人神經肽受體的製作方法

2023-07-30 05:13:51 1

專利名稱：人神經肽受體的製作方法
技術領域：
本發明涉及新近鑑別的多核苷酸、由這些多核苷酸編碼的多肽、這些多核苷酸和多肽的用途以及這些多核苷酸和多肽的生產方法。本發明的多肽是人7-轉膜G-蛋白偶聯受體。更具體地說，本發明的多肽是神經肽受體多肽(此後有時稱作神經肽受體多肽)。本發明也涉及抑制這些多肽的作用的方法。
肥胖症是在西方社會中最普通的營養性疾病。十個成年的美國人中的三個體重超過他們理想體重的至少20％(Burroa，M.紐約時報，19947月17日)。增加的體重是一個重要的公共衛生問題，因為它與II型糖尿病，高血壓，血脂過多和某些癌症有關(Grundy，S.M.和Barnett，J.P.，Disease-a-Month，36645-696(1990))。
在導致肥胖表型的小鼠肥胖基因(ob)中的5個單一基因突變已有描述(Priedman，J.M.Leibel，R.L，細胞，66217-220(1990))。小鼠ob基因和其人類同系物的克隆與測序已被報導(Zhang，Y.，等，自然，372425-431(1994))。ob基因編碼具有高度保守的167個胺基酸的開放讀框的4.5-kb脂肪組織mRNA。預測的胺基酸序列在人類和小鼠之間84％相同，並且具有分泌蛋白質的特徵。ob基因產物可以作為脂肪組織信號途徑的一部分起作用，其為了調節身體脂肪積存而發揮作用(同上，425)。
在牽涉進食行為調節的腦區中，下丘腦的腹內側核(VMH)被認為是中樞神經系統(CNS)中最重要的飽滿中心。因此假定在哺乳動物中的能量平衡被反饋-環控制，在其中所存儲的能量的量由下丘腦感知，其調節食物攝入和能量消耗以維持恆定體溫(Ombeck，J.R.，Yale生物醫學雜誌，20545-552(1948)和Kennedy，G.C.，Proc.R.Soc.148578-592(1953))。在脂鬱積(lipostasis)理論中，身體脂肪積存的多少由CNS調節，身體脂肪代謝的產物通過與下丘腦相互作用來影響能量平衡(Kennedy，G.C.，Proc.R.Soc.148578-592(1953))。
不能從脂肪鑑別推定的信號障礙了脂鬱積理論的證實。至少一種信號系統的組分在血流中循環的可能性最早由Hervey提出(Dietrich，W.等，遺傳學，131423-447(1992))，他顯示了通過血管移植物將血液從具有VMH損傷的動物轉移到未處理的動物中(聯體生活實驗)導致在無傷的動物中食物攝取的減弱。現在明顯的是，具有ob基因產物被分泌的證據，表明ob可以編碼這一循環因子。
ob信號可以直接或者間接地作用於CNS上，以作為內環境穩定的機制的一部分抑制食物攝取和/或者調節能量消耗，保持脂肪質量的恆定性(Zhang，V等，自然，372425-431，431(1994))。ob基因顯然編碼脂肪分泌的蛋白質，並且突變明顯地阻止所述基因的翻譯或表達(Rink，T.，自然，372406-407(1994))。
聯體生活實驗表明ob受體由小鼠db(糖尿病)基因編碼(Coleman，D.L.，Diabetologia，14141-149(1978))。具有db基因中的突變的小鼠也肥胖，具有可能是受體缺損的缺損(同上，406)。
神經肽Y類似於ob基因產物之處在於它調節進食反應。神經肽Y作用於被稱為Y1、Y2、Y3和非典型的Y1受體(其調節由神經肽Y刺激的進食反應)的至少四種類型的神經肽Y受體上。
神經肽Y有各式各樣的生物功能。發現神經肽Y廣泛分布於中樞神經系統(CNS)和外周神經系統(PNS)中，在PNS中，神經肽Y在血管去甲腎上腺素能交感神經神經分布和其它平滑肌組織中以及腸神經系統內的神經元中發現。神經肽Y免疫反應性纖維也出現在非血管平滑肌中，圍繞著外分泌腺和表面上皮。神經肽Y也出現在神經元亞群中，一般與其它神經介質(特定的去甲腎上腺素)共同定位。
在CNS中，神經肽Y包含在更高的中心和優勢兒茶酚胺能細胞(其更後地凸出)的GABA能中間神經元中。例如，神經肽Y包含在皮、海馬、扁桃體、基部前腦和紋狀體中的中間神經元中，而在人腦幹中，神經肽Y包含在髓質和藍斑(locus coeruleus)(LC)中的A1和A2組的去甲腎上腺素能神經元中。在下丘腦中，神經肽Y顯著地在弓形核和外側下丘腦發現。
在外周神經系統內，神經肽Y存在於神經節後部交感神經中，並如上所述，與其它神經介質(包括兒茶酚胺)共同定位。當在藥理學上使用時，神經肽Y顯示出有效的血管收縮活性，並且戲劇性地加強由許多其它壓力劑產生的血管收縮。特別是，發現在交感神經中高濃度的神經肽Y使得冠狀、腦部和腎部血管收縮，並且當融合進這些血管床時，神經肽Y導致延長的不被腎上腺素能阻斷劑逆轉的血管收縮。這些觀察結果導致產生這樣一種觀點神經肽Y是病理學血管痙攣(當涉及冠狀和腦部血管時，是主要的發病和死亡因素)的候選介質。
神經肽Y似乎也牽涉與腎素血管緊張素系統的相互作用。在腎皮層近血管小球器官中發現含有交感神經末端的神經肽Y，並且神經肽影響腎素釋放。這些信息以及高血壓動物模型中神經肽Y濃度的所有持續時間的實證和輸注所述肽的壓力反應導致得自這樣一種結論這種肽牽涉到高血壓。
在中樞神經系統中，神經肽Y主要定位在中間神經元之內，在此其似乎具有調節作用。因此，其具有廣泛的和不同的作用，包括對記憶的作用和在阿耳茨海默氏病中的可能的作用。神經肽Y是引起增加進食的最有效的已知物質，可以在II型糖尿病的遺傳基礎中起作用。神經肽Y也可以作為壓迫反應和生殖功能中的調節劑和腦垂體功能以及潛在的神經調節功能發揮作用。
按照本發明的一個方面，本發明提供了新的成熟多肽以及其生物活性的和並且在診斷上或治療上有用的片段、類似物和衍生物。本發明的多肽是人類來源的。
按照本發明的另一個方面，本發明提供了編碼本發明的受體多肽的分離的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA以及其反義類似物和其生物學活性的並且在診斷上或治療上有用的片段和衍生物。
按照本發明的另一個方面，本發明提供了經重組技術產生這種受體多肽的方法，該方法包括在促進本發明的受體多肽表達的條件下，培養含有編碼所述受體多肽之核酸序列的重組原核和/或真核宿主細胞，並且接著回收所說的多肽。
按照本發明的另一個方面，本發明提供了這些多肽的抗體。
按照本發明的另一個方面，本發明提供了篩選結合到本發明的受體多肽上並激活該多肽或抑制該多肽的激活的化合物的方法。
按照本發明的另一實施方案，本發明提供了為了刺激神經元生長，調節神經傳遞，增強活性水平和攝取的食物的利用度，向宿主施用化合物的方法，所述化合物結合到本發明的受體多肽上並激活該多肽，該多肽在預防和/或治療肥胖、高脂血和某些癌症中是有用的。
按照本發明的另一個方面，本發明提供了經基因治療施用所述受體多肽的方法，以治療與本發明的受體多肽的過量表達或所述受體多肽之配體的表達不足相關的病症。
按照本發明的另一實施方案，本發明提供了向宿主施用化合物的方法，所述化合物結合到本發明的受體多肽上並抑制該多肽的激活，其在預防和/或治療阿耳茨海默氏病、II型糖尿病、癲癇、緊張、焦慮、高血壓，心血管病、精神病和由神經肽Y引起的肥胖中是有用的。
按照本發明的另一個方面，本發明提供了核酸探針，這種核酸探針包含長度足以特異性地與編碼本發明的多核苷酸序列雜交的核酸分子。
按照本發明的另一個方面，本發明提供了檢測與編碼本發明的多肽之核酸序列中的突變相關的疾病以及檢測受體多肽的可溶形式的改變的水平的診斷測定方法。
按照本發明的另一個方面，本發明提供了將這些受體多肽，或編碼這些多肽的多核苷酸體外用於與科學研究、DNA合成及DNA載體的人工合成有關之目的的方法。
從本文的教導中，本領域技術人員會清楚本發明的這些和其它方面。
下列附圖用來說明本發明的實施方案，而無意於用來限制本發明權利要求所包括的範圍。


圖1顯示了本發明的神經肽受體多肽的cDNA序列和相應的推導的胺基酸序列。使用了胺基酸標準單字母縮寫。採用373自動DNA測序儀(Applied Biosystem公司)進行測序。
圖2顯示了本發明的神經肽受體剪接變體1多肽的cDNA序列和相應的推導的胺基酸序列。使用了胺基酸標準單字母縮寫。
圖3顯示了本發明的神經肽受體剪接變體2多肽的cDNA序列和相應的推導的胺基酸序列。使用了胺基酸標準單字母縮寫。
圖4說明了所述神經肽受體的胺基酸序列和7個轉膜區。所述轉膜區有下劃線，並用TM表示。
圖5說明了所述神經肽受體剪接變體1的胺基酸序列和7個轉膜區。所述轉膜區有下劃線，並用TM表示。
圖6說明了所述神經肽受體剪接變體2的胺基酸序列和7個轉膜區。所述轉膜區有下劃線，並用TM表示。
圖7顯示了本發明的人神經肽受體多肽(和人神經肽Y1受體)之間的胺基酸同源性。
