應可以在恆溫條件下進行。但是，該方法中除了聚合酶外，還必須使用外切核酸酶，這樣的話消耗成本，同時還必須花費精力來設計引物。LAMP法是近年開發的對於靶核酸片段的目的部位進行擴增的方法。該方法中，通過使用至少4種引物(該至少4種引物互補地識別靶核酸片段的至少6個特定部位)和鏈置換型的BstDNA聚合酶(該聚合酶為在5'—3'方向上沒有核酸酶活性、而且邊使模板上的雙鏈DNA解離為單鏈DNA邊催化延伸反應的聚合酶)，在恆溫條件下，將靶核酸片段的目的部位擴增為特別結構。不過，這種方法需要使用至少4種引物以識別6個特定部位，而引物的設計非常困難。ICAN法也是近年開發的對於靶核酸片段的目的部位進行擴增的方法。該方法為這樣一種方法採用RNA-DNA嵌合引物、具有鏈置換活性和模板交換活性的DNA聚合酶、以及RNaseH，進行恆溫的基因擴增。嵌合引物與模板結合後，通過DNA聚合酶可以合成互補鏈。之後，RNaseH將來源於嵌合引物的RNA部分切斷，從切斷的部分開始進行延伸反應，同時伴隨有鏈置換反應和模板交換反應，這樣的反應反覆進行，基因由此得以擴增。不過，該方法也必須用到被稱作嵌合引物的特殊引物，而引物的設計非常困難。在日本特表平11-509406號公報中，記載了在具有鏈置換能力的DNA聚合酶存在下，採用至少1組寡核苷酸引物，將目的區域中的DNA在恆溫條件下反應，由此擴增的方法。不過，日本特表平11-509406號公報中記載的方法存在著需要比較長的反應時間這樣的問題。在日本特開2002-233379號公報中，記載了在具有鏈置換能力的DNA聚合酶存在下，採用至少1組寡核苷酸引物，將目標區域中的DNA在恆溫條件下反應，由此進行擴增的方法。不過，日本特開2002-233379號公報中記載的方法存在著顯著生成非特異性的擴增產物這樣的問題。proc.Natl.Acad.Sci，vol.92,4641-4645(1995)BioIndustry,第18巻，第2期(2001)Nature,350,91(1991)J.ClinMicrobiol.第31巻，3270(1993)日本特開平5-130870號公報日本特表平11-509406號公報日本特開2002-233379號公報
發明內容發明要解決的問題為了解決上述問題，本發明提供一種採用寡核苷酸引物和DNA聚合酶即可以實施的核酸擴增方法。為了解決上述問題，本發明還提供一種簡便而且迅速的核酸擴增方法，該方法能夠在短時間內特異性地、高效地擴增目標核酸序列。解決問題所採用的手段為了解決上述問題，本發明人進行了深入的研究。結果發現在以下的核酸擴增方法中，通過將鹼基序列(該鹼基序列為在作為模板的核酸片段中，存在於與第一寡核苷酸基本上相同的鹼基序列的下遊側(即3'末端側)的鹼基序列)添加到第一寡核苷酸引物的5'末端，就能夠成功地只對目標核酸序列特異性地進行擴增，其中所述的核酸擴增方法為將含有至少一種脫氧核苷三磷酸、至少一種DNA聚合酶、至少兩種寡核苷酸引物、以及作為模板的核酸片段的反應溶液進行孵育，以上述引物的3'末端作為起點進行聚合酶反應，從而將該核酸片段擴增。艮P,本發明提供一種核酸的擴增方法，該方法為這樣一種核酸擴增方法將含有至少一種脫氧核苷三磷酸、至少一種DNA聚合酶、至少兩種寡核苷酸引物、以及作為模板的核酸片段的反應溶液進行孵育，以上述引物的3'末端作為起點進行聚合酶反應，從而將該核酸片段擴增，其特徵在於，將標識序列添加到第一寡核苷酸引物的5'末端，該標識序列為在作為模板的核酸片段中存在的一段鹼基序列，在所述模板上，該鹼基序列位於該模板中的與第一寡核苷酸引物的3'端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的下遊側(即3'末端側)。圖1顯示的是第一寡核苷酸引物、第二寡核苷酸引物和標識序列的位置關係的示意圖。優選的是，該標識序列的3'末端的鹼基存在於在作為模板的核酸片段的鹼基序列中的、與第二寡核苷酸引物的鹼基序列基本上互補的鹼基序列的下遊側(即3'末端側)。圖2顯示的是第一寡核苷酸引物、第二寡核苷酸引物和標識序列的位置關係的示意圖。優選的是，該標識序列存在於在作為模板的核酸片段的鹼基序列中的、與第二寡核苷酸引物的鹼基序列基本上互補的鹼基序列的下遊側(即3'末端側)。圖3顯示的是第一寡核苷酸引物、第二寡核苷酸引物和標識序列的位置關係的示意圖。優選的是，添加到第一寡核苷酸引物的5'末端上的標識序列為2個鹼基以上且20個鹼基以下的序列。優選的是，添加到第一寡核苷酸引物的5'末端的標識序列為在作為模板的核酸片段的鹼基序列上，在距與第一寡核苷酸引物的3，端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3'末端200個鹼基以內的區域中存在的鹼基序列。優選的是，所述反應溶液中還含有至少0.01%以上的表面活性劑。優選的是，所述表面活性劑為非離子型表面活性劑。優選的是，所述非離子型表面活性劑的特徵在於選自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯類、聚氧乙烯烷基酚醚類、聚氧乙烯烷基醚類。優選的是，所述反應溶液中還含有二價陽離子。優選的是，所述反應溶液中還含有解鏈溫度調節劑。優選的是，所述解鏈溫度調節劑為二甲基亞碸、甜菜鹼、甲醯胺或甘油、或者它們中的兩種以上的混合物。優選的是，所述的至少一種DNA聚合酶為具有鏈置換能力的DNA聚合酶。優選的是，所述的至少一種具有鏈置換能力的DNA聚合酶為選自來源於嗜熱脂肪芽孢桿菌的5'—3'外切核酸酶缺失的Bst.DNA聚合酶、來源於熱堅芽孢桿菌的5'—3'外切核酸酶缺失的BcaDNA聚合酶、來源於Thermococcuslitoralis的5，—3'外切核酸酶缺失的Vent.DNA聚合酶、及來源於酸熱脂環酸桿菌的DNA聚合酶中的聚合酶。優選的是，核酸的擴增工序在基本上恆溫的條件下進行。優選的是，核酸的擴增工序在5(TC以上IO(TC以下的條件下進行。優選的是，核酸的擴增工序基本上在60分鐘以內進行。