本發明的受體多肽是一些已知和未知配體的受體，所說配體調節中樞神經系統和由中樞神經系統調節的外周組織兩者中的細胞的活性。這種配體的例子是神經肽Y、物質P、人ob基因產物和神經激肽B。因此，本發明的受體多肽活性的調節會具有廣泛的治療和診斷用途，特別是對糖尿病的治療而言。
本發明人分離了編碼人類神經肽受體多肽的全長cDNA克隆。所述全長cDNA已被定位到人1號染色體位置p31-34上，其相應於發現db基因的小鼠4號染色體上的位置。人們認為小鼠db基因編碼肥胖基因產物的受體。
按照本發明的一個方面，本發明提供了一種分離的核酸(多核苷酸)，這種核酸編碼具有圖2的推導的胺基酸序列(SEQ ID NO2)的成熟多肽或由1995年4月27日以保藏號ATCC-----保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽。
本發明的多核苷酸在來源於成人下丘腦的cDNA文庫中發現，其在結構上和G蛋白偶聯受體家族相關，所述神經肽受體多肽包含一個編碼402個胺基酸殘基的蛋白質的開放讀框。所述神經肽受體蛋白質顯示出與人神經肽受體Y1受體蛋白質最高程度的同源性，在整個胺基酸序列上具有52％的相似性和26％的相同性。
本發明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。這種DNA可以是雙鏈或單鏈，並且如果是單鏈，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。這種編碼成熟多肽的編碼序列可以和圖1所示的編碼序列(SEQ ID NO1)或保藏的克隆的編碼序列相同；由於遺傳密碼的豐餘性或簡併性，這種編碼序列也可以是一種不同的編碼序列，其能和圖1的DNA(SEQ ID NO1)或所說保藏物的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖2的成熟多肽(SEQID NO2)或編碼由所述所說保藏物的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括僅僅是編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和可有可無的附加編碼序列)和非編碼序列，如內含子或成熟多肽編碼序列的5′和/或3′非編碼序列。
這樣，「編碼多肽的多核苷酸」這一術語包括只含有多肽編碼序列的多核苷酸以及還含有附加的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上文描述的多核苷酸變體，這種變體編碼具有圖2的推導的胺基酸序列(SEQ ID NO2)的多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這種多核苷酸變體可以是天然產生的多核苷酸等位變體或是非天然產生的多核苷酸變體。
這樣，本發明包括編碼如圖1所示的相同成熟多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及編碼如圖1(SEQ ID NO2)所示的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽的片段、衍生物和類似物的多核苷酸變體。這些核苷酸變體包括缺失變體、取代變體、添加或插入變體。這種變體的特定例子包括SEQ ID NO3和5所示的多核苷酸序列，其分別編碼本發明的多肽的剪接變體1和2。
正如上文所表明的，所述多核苷酸可以具有一種編碼序列，該序列是圖1中所示的編碼序列(SEQ ID NO1)或保藏的克隆的編碼序列的天然產生的等位變體。本領域已知等位變體是多核苷酸序列的另一種形式，其可以具有一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加，而實質上不改變所編碼的多肽的功能。
所述多核苷酸也可以編碼神經肽受體多肽的可溶形式，該多肽是本發明的全長多肽裂解TM和胞內功能域後的多肽的胞外部分。
本發明的多核苷酸也可以具有在讀框中與標記序列融合的編碼序列，所述的標記序列使得可以純化本發明的多核苷酸。在細菌宿主的情況下，所述的標記序列可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標記，其用來純化與標記融合的成熟多肽，或者例如當使用哺乳動物細胞(如COS-7細胞)時，標記序列可以是血細胞凝集素(HA)標記。所說的HA標記相應於來源於流感血細胞凝集素蛋白質的一種表位(Wilson，I.，等，細胞，37767(1984))。
本發明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(條件是兩個序列之間具有至少70％，優選地具有至少90％，更優選地具有至少95％的等同性)。本發明特別涉及在嚴格條件下與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所使用的，術語「嚴格條件」指僅在序列間具有至少95％，優選地具有至少97％的相同性時雜交才可以發生。在一個優選的實施方案中，與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼這樣一種多肽，其實質上保持與由圖1的cDNA(SEQ ID NO1)或所說保藏物的cDNA(s)編碼的成熟多肽相同的生物學功能或活性，即，通過保留結合受體之配體的的能力(即使所述多肽不能作為膜結合神經肽受體起作用)，例如通過引發第二信使反應，作為一種可溶性的神經肽受體起作用。
此外，所述多核苷酸可以具這樣一些多核苷酸，其具有至少20個鹼基，優選地是至少30個鹼基，更優選地是至少50個鹼基，其與本發明的多核苷酸雜交，並且如上所述具有與該多核苷酸的相同性，不保留活性。這種多核苷酸可以用作SEQ ID NO1多核苷酸或其變體的探針，例如或作為診斷探針或作為PCR引物用於回收多核苷酸。
本文所提及的保藏物將按照用於專利程序的國際承認的微生物保藏布達佩斯條約的規定保持。這些保持物僅僅是為了給本領域技術人員提供方便，並不是35 U.S.C 112條所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其編碼的胺基酸序列本文一併參考，並且用於解決本文序列描述上的任何矛盾。對保藏材料的任何製造、使用或者銷售需要經過許可，在此未給予任何這樣的許可。
本發明還涉及多肽，其具有圖2的推導的胺基酸序列(SEQ ID NO2)的FGF多肽或具有由所說保藏物的cDNA編碼的胺基酸序列的多肽，以及這種多肽的片段、類似物和衍生物。
術語「片段」、「衍生物」和「類似物」，當有關圖2的多肽(SEQ ID NO2)或由所說保藏物的cDNA編碼的多肽時，指基本上保持與這樣的多肽相同的生物功能或活性的多肽。即，通過保留結合受體之配體的的能力(即使所述多肽不能作為膜結合神經肽受體起作用)。這樣，類似物包括蛋白原，這種類似物可以由蛋白原部分切除進而產生活性成熟多肽激活。特定的例子分別是圖2和3(SEQ ID NO4和6)的剪接變體1和2。
本發明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或合成多肽，優選地是重組多肽。
所說的圖2的多肽(SEQ ID NO2)或由所說保藏物的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)這樣一種，其中一個或多個胺基酸殘基被保守或非保守胺基酸殘基取代(優選地是保守胺基酸殘基取代)取代並且取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的胺基酸殘基，或者(ii)這樣一種，其中一個或多個胺基酸殘基包含取代基，或者(iii)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物如增加多肽半壽期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)這樣一種，其中附加胺基酸與成熟多肽融合，例如這樣一種序列，其是用來純化成熟多肽的序列，或者(iv)成熟多肽的剪接變體，該變體可以具有從成熟多肽的一個或多個胺基酸缺失。通過本文的闡述，可以認為這樣的片段、衍生物以及類似物在本領域技術人員的知識範圍之內。
本發明優選地是提供分離形式的多肽和多核苷酸，並且優選地是將所述多肽和多核苷酸純化成同質性的。
術語「基因」是指和產生多肽鏈有關的DNA區段；其包括編碼區之前的區域和之後的區域(前導區和尾隨序列)以及在各個編碼區段(外顯子)之間的間插序列(內含子)。
術語「分離的」意指所述的物質脫離了其原始環境(例如，天然環境，如果其是天然產生的)。例如，一種存在於活的動物中的天然產生的多核苷酸或多肽不是分離的，但是與天然系統中某些或全部共存的物質分開的相同的多核苷酸或多肽是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分，和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，其仍然是分離的，這是因為這種載體或者組合物不是其天然環境的一部分。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體和用本發明的載體經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明的多肽的方法。
宿主細胞用本發明的載體經基因工程操作(轉導、轉化或轉染)，所說的載體可以是克隆載體或表達載體。該載體可以是例如，質粒、病毒顆粒和噬菌體等形式。工程化宿主細胞可以在修飾得適於激活啟動子、選擇轉化體或擴增人神經肽受體基因的常規營養培養基中培養。培養條件，例如溫度和pH值等，是以前用於表達選擇的宿主細胞的那些，對普通技術人員是顯而易見的。
本發明的多核苷酸可以用來經重組技術產生多肽。這樣，例如，多核苷酸可以包含在各種用於表達多肽的表達載體的任何一種中。這樣的載體包括染色體、非染色體和合成DNA序列，例如SV40衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA；杆狀病毒；酵母質粒；從質粒和噬菌體DNA組合衍生的載體、病毒DNA(如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒和假狂犬病病毒)。然而，任何其它載體也可以使用，只要其在宿主中可複製和穩定。
可以用多種方法將合適的DNA序列插入到載體中。一般來說，用本領域已知的方法將DNA序列插入到適當的限制性核酸內切酶位點。這樣的方法和其它方法被認為在本領域技術人員的知識範圍內。
在表達載體中所說的DNA序列可操作地連接到適當的指導mRNA合成的表達控制序列(啟動子)上。這樣的啟動子的代表性例子可以提到的是LTR或SV40啟動子，大腸桿菌的lac或trp、噬菌體λPL啟動子，和已知在原核或真核細胞或它們的病毒中控制基因表達的其它啟動子。所說的表達載體也包含用於翻譯起始和轉錄終止的核糖體結合位點。該載體也可以包含供擴增表達的合適的序列。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，其提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型特徵(例如真核細胞培養物的二氫葉酸還原酶或新黴素抗性，或例如大腸桿菌中的四環素和氨苄青黴素抗性)。
包含以上所述的適當的DNA序列以及適當的啟動子或者控制序列的載體可以用於轉化適當的宿主，以使其能夠表達蛋白質。
作為合適宿主的代表性例子，這裡可以提到的是細菌細胞，如大腸桿菌、鏈黴菌、鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞，如酵母；昆蟲細胞如Drosorphila S2和Spodoptera Sf9；動物細胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細胞等。通過本文的闡述，對適當的宿主的選擇在本領域技術人員的知識範圍之內。
更具體地說，本發明也包括重組構建體，該構建體包含以上廣泛描述的一種或多種序列。該構建體包含載體，如質粒或病毒的載體，該載體已正向或反向插入了本發明的序列。在這一實施方案的更為理想的情況下，構建體還包含可操作連接到所述序列上的調節序列，包括例如啟動子。大量適合的載體和啟動子是本領域技術人員已知的，並且是通過商業途徑可獲得的。以舉例的方式給出下列載體細菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca)；真核pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(St ratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它質粒或載體都可以使用，只要它們在宿主中可複製和穩定。
可以用CAT(氯黴素轉移酶)載體或其它帶有選擇性標記的載體從任何所需的基因選擇啟動子區。兩種合適的載體是PKK232-8和PCM7。特別提到的細菌啟動子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核生物啟動子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、得自逆轉錄病毒的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-I。對適當的載體與啟動子的選擇在本領域普通技術人員的水平之內。
在另一個實施方案中，本發明涉及包含以上所述構建體的宿主細胞。所說的宿主細胞可以是高等真核細胞(如哺乳動物細胞)，或低等真核細胞(如酵母細胞)，或者宿主細胞可以是原核細胞(如細菌細胞)。可以由磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染，或電穿孔有效地將構建體引入到宿主細胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物學中的基本方法，(1986))。
宿主細胞中的構建體可以用來以常規方式生產由重組序列編碼的基因產物。此外，本發明的多肽可以由常規肽合成儀合成產生。
本發明的多肽片段可以用於經肽合成產生相應的全長多肽。因此所述片段可以用作產生全長多肽的中間體。本發明的多肽片段可以以類似的方式用於合成本發明的全長多肽。
成熟蛋白質可以在哺乳動物細胞、酵母、細菌或其它細胞中在適當的啟動子控制下表達。採用來源於本發明的DNA構建體的RNA，無細胞翻譯系統也可以用來產生這種蛋白質。Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文一併參考)描述了與原核和真核宿主一起使用的合適的克隆和表達載體。
高等真核生物編碼本發明的多肽的DNA的轉錄被插入到載體中的增強子序列增強。增強子是DNA的順式作用元件，通常約10至300bp，作用在啟動子上增加其轉錄。例子包括複製起點晚期一側100至270 bp上的SV40增強子、細胞肥大病毒早期啟動子增強子、複製起點晚期一側上的多形瘤增強子以及腺病毒增強子。
一般來說，重組表達載體包括複製起點和允許宿主細胞轉化的選擇性標記(例如，大腸桿菌氨苄青黴素抗性基因和啤酒糖酵母TRP1基因)以及源於高表達基因的指導下遊結構序列轉錄的啟動子。這樣的啟動子可以是來自編碼糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、α-因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白質等的操縱子。異源結構序列以合適的方式(phase)與翻譯起始和終止序列裝配，優選地，與能夠指導翻譯的蛋白質分泌進周質空間或細胞外培養基的前導序列裝配。異源序列可以也可以不編碼融合蛋白，這種蛋白質包括賦予所需特徵的N-末端鑑別肽，所需特徵例如，表達的重組產物穩定或簡化純化步驟。
通過將編碼所需蛋白質的結構DNA序列及合適的翻譯起始和終止信號以可操作閱讀方式(reading phase)與具有功能性啟動子一起插入來構建用於細菌的有用的表達載體。所說載體包含一個或多個表型選擇性標記和複製起點，以在宿主來保證保持載體和需要時提供擴增。適合轉化的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、假單胞菌屬、鏈黴菌屬和葡萄球菌屬的各種(雖然其它的也可以選擇來使用)。
作為一個代表性的但不是限制性的例子，用於細菌的有用的表達載體可以包含源於市售質粒(包含眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳元件)的選擇性標記和細菌複製起點。這樣的市售載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化學品公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美國)。這些pBR322「骨架」片段與適當的啟動子和待表達的結構序列組合。