發明效果通過本發明，能夠非常有效地進行形成高分子量產物的反應，所以能夠僅對目標核酸序列進行特異性的擴增，其中所述形成高分子量產物的反應是通過將標識序列(即，在作為模板的核酸片段的鹼基序列上，與第一寡核苷酸引物的3'端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3'末端側(即下遊側)所存在的鹼基序列)添加到第一寡核苷酸引物的5'末端而進行的。而且，根據本發明，可以提供一種簡便、迅速、高靈敏度的核酸擴增方法，從而不必採用複雜的溫度控制、使用特殊的酶、進行複雜的引物設計就能夠對目標核酸序列進行擴增。圖1顯示的是本發明中引物和標識序列的位置關係的示意圖。圖2顯示的是本發明中引物和標識序列的位置關係的示意圖。圖3顯示的是本發明中引物和標識序列的位置關係的示意圖。圖4顯示的是實施例中所用的引物相對於(32AR基因的位置關係的詳細情況。圖5顯示的是通過本發明的擴增反應而得到的擴增產物的螢光檢測結果。圖6顯示的是通過本發明的擴增反應而得到的擴增產物的螢光檢測結果。圖7顯示的是通過本發明的擴增反應而得到的擴增產物的螢光檢測結果。圖8顯示的是通過本發明的擴增反應而得到的擴增產物的電泳結果。圖9顯示的是通過本發明的擴增反應而得到的擴增產物的電泳結果。圖IO顯示的是通過本發明的擴增反應而得到的擴增產物的電泳結果。圖11顯示的是實施例中所用的引物相對於P2AR基因的位置關係的詳細情況。圖12顯示的是通過本發明的擴增反應而得到的擴增產物的電泳結果。圖13顯示的是實施例中所用的引物相對於p2AR基因的位置關係的詳細情況。圖14顯示的是通過本發明的擴增反應而得到的擴增產物的電泳結果。圖15顯示的是本發明的擴增產物的形成機理的詳細情況。具體實施例方式以下對本發明進行詳細說明。本發明的核酸擴增方法為這樣一種核酸擴增方法，其包括將含有至少一種脫氧核苷三磷酸、至少一種DNA聚合酶、2價陽離子、至少兩種寡核苷酸引物、以及作為模板的核酸片段的反應溶液進行孵育，以上述引物的3'末端作為起點進行聚合酶反應，從而將該核酸片段擴增，其特徵在於，將標識序列添加到第一寡核苷酸引物的5'末端，該標識序列為在作為模板的核酸片段中存在的一段鹼基序列，在所述模板上，該鹼基序列位於該模板中的與第一寡核苷酸引物的3'端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3'末端側(即下遊側)。作為本發明的一個例子的實施例1中所用的引物相對於|32AR基因的位置關係的詳細情況如圖4所示。在該實施例1中，添加到第一寡核苷酸引物(序列編號l)的5'末端的標識序列為5'—CCACGACG—3'(序歹iJ編號1並參照圖4)。在作為模板的核酸片段的鹼基序列中，與第一寡核苷酸引物的3'端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的鹼基序列對應於5，一CTTGCTGGCACCCAATA—3，。這樣，在作為模板的核酸片段的鹼基序列中，位於與第一寡核苷酸引物的3'端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的鹼基序列的下遊側(即3'末端側)的鹼基序列對應於5'—CCACGACG—3'(參照圖4)，該鹼基序列就對應於添加到第一寡核苷酸引物(序列編號l)的5'末端上的標識序列。本發明的核酸擴增方法的概略如圖15所示。將第一寡核苷酸引物退火到作為模板的核酸片段，並以該寡核苷酸引物的3'末端作為起點進行聚合酶反應。這時，通過將標識序列(該標識序列為在作為模板的核酸片段的鹼基序列上，與第一寡核苷酸引物的3'端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的鹼基序列的3，末端側所存在的鹼基序列)添加到第一寡核苷酸引物的5'末端，以第一寡核苷酸引物作為起點進行聚合酶反應，作為該聚合酶反應的擴增產物，得到了在其5'末端含有標識序列的擴增核酸片段(稱其為核酸片段A)，即該擴增核酸片段含有在作為模板的核酸片段的鹼基序列中的、位於與第一寡核苷酸引物的3'端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的鹼基序列的下遊測(即3'末端側)所存在的鹼基序列。接著，將第二寡核苷酸引物退火到通過上述方法得到的擴增核酸片段A上，並以該寡核苷酸引物的3'末端作為起點進行聚合酶反應。這時，由於在作為模板的擴增核酸片段A的5'末端存在有標識序列(該標識序列為在作為模板的核酸片段的鹼基序列中，在與第一寡核苷酸引物的3'端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的鹼基序列的下遊側(即3'末端側)存在的鹼基序列)，因此在所得到的擴增核酸片段(稱其為核酸片段B)的3'末端含有與標識序列基本上互補的序列(該序列為這樣的序列與在作為模板的核酸片段的鹼基序列中的、和第一寡核苷酸引物的3'端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的下遊側(即3'末端側)存在的鹼基序列，基本上互補的序列)。核酸片段B的3'末端的序列與核酸片段A中所含有的序列在2處互補。核酸片段B的3，末端與存在於核酸片段A的3'末端上的互補序列形成雙鏈，並以此為起點進行聚合酶反應，由此合成得到高分子的擴增核酸片段。同樣，所得到的高分子的擴增核酸片段與存在於核酸片段A的3'末端上的互補序列形成雙鏈，並以此為起點進行聚合酶反應，由此合成得到分子量更高的擴增核酸片段。以下對本發明中所採用的成分進行說明。(1)脫氧核苷三磷酸採用脫氧核苷三磷酸作為延伸反應的底物。具體地說，優選使用dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合物。作為脫氧核苷三磷酸，也可以含有dNTP的類似物(例如，7-脫氮-dGTP等)。