在合適的宿主菌株轉化和合適的宿主菌株生長至適當的細胞密度之後，用合適的方法(例如溫度變換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞培養另外一段時間。
典型地經離心收穫細胞，經物理或化學方法破碎細胞，保持所形成的粗產物用於進一步的純化。
可以經任何常規的方法破碎用於表達蛋白質的微生物細胞，所述方法包括凍融循環、聲處理、機械破碎或使用細胞裂解劑。這些方法是本領域技術人員公知的。
各種哺乳動物細胞培養系統也可以用於表達重組蛋白質。哺乳動物表達系統的例子包括由Gluzman(細胞，23175(1981))描述的猴腎成纖維細胞COS-7細胞系和其它能夠表達相容載體的細胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體包含複製起點、適合的啟動子和增強子，也可以包含任何必需的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉錄終止序列和5』側翼非轉錄序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位點的DNA序列可以用來提供所需的非轉錄遺傳元件。
本發明的神經肽受體多肽可以用以前所使用的方法從重組細胞培養物回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉澱、酸抽取、陰離子或陽離子交換層析、磷纖維素層析、疏水相互作用層析、親和性層析、羥基磷灰石層析和植物凝集素層析。需要時在完成成熟蛋白質的構型中可以使用蛋白質再摺疊步驟。最後，可以使用高效液相層析(HPLC)作為最後的純化步驟。
本發明的神經肽受體多肽可以是天然純化的產物，或化學合成方法的產物，或經重組技術從原核或真核宿主(例如細菌、酵母、高等植物、培養的昆蟲和哺乳動物細胞)產生的。依據重組產生方法中使用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本發明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸胺基酸殘基。
本發明的多核苷酸和多肽可以用作人類疾病的治療和診斷的研究試劑和材料。
本發明的人類神經肽受體多肽可以用於篩選結合併激活所述受體多肽的化合物的方法中，和用於篩選結合到本發明的受體多肽上並抑制其激活的化合物的方法中。
一般來說，將分離的，固定化的或者細胞結合形式的神經肽受體與多種化合物接觸並選擇那些與所述受體結合併與其相互作用的化合物。通過採用放射性標記的感興趣化合物或通過從候選化合物的相互作用和結合產生的第二信使效應可以直接測定所述的結合或相互作用。此外，可以對候選化合物進行競爭篩選測定，其中將已知配體和待試驗的化合物一起引入，並測量化合物抑制或者增強標記配體結合的能力，優選的配體是用分析上可檢測的試劑標記的，最優選的是放射活性的。就化合物對本發明的受體多肽的增加的親和性和選擇性來篩選化合物。
一種這樣的方法涉及使用黑素細胞，該細胞是被轉染的以表達本發明的神經肽受體。在1992年2月6日出版的PCT WO 92/01810中描述了這種篩選技術。
例如，為了篩選抑制本發明的受體多肽激活的化合物，將所述化合物和已知結合受體的配體與黑素細胞接觸。對配體產生的信號的抑制作用表明所述化合物抑制所述受體的激活。
通過將所述細胞與待篩選的化合物接觸並檢測這種化合物是否產生信號(即激活受體)，該篩選方法可以用於測定結合併活化本發明的受體多肽的化合物。
其它例子包括在測定由受體激活引起的胞外pH改變的系統中使用表達本發明的受體多肽的細胞(例如，轉染的CHO細胞)，例如科學，246卷，181-296(1989年10月)中所描述的。例如，可以將化合物與表達本發明的受體多肽的細胞接觸，並可以檢測第二信使反應(例如信號轉導或pH改變)，以確定所述潛在的化合物作為激活劑或抑制劑是否有效。
另一個例子涉及將編碼本發明的神經肽受體的RNA引入到非洲蟾蜍屬卵母細胞中以瞬時表達所述受體。然後，可以將卵母細胞與受體配體和待篩選的化合物接觸，接著檢測胞內鈣的抑制或增加。
另一個例子涉及在細胞表面表達本發明的神經肽受體多肽，其中，所述受體多肽連接到磷脂C或D上。作為這些細胞的代表性例子可以提到的是內皮細胞、平滑肌細胞、胚腎細胞等。可以如上所述從磷脂第二信號檢測受體激活或受體激活的抑制來完成所述篩選。
另一種方法涉及測定標記配體結合到細胞(在其表面上具有神經肽受體)上的抑制作用。這樣一種方法包括用編碼本發明的神經肽受體多肽的DNA轉染真核細胞以便所述細胞在其表面表達所述受體，並且在標記形式的已知配體存在下使細胞與化合物接觸。所述配體可以是例如用放射性標記的。通過例如測定受體的放射性檢測連接到受體上的標記配體的量。如果在經結合到受體上的標記配體的減少測得化合物結合到受體上，則標記配體與受體的結合受到抑制。
另一種篩選技術涉及在細胞表面表達本發明的神經肽受體多肽，其中，所述受體多肽連接到第二信使上以增加轉染CHO細胞中胞質鈣水平。這種方法的例子包括用編碼本發明的受體的核酸序列轉染CHO細胞，以便所述受體在其表面表達。然後，將轉染過的細胞在待篩選的化合物存在下在具有標記鈣的反應混合物中培養。然後通過利用標記(例如放射性)檢測轉運到細胞中的標記鈣的量可以測定化合物增加鈣攝入或抑制鈣攝入的能力。
結合到CNS內的特定亞區上的化合物也可以通過以上方法鑑別，所述亞區對通過與本發明的神經肽受體多肽的間接相互作用的特定行為是重要的。
為了測定胞內環狀AMP水平，在用100微摩爾異丁基黃嘌呤(ISMX；西格馬)處理15分鐘的全細胞中測定環狀AMP。將轉染細胞(1X106/0.5毫升)用10微摩爾毛喉素和各種濃度的已知或未知受體配體溫育。經添加鹽酸至0.1M，在室溫下溫育15分鐘，中和並以50mM乙酸鈉(pH6.2)進行樣品稀釋終止反應。採用放射免疫測定法定量環狀APM。
為了測定胞內鈣水平，將轉染細胞懸浮在上樣培養基(修飾的RPMI 1640培養基/10mM Hepes/1％新生牛血清)中並在旋轉搖瓶中以1X106個細胞/毫升於37℃溫育2.5小時。然後於37℃用1微摩爾Fura-2乙氧甲基酯(Fura-2AM；分子探針)處理細胞30分鐘，用上樣培養基洗滌兩次，並以5X106個細胞/毫升再懸浮。在將要螢光分光光度分析之前，在1000 rpm下經離心回收細胞，在含有磺吡酮的修飾的Krebs緩衝液(135 mM NaCl/4.7 mM KCl/1.2 mM MgSO4/1.2mMKH2PO4/5mM NaHCO3/1mM CaCl2/2.8 mM葡萄糖/10 mM hepes，pH7.4)中以1X106個細胞/毫升再懸浮。Bombesin購自西格瑪和Auspep。用5nm狹縫寬度和2秒的反應時間在340nm(激發)和505nm(發射)處在Hitachi螢光分光光度計(F4010)上進行螢光記錄。採用Grynkiewicz等，生物化學雜誌2603440-3450，1985描述的等式定量胞內鈣。
本發明也提供了治療和/或預防肥胖的方法，該方法通過對宿主施用結合併激活本發明的受體多肽的化合物。這樣一種化合物不是Zhang，等，自然，372425-431(1994)所公開的ob基因產物。本發明的受體多肽在人染色體上的位置相應於編碼ab基因產物之受體的小鼠染色體的位置。人ob基因編碼「飽滿」(satiety)因子，該因子結合併激活本發明的受體多肽。因此，激活本發明的受體多肽的化合物會降低食慾和阻止肥胖。
以上描述的化合物也可以用於增強活動水平、改善進餐行為、增加消化食物的利用度和調節脂肪貯藏的積存。也可以用結合併激活本發明的受體多肽的化合物治療與肥胖相關的病症，包括血脂過多、II型糖尿病和某些癌症。
這些化合物也可以用於治療和/或預防其它與本發明受體多肽或結合到其上的配體的表達不足相關的病症，例如用於刺激神經元生長。
抑制本發明的受體多肽激活的化合物的特定的例子包括抗體，或者在某些情況下包括寡核苷酸，其結合所述受體但不引發第二信使反應從而阻止所述受體的活性。
另一個例子是與受體配體密切相關的蛋白質，即配體片段，其喪失了生物學功能，並且在結合到受體上時不引發反應。
另一個例子是採用反義技術製備的反義構建體。反義技術可以通過三螺旋形成或反義DNA或者RNA來控制基因的表達，這兩種方法都基於多核苷酸和DNA或者RNA的結合。例如，編碼本發明的成熟多肽的多核苷酸序列的5』編碼部分可以用來設計長度約10至40個鹼基對的反義RNA寡核苷酸。一種DNA寡核苷酸被設計成與轉錄所涉及的基因區互補(三螺旋-參見Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學，241456，(1988)；和Dervan等，科學，2511360(1991))，進而阻止本發明多肽的轉錄和產生。反義RNA寡核苷酸在體內和mRNA雜交，並阻斷mRNA分子翻譯成為本發明的多肽(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；寡脫氧核苷酸作為基因表達的反義抑制劑(CRC出版社，Boca Raton，FL(1988))。以上描述的寡核苷酸可以傳送到細胞中，以便可以體內表達反義RNA和DNA，抑制所述多肽的產生。
另一個例子是小分子，這些小分子結合到本發明的神經肽受體上，使得受體不能接近其配體，由此阻止正常的生物學活性。小分子的例子包括但不限於小肽或類肽分子以及神經肽Y片段和/或衍生物。
本發明的神經肽受體多肽的可溶性形式(例如，受體的片段，其結合到配體上並阻止配體與膜結合受體相互作用)也可以抑制本發明的受體多肽的激活。
本發明還提供了將抑制激活的這種化合物用於治療與本發明的神經肽受體多肽的過量活性相關的異常疾病和治療肥胖的方法，這是因為本發明的神經肽受體多肽可以結合神經肽Y，後者是引起進食行為增加和II型糖尿病的最有力的已知物質，神經肽Y可以在這一疾病的遺傳基礎中起作用。
本發明的抑制受體多肽激活的化合物可以用於治療和/或預防高血壓，這是因為神經肽Y刺激腎素釋放並且已知神經肽Y在涉及冠狀和腦部血管時具有潛在的血管收縮活性。
本發明的化合物也可以用於治療阿耳茨海默氏病，這是因為神經肽受體在中樞神經系統中普遍存在，並且佔優勢地定位在內神經元內，此時，它們顯得對記憶和阿耳茨海默氏病具有調節作用。
所述化合物也可以用於在海馬中抑制神經肽Y的刺激性傳遞，並因此可以用於治療癲癇發作、緊張和憂慮。
神經肽受體在中樞神經系統中普遍性表明抑制本發明的神經肽受體多肽的化合物通過調節神經傳遞可以用作抗精神病的藥物。
抑制本發明的受體多肽的化合物也可以用於治療病理性血管痙攣，包括冠狀和腦部血管的血管痙攣。
本發明也提供了測定未知是否能夠結合到本發明的神經肽受體上的配體是否可以結合到其上的方法，該方法包括在足以使以前鑑別為結合這樣的受體的配體結合到受體上的條件下，把待鑑別的配體與包含神經肽受體編碼序列並在其表面上表達該序列的細胞接觸。在其它實施方案中，包含受體的細胞膜組分或分離的游離受體或固定在固體支持物上的分離受體可以用於測定待試驗的配體的結合。當重組細胞用於受體表達目的時，優選地是使用具有少的或者沒有內源性受體活性的細胞，以便結合(如果存在任何結合的話)是由於表達的目的受體的存在所致。優選的細胞包括人類早期腎細胞、猴腎(HEK-293細胞)、成纖維細胞(COS)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、果蠅或鼠L-細胞。優選地採用其中存在受體反應性第二信使系統的細胞為宿主細胞。著名的第二信使系統包括在響應配體結合到胞外受體域中磷酸肌醇水解、腺苷酸環化酶、鳥苷酸環化酶或離子通道活性的增加或減少。在另外的實施方案中，可以構建特異設計的受體結合指示劑。例如，融合蛋白可以通過把本發明的受體與對受體配體結合敏感的蛋白質功能域融合來製備。這裡稱作指示劑功能域的這種功能域自身或者與附加分子一起能夠產生分析上可檢測的信號，其指示受體配體結合。
本發明也提供了通過檢測編碼受體的mRNA的存在而檢測本發明的神經肽受體多肽在細胞表面上表達的方法，該方法包括從細胞獲得總mRNA，將如此獲得的mRNA與核酸探針接觸(所述探針包含至少10個核苷酸的核酸分子，在雜交條件下其能夠與包含在編碼所述受體的核酸分子內的序列特異性地雜交)，檢測雜交到探針上的mRNA的存在，進而檢測細胞對受體的表達。
本發明也提供了用於鑑別與本發明的受體多肽相關的受體的方法。可以由與本發明的神經肽受體多肽的同源性鑑別這些相關受體，其是通過低嚴格性交叉雜交、或通過鑑別受體進行的，所述受體與相關天然或合成配體相互作用或在本發明的神經肽受體多肽的遺傳或藥理學阻滯後激發類似的行為。
所述基因片段可以用作cDNA文庫的雜交探針，以分離具有與本發明的基因高同源性或者類似生物學活性的的其它序列。這種類型的探針優選地具有50個鹼基或者更多。所述探針也可以用於鑑別與全長轉錄物和基因組克隆或克隆相應的cDNA克隆，其包含包括調節和啟動子區、外顯子和內含子在內的本發明的完整基因。這種類型的篩選的實例包括通過利用已知DNA序列合成寡核苷酸探針分離所說基因的編碼區。具有與本發明的基因的序列互補性的標記的寡核苷酸用於篩選人類cDNA、基因組DNA或mRNA文庫以確定探針雜交到文庫的哪些成員上。
所述神經肽受體多肽和以上鑑別的為多肽的化合物可以依據本發明通過體內表達這樣的多肽來利用，這常被稱作「基因治療」。
這樣，例如，可以體外對細胞用編碼多肽的多核苷酸(DNA或者RNA)進行基因工程操作，用工程細胞向被治療的患者提供所說的多肽。這樣的方法是本領域眾所周知的，並且由本文的描述也顯而易見。例如，可以用本領域公知的方法用包含編碼本發明的多肽的RNA的逆轉錄病毒顆粒對細胞進行基因工程操作。
同樣地，可以通過例如本領域已知的方法體內對細胞進行基因工程操作，以便體內表達多肽。如本領域已知的，產生包含編碼本發明的多肽之RNA的逆轉錄病毒顆粒的產生細胞可以施用到患者以便體內經基因工程操作細胞並體內表達所說的多肽。經本發明的描述，通過這種方式施用本發明多肽的這些或其它方法對本領域技術人員是清楚的。例如，經基因工程操作細胞的載體可以不是逆轉錄病毒，而是例如腺病毒，其可以在與合適的運送載體組合後用於體內經基因工程操作細胞。
可以得自上文描述的反轉錄病毒質粒載體的反轉錄病毒包括但不限於莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾壞死病毒、反轉錄病毒如勞氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽類白血病病毒、長臂猿猩猩白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增值肉瘤病毒和乳房腫瘤病毒。在一個實施方案中，反轉錄病毒質粒載體來自莫洛尼氏鼠白血病病毒。
所述載體包含一個或多個啟動子。可以使用的合適的啟動子包括但不限於反轉錄病毒LTR；SV40啟動子；和人類巨細胞病毒(CMV)啟動子(Miller，等，生物技術，Vol.7，No.9,980-990(1989)描述)；或者其它任何啟動子(例如真核細胞啟動子，如包括但不限於組蛋白、po1 III和β-肌動蛋白啟動子)。使用的其它病毒啟動子包括但不限於腺病毒啟動子、胸苷激酶(TK)啟動子和B19細小病毒啟動子。通過本文的描述，合適的啟動子的選擇在本領域技術人員的知識範圍內。
編碼本發明多肽的核酸序列在合適的啟動子控制下。可以使用的合適的啟動子包括，但不限於腺病毒啟動子(如腺病毒主要晚期啟動子)；或者異源啟動子(如巨細胞病毒(CMV)啟動子)；呼吸合胞體病毒(RSV)啟動子；可誘導的啟動子(如MMT啟動子、金屬硫蛋白啟動子)；熱休克啟動子；清蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人類珠蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子(如單純皰疹胸苷激酶啟動子)；反轉錄病毒LTRs(包括上文描述的修飾的反轉錄病毒LTRs)；β-肌動蛋白啟動子；和人類生長激素啟動子。所說的啟動子也可以是控制編碼所述多肽之基因的天然啟動子。
使用反轉錄病毒質粒載體轉導包裝細胞系以便形成生產細胞系。可以被轉染的包裝細胞的例子包括但不限於PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DNA細胞系(Miller、人類基因治療，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述的，其全部內容本文一併參考)。可以通過本領域任何已知的方法用所述載體轉導包裝細胞。這些方法包括但不限於電穿孔、使用脂質體和CaPO4沉澱。另外，反轉錄病毒質粒載體可以包囊在脂質體中，或者和脂類偶合，然後施用到宿主中。
生產細胞系產生感染性的反轉錄病毒載體顆粒，這種顆粒包含編碼所述多肽的核酸序列。然後可以使用這些反轉錄病毒載體顆粒體內或者體外轉導真核細胞。轉導的真核細胞將表達編碼所述多肽的核酸序列。可被轉導的真核細胞包括但不限於胚幹細胞、胚癌細胞、以及造血幹細胞、肝細胞、成纖維細胞、成肌細胞、角質化細胞、內皮細胞和支氣管上皮細胞。