此外，脫氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合物)的最終濃度均在0.1mM3.0mM的範圍內，優選在0.75mM3.0mM的範圍內，更優選在1.0mM2.0mM的範圍內，特別優選在1.0mM1.5mM的範圍內。(2)DNA聚合酶在本發明中，採用具有鏈置換能力的聚合酶。在本說明書中，所謂"鏈置換能力"是指具有這樣的活性在根據作為模板的核酸序列進行DNA複製時，通過置換DNA鏈來進行鏈置換，以使退火到模板鏈上的互補鏈解離，艮卩，具有能夠進行鏈置換(stranddisplacement)的活性。作為具有鏈置換能力的聚合酶的具體例子，可以列舉來源於嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的5，—3'外切核酸酶缺失的Bst.DNA聚合酶、來源於熱堅芽孢桿菌(Bacilluscaldotenax)的5，—3'外切核酸酶缺失的BcaDNA聚合酶、來源於Thermococcuslitoralis的5，—3'外切核酸酶缺失的Vent.DNA聚合酶、及來源於酸熱脂環酸桿菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)的DNA聚合酶中的聚合酶等，但並不局限於此。具有鏈置換能力的聚合酶，既可以是來源於天然的，也可以是通過基因工程製造的重組蛋白質。(3)二價陽離子在本發明中，根據所使用的酶的金屬需求性等，使用二價陽離子。作為所述二價陽離子，可以使用鎂鹽、鈣鹽和其他的金屬鹽，例如，可以使用氯化鎂、醋酸鎂、硫酸鎂等。所述二價陽離子的最終濃度優選在1mM20mM的範圍內，更優選在2mM10mM的範圍內。(4)表面活性劑在本發明中，也可以向反應溶液中添加表面活性劑。通過使用表面活性劑，可以達到防止發生非特異性的核酸擴增這樣的有利效果。對於本發明中可以使用的表面活性劑的種類沒有特別的限定，例如可以使用烷基苯磺酸鈉、十二垸基硫酸鈉(SDS)、磺基琥珀酸辛酯鹽、硬脂酸皂類等陰離子(anion)型表面活性劑；蔗糖脂肪酸酯、POE失水山梨醇脂肪酸酯(Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等)、脂肪酸垸醇醯胺、POE烷基醚(Brij35、Brij58等)、POE烷基苯基醚(TritonX-100、TritonX-114、NonidetP40等)、壬基酚、月桂醇、聚乙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、POE垸基胺、POE脂肪酸雙苯基醚等非離子(nonion)型表面活性劑；氯化十六垸基吡啶鑰、十二垸基二甲基苄基氯化銨、硬脂基三甲基氯化銨等陽離子(cation)型表面活性劑等。對於表面活性劑的用量沒有特別的限定，只要能夠達到本發明的效果即可，但是優選為0.01%以上，更優選為0.05%以上，進一步優選為0.1%以上。對表面活性劑的用量的上限沒有特別的限定，通常在10%以下，優選在5%以下，更優選在1%以下。在表面活性劑中，特別優選使用非離子型表面活性劑。在非離子型表面活性劑中，優選親水性較強的表面活性劑，用HLB值表示的話，優選HLB值在12以上。更優選HLB值在14以上，優選HLB值的上限為20。另外，優選HLB值在17以下，更優選HLB值為14以上17以下。從結構上來說，所述表面活性劑優選選自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯類、聚氧乙烯烷基醚類。還有，在聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯中，優選的化合物是聚氧乙烯失水山梨醇單脂肪酸酯。例如，可以用以下的結構式來表示。(式中，x+y+z+w=20，R表示碳原子數為1218的烷基。)對於烷基的位置沒有特別的限定，但是可以優選使用以下的結構式所表示的化合物。o(式中，x+y+z+w=20，R表示碳原子數為1218的垸基。)作為此類表面活性劑，就物質名稱而言，聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯類非離子型表面活性劑可以列舉聚氧乙烯(20)失水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇單油酸酯等。可以列舉商品名分別為Tween20、Tween40、Tween60和Tween80等的表面活性劑。此外，對於表面活性劑的用量也沒有特別的限定，但是優選為0.01%以上，更優選為0.05%以上，進一步優選為0.1%以上。(5)寡核苷酸引物在本發明中使用的寡核苷酸引物具有與模板DNA基本上互補的鹼基序列，並且從該引物的3'末端可以進行DNA鏈的延伸。由於寡核苷酸引物具有與模板DNA基本上互補的鹼基序列，所以可以將其退火到作為模板的DNA上。作為本發明使用的寡核苷酸引物，可以使用由脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸構成的物質，也可以是含有修飾的核糖核苷酸或修飾的脫氧核糖核苷酸的物質。在本發明中，將標識序列(即，在作為模板的核酸片段的鹼基序列中的、與第一寡核苷酸引物的3'端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的下遊側(即3'末端側)所存在的鹼基序列)添加到第一寡核苷酸引物的5'末端。優選的是，添加到第一寡核苷酸引物的5'末端上的標識序列為2個鹼基以上、20個鹼基以下的序列。優選的是，添加到第一寡核苷酸引物的5'末端的標識序列為2個鹼基以上、16個鹼基以下的序列。優選的是，添加到第一寡核苷酸引物的5'末端的標識序列為4個鹼基以上、14個鹼基以下的序列。優選的是，添加到第一寡核苷酸引物的5'末端的標識序列位於在作為模板的核酸片段的鹼基序列上，與第一寡核苷酸引物的3'端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3'末端側(即下遊側)的200個鹼基以內的位置。