可溶性神經肽受體多肽和結合併激活本發明的受體或者抑制其激活的化合物也可以用於與合適的藥物載體組合。這種組合物包含治療有效量的所述可溶性神經肽受體多肽或化合物以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這樣的載體包括但不限於鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和它們的組合體。配方應適合於施用模式。
本發明也提供了藥物包或試劑盒，它們包含一個或多個填裝有本發明的藥物組合物的一種或多種成份的容器。這種容器中可以附有管理藥物和生物製品製造、使用或銷售的政府機構規定形式的告示，這一告示反映了製造、使用或銷售人類使用品得到政府機構的同意。此外，本發明的可溶性神經肽受體多肽或化合物可以與其它治療化合物結合使用。
所述藥物組合物可以以方便的方式施用，所述方式例如局部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或真皮內途徑施用。所說的藥物組合物以治療和/或預防特定疾病的有效量施用。一般來說，它們以至少大約10微克/千克體重的量施用，在大多數情況下，它們以不超過每天大約8毫克/千克體重的量施用。在大多數情況之下，考慮用藥途徑和病症等因素，劑量從每日大約10微克/千克到1毫克/千克體重。
本發明也涉及本發明的基因作為診斷劑的用途，例如由遺傳缺陷基因引起的某些疾病的診斷劑。可以通過比較缺陷基因序列與正常基因序列來檢測這些基因。接著，人們可以證實「突變」基因與異常受體活性相關。此外，人們可以在功能性測定系統(例如比色測定、在MacConkey平板上的表達、互補實驗，HEK293細胞的受體缺陷株中)中將突變受體基因插入到合適的表達載體中，其作為證實或鑑別突變的另一種方法。一旦「突變」基因被鑑別出，人們就可以篩選「突變」受體基因載體群。
可以用各種技術在DNA水平上檢測具有本發明的人基因突變的個體。可以從患者的細胞(包括但不限於例如血液，尿，唾液，組織活組織檢查和屍體解剖材料)獲得用於診斷的核酸。基因組DNA可以直接用於檢測，或者在分析前用PCR酶促擴增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或者cDNA也可以用於相同的目的。作為一個例子，可以用與編碼本發明多肽的核苷酸互補的PCR引物鑑別和分析其突變。例如，可以通過與正常遺傳型比較的擴增產物大小上的改變來檢測缺失或者插入。點突變可以經擴增的DNA與放射性標記的RNA或者放射性標記的反義DNA序列雜交鑑別。經核糖核酸酶A消化，或者從熔點溫度的不同辨別完美配對的序列和錯配雙鏈體。這種診斷劑在潛在的或甚至是新生期試驗中會是特別有用的。
可以通過直接DNA測序方法揭示參照基因和「突變」基因之間的序列差異性。此外，克隆的DNA區段可以用作檢測特定DNA區段的探針。當與PCR組合時，這一方法的靈敏性得到極大的提高。例如，使用序列引物，其具有雙鏈PCR產物或由修飾的PCR產生的單鏈模板分子。用放射標記的核苷酸經常規方法或者用螢光標記經自動測序方法完成序列測定。
基於DNA序列差異的遺傳試驗可以通過檢測在有或沒有變性劑時凝膠上DNA片段電泳遷移率的改變完成。也可以由核酸酶保護測定法(如核糖核酸酶保護和S1保護)以及化學裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美國，854397-4401(1985))揭示特定位置上的序列變化。
此外，某些疾病起因於基因表達的變化或者以其為特徵，這種變化可以由mRNA的變化來檢測。另外，本發明的基因可以用作參照用於鑑別表達降低的與這一類型的受體相關之功能的個體。
本發明也涉及用於檢測各種組織中本發明的神經肽受體多肽的可溶形式的改變的水平的診斷測定法。用於檢測來源於宿主的樣品中的可溶性受體多肽水平的測定法對本領域技術人員是熟知的，包括放射免疫測定、競爭-結合測定、Western印跡分析，優選地是ELISA測定。
ELISA測定起初包括製備對神經肽受體多肽抗原特異性的抗體，優選地是一種單克隆抗體。此外，製備針對所述單克隆抗體的報導抗體。所述報導抗體上連接有可檢測試劑，例如放射性，螢光或在這一實例中的辣根過氧化物酶。然後，從宿主取得樣品，在固體支持物上溫育，所述支持物例如聚苯乙烯皿，其結合樣品中的蛋白質。通過與非特異性蛋白質(例如牛血清白蛋白)一起溫育覆蓋皿上任何游離的蛋白質結合位點。接著溫育所述的單克隆抗體，在此期間，單克隆抗體連接到任何與聚苯乙烯皿連接的神經肽受體蛋白質上。用緩衝液洗滌掉所有未結合的單克隆抗體。然後將連接到辣根過氧化物酶上的報導抗體置於皿中，使得報導抗體結合到任何與神經肽受體蛋白質連接的抗體上。洗掉未連接的抗體。將過氧化物酶底物添加到皿中。但與標準曲線比較時，在給定的時間期限內產生的顏色的量是存在於給定體積患者樣品中的神經肽受體蛋白質的量。
本發明的序列對染色體鑑定也是有價值的。該序列特異地靶向位於單個的人染色體上的特定位置並能與之雜交。此外，現在需要鑑定染色體上的特定位點。目前，僅有少數幾種以實際的序列數據(重複多態性)為基礎的染色體標記試劑可以用於標記染色體的位置。本發明的DNA染色體作圖是將這些序列和疾病相關基因相關聯的重要的第一步。
簡而言之，通過從cDNA製備PCR引物(優選10-25bp)便可以把序列定位到染色體上。採用3』未翻譯區域的計算機分析可以快速地選擇引物，其中引物不應跨越超過基因組DNA上的一個外顯子，否則使得擴增方法複雜化。然後採用這些引物用於PCR篩選含有單個的人染色體的體細胞雜交體。只有那些含有與該引物對應的人基因的雜交體才會生產擴增片段。
體細胞雜交體的PCR作圖是將一個特定的DNA定位於特定的染色體上的快速程序。根據本發明採用同樣的寡核苷酸引物，用來自於特定染色體或者大基因組克隆集合體的一組片段、按照類似方式可以實現亞定位(sublocalization)。可以類似地用於對染色體作圖的其它的作圖策略包括原位雜交，用標記的經流式分選的染色體進行預篩選以及通過雜交進行預選，從而構建出染色體特異性的cDNA文庫。
cDNA克隆與中期染色體塗片的螢光原位雜交(FISH)可以用來實現一步法準確染色體定位。該技術可以採用50或60個鹼基長短的cDNA。關於該技術的綜述參閱Verma等，人類染色體基本技術手冊，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦序列已定位到一個準確的染色體位置，則染色體上該序列的物理位置可與遺傳圖譜數據相關聯。這些數據例如可在V.McKusick，人類的孟德爾遺傳中找到(可以通過Johns Hopkins大學Welch醫學文庫聯機得到)。然後通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳性)來鑑定基因與已定位到相同染色體區域上的疾病之間的關係。
接下來需要測定在受影響的和未受影響的個體之間cDNA或基因組序列中的差異。如果突變是在一些或所有的受影響個體中觀察到的、但是又沒有在任何一個正常個體中被觀察到的話，那麼該突變可能是疾病的病因。
根據物理作圖和遺傳作圖技術目前的解析度，一個被準確定位到與疾病有關的染色體區域的cDNA可以是50-500個潛在的致病(causative)基因中的一種(其中假定有1兆鹼基的作圖解析度且每20kb為一個基因)。
所述的多肽、其片段或衍生物或類似物、或者表達上述物質的細胞可以用作生產其抗體的免疫原。這些抗體可以是例如多克隆抗體或者單克隆抗體。本發明也包括嵌合，單鏈和人源化的抗體，以及Fab片段或Fab表達文庫的產物。本領域已知的多種方法可以用於生產這些抗體和片段。
可以通過對動物直接注射多肽或者對動物(優選地是非人動物)施用多肽獲得抗相應於本發明的序列的多肽產生的抗體。然後如此獲得的抗體結合多肽本身。按這種方式，即使是編碼多肽的一個片段的序列也可以用於產生結合全部天然多肽的抗體。用這種抗體從表達多肽的組織中分離多肽。
對於單克隆抗體的製備，可以使用任何提供由傳代細胞系培養物產生抗體的技術。例子包括產生人單克隆抗體的雜交瘤技術(Kohler和Milstein，1975，自然，256495-497)、trioma技術、人B-細胞雜交瘤技術(Kozbor等，1983，當今免疫學，472)和EB病毒-雜交瘤技術(Cole等，1985，單克隆抗體和癌療法，Alan R. Liss公司，pp.77-96)。
所描述的有關單鏈抗體產生的技術(美國專利4,946,778)可以用來產生抗本發明的免疫原性多肽產物的單鏈抗體。也可以利用轉基因小鼠表達抗本發明的免疫原性多肽產品的人源化抗體。
本發明將參照下面的實施例進一步加以說明；但是，應當了解本發明並不局限於這些實施例。除非另作聲明的以外，所有的份或量均為重量。
為了利於理解以下的實施例，現敘述一些經常出現的方法和/或術語。
「質粒」通過一個在前的小寫p和/或跟隨幾個大寫字母和/或數字加以命名。本文中的起始質粒或者可以通過商業途徑得到或在不受限制的基礎上公眾可得到，或者可以根據已公開的方法從可得到的質粒中構建出來。此外，對於與那些所述等價的質粒是本領域已知的並且對本領域普通技術人員是顯而易見的。
DNA的「消化」是指用一種僅對DNA上的某些序列起作用的限制性酶催化裂解DNA。本文所採用的多種限制性酶可以通過商業途徑得到，並且其反應條件、輔因子和其它使用要求對本領域普通技術人員是已知的。為了分析目的，通常把1μg的質粒或DNA片段與溶於約20μl緩衝溶液的約2單位的酶一起使用。為了分離用於質粒構建的DNA片段，通常在一個更大的體積內用20至250單位的酶消化5至50μg的DNA。針對具體的限制性酶而言，合適的緩衝溶液和底物的量是由生產者規定的。通常採用在37℃下約1小時的溫育時間，但是該時間可以根據產品供應者的指示而變化。在消化後，反應混合物直接在聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳以分離出所需的片段。
採用由Goeddel，D.等，核酸研究，84057(1980)所述的8％聚丙烯醯胺凝膠進行裂解片段的大小分離。
「寡核苷酸」或指一種單鏈多脫氧核苷酸，或指可以通過化學合成的兩條互補的多脫氧核苷酸鏈。這些合成的寡核苷酸不具有5』磷酸，因此如果不在一種激酶存在下以ATP添加一個磷酸時，該寡核苷酸將不會連接到另一個寡核苷酸上。合成的寡核苷酸將連接到未被去磷酸化的片段上。
「連接」是指在兩個雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，等，出處同上，p.146)。除非另行提供的以外，採用已知的緩衝液和條件、每0.5μg約等摩爾量的待連接DNA片段10單位T4DNA連接酶(「連接酶」)來實現連接。
除非另有說明，按Graham，F.和Van der Eb，A.，病毒學，52456-457(1973)所述的方法進行轉化。
實施例1
神經肽受體的細菌表達和純化利用PCR寡核苷酸引物起始擴增編碼神經肽受體的DNA序列(ATCC#-----)，所說的引物相應於加工過的神經肽受體基因的5』和3』末端序列(減信號肽序列)和所述基因的3』載體序列』。將相應於神經肽受體基因的附加核苷酸分別加入到5』和3』序列中。所說的5』寡核苷酸引物具有序列5』CACTAAAGCTTAATGGAGCCCTCAGCCACC 3′(SEQ ID NO7)，並含有HindIII限制性內切酶位點，後面接著從推測的加工蛋白質的末端胺基酸密碼子開始的神經肽受體編碼序列的18個核苷酸。所說的3』序列5』ACAAGTCCTTGTCCTTCTAGAGGGC 3′(SEQ ID NO8)含有XbaI位點。所說的限制性內切酶位點相應於細菌表達載體pQE-9(Qiagen公司，Chatsworth，CA)的限制性內切酶位點。pQE-9編碼抗生素抗性(Ampr)、細菌的複製起點(ori)、IPTG可調節的啟動子操縱子(P/O)、核糖體結合位點(RBS)、6-組氨酸標記和限制性內切酶位點。然後用Hind III和XbaI消化pQE-9。將擴增的序列連接到pQE-9中並將其插入到帶有組氨酸標記編碼序列和RBS的讀框中。然後通過Sambrook等(分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版社，(1989))描述的方法，用連接混合物轉化大腸桿菌菌株M15/rep 4(Qiagen，公司)。M15/rep4包含質粒pREP4的多拷貝，這種質粒表達lacI阻遏物同時賦予卡那黴素抗性(Kanr)。通過轉化體在LB平板上的生長能力鑑定轉化體，並選擇出氨苄青黴素/卡那黴素抗性菌落。通過限制分析分離並確認質粒DNA。將含有所需構建體的克隆在補充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養基中過夜(O/N)生長。將O/N培養物以1∶100至1∶250的比率接種大體積培養物。細胞生長至光密度600(O.D.600)為0.4和0.6之間時，加入IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至最終濃度為1mM。IPTG通過滅活lacI阻遏物、清除P/O誘導基因增加表達。將細胞再培養3至4小時。通過離心收穫細胞。將細胞沉澱溶解離液劑在6M鹽酸胍中。澄清後，在允許含有5-組氨酸標記的蛋白質緊密結合的條件下，在鎳-NAT樹脂上通過層析從溶液中純化溶解的神經肽受體(Hochuli，E.等，層析學雜誌411177-184(1984))。將神經肽受體蛋白質(85％純度)以6M鹽酸胍(pH值5.0)從柱中洗脫下來，為了復性，調至3M鹽酸胍、100mM磷酸鹽鈉、10mM穀胱甘肽(還原型的)、2mM穀胱甘肽(氧化型的)。在這一溶液溫育12小時後，將蛋白質對10mM磷酸鈉透析。
實施例2在COS細胞中的表達重組神經肽受體神經肽受體-HA的質粒表達來源於載體pcDNA3/Amp(Invitrogen)，其包含1)SV40複製起點，2)氨苄青黴素抗性基因，3)大腸桿菌的複製起點)，4)CMV啟動子，其後為多接頭區、SV40內含子和聚腺苷酸化位點。將編碼完整的神經肽受體前體的DNA片段和在讀框中融合進3』末端的HA標記克隆到所說的載體的多接頭區，由此，重組蛋白質的表達在CMV啟動子控制之下。HA標記相應於來自流感血細胞凝集素蛋白質的表位，這一點以前已經描述過(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，細胞37767)。HA和靶細胞蛋白的融合，使帶有抗體(其識別HA表位)的重組蛋白質很容易檢測。
質粒構建策略描述如下用兩種引物經PCR構建編碼神經肽受體的DNA序列(ATCC#-----)，所說的引物是5』引物5』CCTAGGATGCCCCTCTGCTGCAGCGG 3′(SEQ ID NO9)，包含BamHI位點；3』引物5′ACAAGTCCTTGTCCTTCTGAGGGC 3′(SEQ ID NO10)包含互補於XbaI位點、翻譯終止密碼子和神經肽受體編碼序列區的最後17個核苷酸(不包括終止密碼子)的序列。由此PCR產物包含BamHI位點、編碼序列、翻譯終止密碼子和XbaI位點。用BamHI和XbaI消化PCR擴增的DNA片段和載體pcDNA3/Amp並連接。將連接混合物轉化到大腸桿菌菌株SURE(可從Stratagene克隆系統，La Jolla得到)中，將轉化的培養物接種在氨苄青黴素培養基平板上，並篩選抗性克隆。從轉化體中分離質粒DNA，並用限制分析檢測是否存在正確的片段。為了表達重組神經肽受體，通過DEAE-DEXTRAN方法用表達載體轉染COS細胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版，(1989))。通過放射標記和免疫沉澱法檢測神經肽受體HA蛋白的表達(E.Harlow，D.Lane，抗體實驗手冊，冷泉港實驗室出版，(1988))。將細胞在轉染後的兩天用15S-半胱氨酸標記8小時。然後收集培養物並用去垢劑裂解細胞(RIPA緩衝液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)(Wilson，I.等，Id.37767(1984))。用HA的特異性單克隆抗體沉澱細胞裂解物和培養物兩者。在15％SDS-PAGE凝膠上分析蛋白質沉澱。
實施例3利用杆狀病毒表達系統克隆和表達神經肽受體利用PCR寡核苷酸引物擴增編碼全長神經肽受體蛋白質的DNA序列(ATCC#-----)，所說引物相應於該基因的5』和3』序列
神經肽受體5』引物具有序列5′CGGGATCCGCCATCATGGAGCCCTCAGCCACC 3′(SEQ ID NO11)，包含BamHI限制位點(粗體)，接下來是類似真核細胞翻譯起始有效信號(Kozak，M.，J.Mol.Biol.，196947-950(1987))的6個核苷酸，其就在所述基因的頭18個核苷酸之後(翻譯起始密碼子「ATG」有下劃線)。
3』引物具有序列5′ACAAGTCCTTGTCCTTCTAGAGGGC 3』(SEQID NO12)，包含限制性內切酶XbaI的切割位點和互補於神經肽受體基因3』-非翻譯序列的5個核苷酸。用市售試劑盒(「Geneclean」BIO101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離擴增的序列。然後將所說的片段用相應的核酸內切酶BamHI和XbaI消化，並如實施例1所述純化。此片段指定為F2。