優選的是，添加到第一寡核苷酸引物的5'末端的標識序列位於在作為模板的核酸片段的鹼基序列上，與第一寡核苷酸引物的3，端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3'末端側(即下遊側)的ioo個鹼基以內的位置。優選的是，添加到第一寡核苷酸引物的5'末端的標識序列位於在作為模板的核酸片段的鹼基序列上，與第一寡核苷酸引物的3'端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3'末端側(即下遊側)的60個鹼基以內的位置。優選的是，添加到第一寡核苷酸引物的5'末端的標識序列位於在作為模板的核酸片段的鹼基序列上，與第一寡核苷酸引物的3'端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3，末端側(即下遊側)的50個鹼基以內的位置。對於寡核苷酸引物的長度沒有特別的限定，但是一般來說，為10100個左右核苷酸的長度，優選為1550個左右核苷酸的長度，更優選為1540個左右核苷酸的長度。口J以使用rt]售的UNA合成儀(1'列'如，美國應用生物系統公司(AppliedBiosystemInc.)製造的DNA合成儀-394型等)，根據亞磷醯胺法來合成所述寡核苷酸引物。在反應溶液中，寡核苷酸引物的用量優選為O.lpM以上，更優選為lpM以上，特別優選為1.5pM以上。(6)作為模板的核酸片段在本發明中，作為模板的核酸(DNA或RNA)可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA、mRNA、總RNA中的任意一種。既可以使用從有可能含有作為模板的核酸的試樣中所製備的核酸，也可以直接使用有可能含有作為模板的核酸的試樣。對於含有作為模板的核酸的試樣的種類沒有特別的限定，可以列舉例如體液(例如，全血、血清、尿、腦脊髓液、精液、唾液等)，組織(例如，癌組織等)，用拭子採取的試樣，來源於細胞培養物之類的生物體的試樣，諸如病毒、細菌、真菌、酵母菌、植物和動物之類的含有核酸的試樣，有可能混入有微生物的試樣(例如，食品等)，或諸如土壤、廢水之類的環境中的試樣。在從上述試樣中製備核酸時，對於製備方法沒有特別的限定，例如，可以採用表面活性劑處理、超聲處理、用玻璃珠進行精製等本領域的技術人員公知的方法。對於從試樣中精製核酸，可以採用苯酚提取法、色譜法、凝膠電泳法或密度梯度離心分離等方法進行。當對具有來源於RNA的序列的核酸進行擴增時，以該RNA作為模板進行逆轉錄反應合成得到cDNA，以該cDNA作為模板來實施本發明的方法。在逆轉錄反應中使用的引物，可以是具有與特定的模板RNA互補的鹼基序列的引物，也可以是寡聚dT引物或具有隨機序列的引物。用於逆轉錄的引物的長度優選是6100個左右核苷酸的長度，更優選是950個左右核苷酸的長度。對於逆轉錄反應中使用的酶沒有特別的限定，只要其具有以RNA作為模板來合成cDNA的活性即可，例如可以使用源自禽類骨髓細胞瘤病病毒的逆轉錄酶(AMVRTase)、源自Molony鼠白血病病毒的逆轉錄酶(MMLVRTase)及Rous相關病毒-2的逆轉錄酶(RAV-2RTase)等。此外，也可使用同時具有逆轉錄活性的鏈置換型DNA聚合酶。在本發明中，基因組DNA或核酸擴增片段之類的雙鏈DNA、以及利用逆轉錄反應由RNA製備得到的cDNA之類的單鏈DNA可用作模板DNA。上述的雙鏈DNA，既可以在變性為單鏈DNA後用於本發明的方法中，也可以不進行這樣的變性而用於本發明的方法中。(7)對模板核酸片段的預處理本發明中的模板核酸，也可以在經過預處理工序之後用作擴增模板。預處理用的試劑可以含有(例如)表面活性劑、抗凝劑、蛋白質分解酶、脂類分解酶。作為試劑的液性，可以是酸性，也可以是鹼性。作為預處理工序，可以包括在高溫(例如98。C)下進行加熱的工序或者採用變性處理劑進行處理的工序。而且，在高溫加熱後，可以包括驟冷至4'C以下的工序。(8)解鏈溫度調節劑在本發明的反應溶液中，可以添加解鏈溫度調節劑。作為解鏈溫度調節劑的具體例子，可以列舉二甲基亞碸(DMSO)、甜菜鹼、甲醯胺或甘油、四垸基銨鹽或它們中的2種以上的混合物。對於解鏈溫度調節劑的用量沒有特別的限定，然而，在使用DMSO或甲醯胺、甘油的情況中，通常它們在反應溶液中的含量為10%以下。甜菜鹼或四垸基銨鹽的添加量為0.2M3.0M，優選為0.5M1.5M左右。(9)緩衝成分在本發明的反應溶液中，可以含有緩衝成分。對於緩衝成分沒有特別的限定，可以使用例如N,N-二(羥乙基)甘氨酸、三(羥甲基)甲基甘氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、三羥甲基氨基甲烷和磷酸鹽(磷酸鈉、磷酸鉀等)等。緩衝成分的最終濃度在5mM100mM的範圍內，特別優選在10mM50mM的範圍內，此外，pH是對於擴增反應中使用的酶的最佳pH，一般來說為6.09.0，特別優選使用pH7.09.0的緩衝成分。(10)螢光色素在本發明的反應溶液中，可以含有螢光色素。對於螢光色素沒有特別的限定，例如可以使用SYBRGreenI等。(11)本發明的核酸擴增方法以下對本發明的核酸擴增方法進行說明。在本發明中，將含有至少一種脫氧核苷三磷酸、至少一種DNA聚合酶、二價陽離子、至少兩種寡核苷酸引物、以及作為模板的核酸片段的反應溶液進行孵育。由此，以上述引物的3'末端作為起點進行聚合酶反應，從而可以將該核酸片段擴增。本發明中，優選在基本上恆溫的條件下進行核酸的擴增工序。對反應溶液進行孵育時的溫度優選在5CTC以上，更優選為55T以上，例如，可以在6(TC左右的溫度下進行孵育。優選的溫度範圍例如為從大約5(TC到大約70°C，更優選為從大約55'C到大約65。C。這種情況下，引物的非特異性退火被抑制，DNA擴增的特異性提高，而且，由於模板DNA的二級結構被解除，所以DNA聚合酶的延伸活性也得以提高。本發明的核酸擴增方法可以在基本上恆溫的條件下實施。在本發明中，所謂"恆溫"是指各工序的反應溫度沒有很大的變化，各工序在基本上一定的溫度下進行。在本發明中，對於將反應溶液在基本上恆溫的條件下進行孵育的時間沒有特別的限定，只要能夠將目標核酸片段進行擴增即可。孵育時間例如可以為5分鐘以上12小時以內。孵育時間優選為5分鐘以上2小時以內，更優選為5分鐘以上60分鐘以內，進一步優選為5分鐘以上30分鐘以內，也可以為5分鐘以上15分鐘以內。本發明的核酸擴增方法的一個優點在於，在基本上恆溫的條件下進行核酸擴增工序時，不必使溫度升高或降低。在傳統的PCR法中需要使溫度升高或降低，並且例如需要使用擴增儀(ThermalCycler)之類的反應裝置，而在基本上恆溫的條件下進行核酸擴增時，僅僅使用可使溫度保持一定的裝置就可以實施擴增。(12)本發明的核酸擴增方法的應用本發明的核酸擴增方法能夠用於核酸的檢測、標記、鹼基序列的確定、鹼基變異的檢測(包括單鹼基多型態的檢測等)等。在本發明的核酸擴增方法中，不必使用能夠進行溫度調節的反應裝置，所以可以使用大量的反應液來進行擴增反應。由本發明的核酸擴增方法所得到的擴增產物，可以採用本領域的技術人員公知的方法來進行檢測。例如，釆用凝膠電泳法，通過用溴化乙錠進行凝膠染色，可以檢測特定大小的反應產物。用於檢測擴增產物的檢測體系，可以使用螢光偏振法、免疫檢測法、螢光能量轉移法、酶標記法(例如，過氧化酶、鹼性磷酸酶等)、螢光標記法(例如，螢光素、羅丹明等)、化學發光法或生物發光法等。也可以利用Taqmanprobe或MolecularBeacon檢測。通過使用用生物素等標記的標記核苷酸也可以檢測擴增物。在這種情況中，可以採用螢光標記親合素或酶標記親合素等來檢測擴增產物中的生物素。此外，通過使用本領域的技術人員公知的氧化還原型嵌入劑(intercalator)，也能夠由電極來檢測擴增產物。而且，也可以使用SPR來檢測擴增產物。也可以通過檢測焦磷酸鎂來檢測核酸的擴增。在這種情況下，可以採用根據渾濁度進行的檢測、以及本領域的技術人員公知的其他方法來進行檢測。通過實施例對本發明進行更具體的說明，但本發明並不局限於這些實施例。實施例通過帶有標識的引物進行的核酸擴增(標識的設計位置的影響)(1)含有靶核酸片段的核酸試樣溶液的配製將3.0ng的HumanGenomicDNA(Clontech公司製造)在98。C下加熱3分鐘，使之成為單鏈後，在下述條件下對P2AR基因中的序列進行擴增。<引物〉使用(32AR基因作為目標進行引物的設計。各引物的序列如下所示。引物(l)(正向引物1):5，一CCACGACGCTTGCTGGCACCCAATA一3，(序列編號1)引物(2)(正向引物2):5，一GGCAGGAACTTGCTGGCACCCAATA—3'(序列編號2)引物(3)(正向引物3):5，一TGGGTGGTCTTGCTGGCACCCAATA—3，(序列編號3)引物(4)(反向引物)5，一CCGGCGCATGGCTT—3，C序列編號4)上述引物相對於f32AR基因的位置關係的詳細情況如圖4所示。這裡，引物(l)、(2)、(3)的5'末端的8個鹼基(標識序列)分別與，在作為模板的核酸片段的鹼基序列中的、和引物(l)、(2)、(3)的3'端部分(引物與模板核酸退火的部分)基本上相同的鹼基序列的下遊側(即3，末端側)所存在的各序列基本上相同。(2)核酸擴增反應採用具有如下所示組成的反應液，在60。C下反應60分鐘，以實施擴增反應。酶使用的是NEB公司生產的Bst.DNAPolymerase。10xBst緩衝液(DF)l.OjxL100mMMgS040.6nL10%(v/v)Tween200.1pL100%DMSO25mMdNTP，每種SYBRGreenI(稀釋2000倍)50pM引物(1)或(2)或(3)0.6化L50(iM引物(4)0.64pLBst.Polymerase0.4|iL上述工序(l)所得到的核酸片段試樣溶液3.0ng純化水4.96uLlO.OpL0)擴增產物的檢測採用實時螢光檢測裝置(Mx3000p，Stratagene公司製造)對上述(2)中的擴增反應進行螢光檢測。結果如圖5至圖7所示。可以看出，能夠對來自核酸試樣的樣品所進行的核酸擴增反應進行實時檢測。採用Mx3000p分析軟體，計算在上述的圖中當螢光量達到250時所需要的時間(Ct值)，結果如表1所示。tableseeoriginaldocumentpage21(4)擴增產物的電泳使用3重量％的瓊脂糖凝膠、0.5xTBE緩衝液(50mMTris,45mM硼酸、0.5mMEDTA,pH8.4)，在100V下進行60分鐘的電泳。結果如圖810所示。無論採用哪種引物的組合，均可以得到梯狀的規則的電泳圖案。由該結果可知，能夠得到具有一定規律的擴增產物，s卩，能夠對擴增反應進行控制。(5)擴增產物的序列解析將擴增產物用NucleoSpin(註冊商標)ExtractII(MACHEREY-NAGEL公司製造)進行純化，並利用TOPOTA克隆試劑盒(Iiwitrogen公司製造)將其重組到載體中，用該載體對大腸菌進行轉化。將經過轉化的大腸菌在添加有氨苄西林的LB培養基中進行培養。利用QIAprepMiniprep(Qiagen公司製造)，從培養後的大腸菌中回收質粒DNA。對所回收的質粒DNA進行測序，以確定鹼基序列。採用ABIPRISM310GeneticAnalyzer(ABI公司製造)進行測序。使用M13反向引物(M13ReversePrimer)作為引物。M13反向引物5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，(序列編號5)由測序的結果可知，在由引物(1)與引物(4)的組合所產生的擴增產物中，存在具有以下序列的核酸。(1)3'-GGTGCTGCAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCC-5，(42個鹼基對)(序列編號6)(2)5'-GTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGG-3'3'-CAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCC-5'(85個鹼基對)(序列編號7)(3)5'-CTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGG-3'3'-GACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCC-5'(128個鹼基對)(序列編號8)通過測序所得到的擴增產物的鏈長與圖8的電泳結果一致。擴增產物(1)為夾在2個引物之間的區域。擴增產物(2)為兩個擴增產物彼此通過該擴增產物中的正向引物的5'末端序列(標識序列)和在反向引物的5'末端側存在的序列進行雜合而生成的擴增產物，其具有"夾在引物之間的區域"+"反向引物與標識序列之間的序列"+"夾在引物之間的區域"這樣的結構(以下，稱其為2倍體)。與擴增產物(2)相似，擴增產物(3)為各擴增產物彼此通過該擴增產物中的正向引物的5'末端序列(標識序列)以及在反向引物的5'末端側存在的序列進行雜合而生成的擴增產物，其具有"夾在引物之間的區域"+"反向引物與標識序列之間的序列"+"夾在引物之間的區域"+"反向引物與標識序列之間的序列"+"夾在引物之間的區域"這樣的結構(以下，稱其為3倍體)。由測序的結果可知，在由引物(2)與引物(4)的組合所產生的擴增產物中，存在具有以下序列的核酸。(1)5'-GGGACGAGTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGG-3'3'-GGGACGAGAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCC-5'(42個鹼基對)(序列編號9)(2)5'-GCCGG-3'3'-CGGCC-5'(105個鹼基對)(序列編號10)(3)5'-ATAGAAGCCATGCGCCGG-3'3'-TATCTTCGGTACGCGGCC-5'(168個鹼基對)(序列編號11)通過測序所得到的擴增產物的鏈長與圖9的電泳結果一致。此處，擴增產物(1)為夾在2個引物之間的區域。擴增產物(2)為兩個擴增產物彼此通過該擴增產物中的正向引物的5'末端序列(標識序列)和在反向引物的5'末端側存在的序列進行雜合而生成的擴增產物，其為2倍體。與擴增產物(2)相似，擴增產物(3)為各擴增產物彼此通過該擴增產物中的正向引物的5'末端序列(標識序列)和在反向引物的5'末端側存在的序列進行雜合而生成的擴增產物，其為3倍體。由測序的結果可知，在由引物(3)與引物(4)的組合所產生的擴增產物中，存在具有以下序列的核酸。(1)5'-TGGGTGGTTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGG-3'3'-ACCCACCAAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCC-5'(42個鹼基對)(序列編號12)(2)5'-AGAAGCCATGCGCCGG-3'3'-TCTTCGGTACGCGGCC-5'(116個鹼基對)(序列編號13)(3)5'-GGTGGTTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGG-3'3'-CCACCAAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCC-5'(190個鹼基對)(序列編號14)通過測序得到的擴增產物的鏈長與圖10的電泳結果一致。此處，擴增產物(1)為夾在2個引物之間的區域。擴增產物(2)為兩個擴增產物彼此通過該擴增產物中的正向引物的5'末端序列(標識序列)和在反向引物的5'末端側存在的序列進行雜合而生成的擴增產物，其為2倍體。與擴增產物(2)相似，擴增產物(3)為各擴增產物彼此通過該擴增產物中的正向引物的5'末端序列(標識序列)和在反向引物的5'末端側存在的序列進行雜合而生成的擴增產物，其為3倍體。由該結果可知，無論是哪個擴增產物，都是通過標識序列形成高分子量的產物。即，通過將鹼基序列(該鹼基序列為在作為模板的核酸片段的鹼基序列中的、在與第一寡核苷酸引物的3'端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)具有基本上相同的序列的下遊側(即3'末端側)所存在的鹼基序列)添加到第一寡核苷酸引物的5'末端，能夠積極地形成高分子量的產物，從而能夠控制擴增反應。通過帶有標識的引物進行的核酸擴增(標識序列的長度的影響)(1)含有耙核酸片段的核酸試樣溶液的配製將3.0ng的HumanGenomicDNA(Clontech公司製造)在98。C下加熱3分鐘，使之成為單鏈後，在下述條件下對P2AR基因中的序列進行擴增。使用J32AR基因作為目標進行引物的設計。各引物的序列如下所示。引物(5)(正向引物5):5，一TGGTCTTGCTGGCACCCAATA—3，(序列編號15)引物(6)(正向引物6):5，——TGGGTGGTCTTGCTGGCACCCAATA—3，(序列編號16)引物(7)(正向引物7):5'—TGGGTGGTGGGCCTTGCTGGCACCCAATA一3，(序列編號17)引物(8)(正向引物8):5'—TGGGTGGTGGGCATCTTGCTGGCACCCAATA—3，C序列編號18)引物(9)(反向引物2):5'—TCCCTTTCCTGCGTGAC—3'(序歹!j編號19)上述引物相對於(32AR基因的位置關係的詳細情況如圖11所示。這裡，將與4個鹼基、8個鹼基、12個鹼基、14個鹼基的序列[這些鹼基序列分別和，存在於在作為模板的核酸片段的鹼基序列上的、位於與引物(5)、(6)、(7)、(8)的3'端部分(引物與模板核酸退火的部分)基本上相同的鹼基序列的3，末端側的序列(下遊側序列)，基本上相同](即標識序列)分別添加到引物(5)、(6)、(7)、(8)的5，末端。(2)核酸擴增反應採用具有如下所示組成的反應液，在60"C下反應60分鐘，以實施擴增反應。酶使用的是NEB公司的Bst.DNAPolymerase。10xBst緩衝液(DF)lOOmMMgS0410%(v/v)Tween2001jxL100%DMSO25mMdNTP，每種0.56nLSYBRGreenI(稀釋2000倍)50岸引物(5)或(6)或(7)或(8)0.64pL50pM引物(9)0.6化LBst.Polymerase0.4|nL上述工序(l)所得到的核酸片段試樣溶液3.0ng純化水4.96uLIO都L(3)擴增產物的電泳對於所得到的擴增產物，採用3重量o/。的瓊脂糖凝膠、0.5xTBE緩衝液(50mMTris,45mM硼酸、0.5mMEDTA,pH8.4)，在100V下進行60分鐘的電泳。結果如圖12所示。無論採用哪種引物的組合，均可以得到梯狀的規則的電泳圖譜。由該結果可知，能夠得到具有一定規律的擴增產物，與實施例1一樣，可以認為通過標識序列形成了高分子量的產物。即，由該結果可知，能夠對擴增反應進行控制。作為比較例，沒有將鹼基序列(該鹼基序列為在作為模板的核酸片段的鹼基序列上，在與第二寡核苷酸引物的鹼基序列基本上互補的鹼基序列的下遊側(即3'末端側)所存在的鹼基序列)添加到第一寡核苷酸引物的5'末端進行核酸擴增，下面對該比較例進行描述。(1)含有靶核酸片段的核酸試樣溶液的配製將3.0ng的HumanGenomicDNA(Clontech公司製造)與預處理液(30mMNaOH、0.05%Tween20)—起在98"C下加熱3分鐘，使之成為單鏈後，在下述條件下對p2AR基因中的序列進行擴增。使用|32AR基因作為目標進行引物的設計。各引物的序列如下所示。引物(l)(正向引物)5，一CTTGCTGGCACCCAATA—3，(序列編號20)引物(2)(反向引物)5，—CCGGCGCATGGCTT—3'(序列編號4)上述引物相對於p2AR基因的位置關係的詳細情況如圖13所示。(2)核酸擴增反應採用具有如下所示組成的反應液，在6(TC下反應60分鐘，以實施擴增反應。酶使用的是NEB公司的Bst.DNAPolymerase。<反應液的組成〉10xBst緩衝液(DF)100mMMgS040.6nL10%(v/v)Tween20(UpE100%DMSO0.5pL25mMdNTP，每種0.56pLSYBRGreenIC稀釋2000倍)50nM引物(l)0.64pL50pM引物(2)Bst.Polymerase0.4nL上述(l)所得到的核酸片段試樣溶液(3.0ng)純化水_4.96^10単(3)擴增產物的電泳對於所得到的擴增產物，使用3重量M的瓊脂糖凝膠、0.5xTBE緩衝液(50mMTris,45mM硼酸、0.5mMEDTA,pH8.4)，在100V下進行60分鐘的電泳。結果如圖14所示。雖然有一些的規律性，但得到的是基本上為模糊不清的電泳圖譜。即，高分子量產物形成反應的規律性較低。序列表富士膠片株式會社核酸的擴增方法F卜081398-59:56〈150>JP2007-295337〈151>2007-11-14〈160>20PatentInversion3.3125DNA人工序列人工序列的描述合成DNA1ccacgacgcttgctggcacccaata25〈210>2〈211〉25〈212〉瞧人工序列〈223>人工序列的描述合成DNA〈400>2ggcaggaacttgctggcacccaata25〈210>3〈211>25〈212>■〈213>人工序列〈220>人工序列的描述合成DNA3tgggtggtcttgctggcaccca'ata25〈210〉4<211〉14<212〉DNA人工序列4ccggcgcatggctt14〈210>5<211〉17〈212〉隱<213〉人工序列人工序列的描述合成DNA5caggaaacagctatgac176〈211>42〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223>人工序列的描述擴增產物〈400>6ccacgacgttcttgctggcacccaatagaagccatgcgccgg42<210〉7〈211〉85DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉人工序列的描述擴增產物〈400〉7ccacgacgttcttgctggcacccaatagaagccatgcgccggaccacgacgttcttgctg60gcacccaatag33gcc3tgcgccgg858128DNA人工序列人工序列的描述擴增產物8ccacgacgttcttgctggcacccaatagaagccatgcgccggaccacgacgttcttgctg60gcacccaatagaagccatgcgccggaccacgacgttcttgctggcacccaatagaagcca120tgcgccgg128942〈212>DNA人工序列人工序列的描述擴增產物9gggacgagttcttgctggcacccaatagaagccatgcgccgg4210105瞧人工序列人工序列的描述擴增產物10gggacgagttcttgctggcacccaatagaagccatgcgccggaccacgacgtcacgcagg60aaagggacgagttcttgctggcacccaat3gaagccatgcgccgg105〈210>11〈211>168隨〈213>人工序列〈220>人工序列的描述擴增產物11gggacgagttcttgctggcacccaatagaagccatgcgccggaccacgacgtcacgcagg60aaagggacgagttcttgctggcacccaatagaagccatgcgccggaccacgacgtcacgc120aggaaagggacgagttcttgctggcacccaatagaagccatgcgccgg1681242DNA人工序列〈220>人工序列的描述擴增產物12tgggtggtttcttgctggcacccaatagaagccatgcgccgg4213116DNA人工序列人工序列的描述擴增產物13tgggtggtttcttgctggcacccaatagaagccatgcgccggaccacgacgtcacgcagg60aaagggacgaggtgtgggtggtttcttgctggcacccaatagaagccatgcgccgg11614190DNA〈213>人工序列人工序列的描述擴增產物14tgggtggtttcttgctggcacccaatagaagccatgcgccggaccacgacgtcacgcagg60aaagggacgaggtgtgggtggtttcttgctggcacccaatagaagccatgcgccggacca120cgacgtcacgcaggaaagggacgaggtgtgggtggtttcttgctggcacccaatagaagc180catgcgccgg1901521DNA人工序列人工序列的描述合成DNA15tggtcttgctggcacccaata2116〈211>25〈212〉DNA人工序列人工序列的描述合成DNA16tgggtggtcttgctggcacccaata2517〈211>29人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成DNA17tgggtggtgggccttgctggcacccaata2918〈211>31〈212>陽〈213〉人工序列人工序列的描述合成DNA〈400〉18tgggtggtgggcatcttgctggcacccaata3119〈211>17〈212〉DNA〈213〉人工序列人工序列的描述合成DNA〈400〉19tccctttcctgcgtgac1720〈211〉17DNA〈213〉人工序列〈223>人工序列的描述合成DNA20cttgctggcacccaata1權利要求1.一種核酸的擴增方法，其包括通過將含有至少一種脫氧核苷三磷酸、至少一種DNA聚合酶、至少兩種寡核苷酸引物、以及作為模板的核酸片段的反應溶液進行孵育，以上述引物的3』末端作為起點進行聚合酶反應，從而對所述核酸片段進行擴增，其特徵在於，將標識序列添加到第一寡核苷酸引物的5』末端，該標識序列為在作為模板的核酸片段中存在的一段鹼基序列，在所述模板上，該鹼基序列位於該模板中的與第一寡核苷酸引物的3』端部分基本上相同的序列的3』末端側，其中所述的第一寡核苷酸引物的3』端部分為第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分。2.權利要求1所述的核酸的擴增方法，其中，所述標識序列的3'末端的鹼基存在於，在作為模板的核酸片段的鹼基序列中的、與第二寡核苷酸引物的鹼基序列基本上互補的鹼基序列的3'末端側。3.權利要求1或2所述的核酸的擴增方法，其中，添加到第一寡核苷酸引物的5'末端上的標識序列為2個鹼基以上且20個鹼基以下的序列。4.權利要求13中任意一項所述的核酸的擴增方法，其中，添加到第一寡核苷酸引物的5，末端上的標識序列為在作為模板的核酸片段的鹼基序列中，在距與第一寡核苷酸引物的3'端部分基本上相同的序列的3'末端200個鹼基以內的區域中所存在的鹼基序列，其中所述第一寡核苷酸引物的3'端部分為第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分。5.權利要求14中任意一項所述的核酸的擴增方法，其中，所述反應溶液中還含有至少0.01%以上的表面活性劑。6.權利要求5所述的核酸的擴增方法，其中，所述表面活性劑為非離子型表面活性劑。7.權利要求6所述的核酸的擴增方法，其特徵在於，所述非離子型表面活性劑選自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯類、聚氧乙烯垸基醚類。8.權利要求17中任意一項所述的核酸的擴增方法，其中，所述反應溶液中還含有二價陽離子。9.權利要求18中任意一項所述的核酸的擴增方法，其中，所述反應溶液中還含有解鏈溫度調節劑。10.權利要求9所述的核酸的擴增方法，其中，所述解鏈溫度調節劑為二甲基亞碸、甜菜鹼、甲醯胺或甘油、或者它們中的兩種以上的混合物。11.權利要求110中任意一項所述的核酸的擴增方法，其中，所述的至少一種DNA聚合酶為具有鏈置換能力的DNA聚合酶。12.權利要求11所述的核酸的擴增方法，其中，所述的至少一種具有鏈置換能力的DNA聚合酶為選自來源於嗜熱脂肪芽孢桿菌的5'—3'外切核酸酶缺失的Bst.DNA聚合酶、來源於熱堅芽孢桿菌的5'—3'外切核酸酶缺失的BcaDNA聚合酶、來源於Thermococcuslitoralis的5'—3'外切核酸酶缺失的Vent.DNA聚合酶、及來源於酸熱脂環酸桿菌的DNA聚合酶中的聚合酶。13.權利要求112中任意一項所述的核酸的擴增方法，其中，核酸的擴增工序在基本上恆溫的條件下進行。14.權利要求13所述的核酸的擴增方法，其中，核酸的擴增工序在5(TC以上IO(TC以下的條件下進行。15.權利要求114中任意一項所述的核酸的擴增方法，其中，核酸的擴增工序基本上在60分鐘以內進行。全文摘要本發明提供一種使用寡核苷酸引物和DNA聚合酶進行核酸擴增的方法。本發明的擴增方法包括將含有至少一種脫氧核苷三磷酸、至少一種DNA聚合酶、至少兩種寡核苷酸引物、以及作為模板的核酸片段的反應溶液進行孵育，以上述引物的3』末端作為起點進行聚合酶反應，從而對該核酸片段進行擴增，其特徵在於，將標識序列添加到第一寡核苷酸引物的5』末端，該標識序列為在作為模板的核酸片段中存在的一段鹼基序列，在所述模板上，該鹼基序列位於該模板中的與第一寡核苷酸引物的3』端部分(第一寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3』末端側。文檔編號C12P19/34GK101434978SQ20081018091公開日2009年5月20日申請日期2008年11月14日優先權日2007年11月14日發明者三好隼人,巖木義英,森壽弘申請人:富士膠片株式會社