載體pA2(由pVL941載體修飾而成，見下文討論)用於表達蛋白質，這種表達使用杆狀病毒表達系統(綜述參見Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，杆狀病毒載體和昆蟲細胞培養方法手冊，德克薩斯農業的試驗站公報1555)。這種表達載體包含苜蓿銀紋夜蛾多核型多角病毒(AcMNPV)強多角體蛋白啟動子，其後面是限制性核酸內切酶BamHI和XbaI的識別位點。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點用於有效的聚腺苷酸化。為了容易地選擇重組病毒，把大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因作為多角體蛋白啟動子以同樣的方向插入，其後是多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號。多角體蛋白序列的兩側是用於細胞-介導的共轉染的野生型病毒DNA的同源重組的病毒序列。可以用很多其它的杆狀病毒載體代替A2，所說的載體如pGR1、pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒學，17031-39)。
用限制酶BamHI和XbaI消化所說的質粒，並用本領域已知的方法利用牛犢腸磷酸酶使質粒去磷酸化。然後如實施例1的描述從1％瓊脂糖凝膠分離DNA。這種載體DNA指定為V2。
用T4 DNA連接酶連接F2片段和所說的去磷酸化質粒V2。然後轉化DH5α，並利用限制酶BamHI和XbaI鑑別含有具有神經肽受體基因的所說質粒(pBac神經肽受體)的細菌。通過DNA測序確認所克隆的片段的序列。
用脂轉染法(Felgner等，美國科學院學報，847413-7417(1987))將5μg質粒pBac神經肽受體與1.0μg市售的線性杆狀病毒(「BaculoGoldTM杆狀病毒DNA」，Pharmingen，San Diego，CA.)共轉染。
將1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg質粒pBac神經肽受體在含有50微升無血清Grace’s培養基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的無菌孔中混合。在添加10微升脂轉染試劑和90微升Grace’s培養基後，混合併於室溫下培養15分鐘。然後將轉染混合物逐滴添加到Sf9昆蟲細胞(ATCC CRLl711)中，所說細胞接種在具有1ml無血清Grace’s培養基的35mm組織培養平板上。來回搖動平板以混合新添加的溶液。然後將平板在27℃下培養5小時。5小時後，從平板除去轉染溶液，添加1毫升補充有10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養基。把平板放回到溫箱，在27℃下連續培養4天。
4天後，收集上清液，用類似Summers和Smith(同上)所述的方法進行噬斑測定。一點改變是使用具有「Blue Gal」的瓊脂糖凝膠(Life Technologies公司，Gaithersburg)，其使得易於分離染藍的噬斑(「噬斑測定」的詳盡的描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)發布的昆蟲細胞培養和杆狀病毒學用戶指南9-10頁中找到)。
四天後，將系列稀釋的病毒添加到細胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染藍的噬斑。然後將包含重組病毒的瓊脂懸浮於包含200微升Grace’s培養基的Eppendcrf管中。經簡短離心除去瓊脂，將包含重組杆狀病毒的上清液用於感染接種到35毫米培養皿中的Sf9細胞。4天後，收穫這些培養皿中的上清液，於4℃貯存。
使Sf9細胞在補充有10％熱滅活FBS的Grace』培養基中生長。在感染複數(MOI)2下用重組杆狀病毒V-神經肽受體感染細胞。6小時後，除去培養基，用SF900II培養基(減甲硫氨酸和半胱氨酸)(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)替代。42小時後，添加5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。在經離心收穫之前，將細胞進一步培養16小時，標記蛋白質經SDS-PAGE和放射自顯影顯示出。
實施例4經由基因治療的表達成纖維細胞是通過皮膚活組織檢查從一個研究對象中得到的。將得到的組織放置在組織培養基上並且分割成小塊。將小組織塊放置在組織培養瓶的溼表面上，其中每瓶中放置約10塊組織。將瓶顛倒放置，蓋緊並於室溫下過夜。在室溫下放置24小時後反轉瓶，組織塊仍固定在瓶底部，加入新鮮培養基(例如含有10％FBS，青黴素和鏈黴素的Ham’s F12培養基)，然後於37℃下溫育大約1周。這時加入新鮮培養基，隨後每隔幾天更換一次培養基。再培養2周後，出現了一單層成纖維細胞。將單層細胞經胰蛋白酶消化並放入更大的瓶中。
用EcoRI和Hind III消化旁側有Moloney鼠肉瘤病毒長末端重複的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7219-25(1988))，接下來用小牛腸磷酸酶進行處理。線性載體在瓊脂糖凝膠上分級分離並使用玻璃珠加以純化。
採用分別與5』和3』末端序列對應的PCR引物擴增編碼本發明多肽的cDNA。5』引物包含一個EcoRI位點，3』引物含有一個Hind III位點。在T4 DNA連接酶存在下，將等量的Moloney鼠肉瘤病毒的線性化骨架與擴增的EcoRI和Hind III片段加在一起，在適於兩個片段連接的條件下保持所得到的混合物。將該連接混合物用於轉化細菌HB101，然後為了證實該載體具有插入正確的感興趣基因而將細菌塗布在含有卡那黴素的瓊脂平板上。
將兼嗜性(amphotropic)pA317或GP+am12包裝細胞在含有10％小牛血清(CS)、青黴素和鏈黴素的Dulbecco’s改良Eagles培養基(DMEM)的組織培養板上進行培養，直至達到鋪滿密度。然後將含有所述基因的載體加入培養基中並用該載體轉導包裝細胞。包裝細胞隨即生產含有該基因的具有感染性的病毒顆粒(現在包裝細胞被稱作生產細胞)。
向轉導的生產細胞中加入新鮮的培養基，接下來從一個鋪滿生產細胞的10cm平板中收集培養基。含有感染性病毒顆粒的培養基經微孔過濾器過濾以除去脫附(detached)的生產細胞，然後利用該培養基去感染成纖維細胞。從成纖維細胞的亞鋪滿平板中除去培養基並迅速地代之以來自於生產細胞的培養基。除去該培養基並代之以新鮮的培養基。如果病毒的滴度很高，那麼實質上所有的成纖維細胞均被感染並且無需選擇。如果滴度非常低，那麼就需要採用具有如neo或his這樣的可選擇性標記的逆轉錄病毒。
然後將工程化的成纖維細胞注射入宿主，它或單獨注射或在一個cytodex 3微載體珠上已生長至鋪滿之後再注射。此時成纖維細胞產生蛋白質產物。
根據以上的教導，本發明的許多改進和變化都是可能的，因此在附加的權利要求的範圍內可以另外的方式實施本發明。
序列表(1)一般信息(i)申請人LI等(ii)發明名稱人神經肽受體(iii)序列數12(iv)通訊地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART和OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新澤西州(E)國家美國(F)郵碼07068(v)計算機可讀形式(A)介質類型3.5英寸磁碟(B)計算機IBM PS/2(c)作業系統MS-DOS(D)軟體WORD PERFECT 5.1(vi)當前申請數據(A)申請號(B)申請日(C)分類號(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)登記號36,134(c)案號/文檔號325800-268(ix)電信信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度1209個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGAGCCCT CAGCCACCCC AGGGGCCCAG ATGGGGGTCC CCCCTGGCAG CAGACAGCCG 60TCCCCTGTGC CTCCAGACTA TGAAGATGAG TTTCTCCGCT ATCTGTGGCG TGATTATCTG120TACCCAAAAC AGTATGAGTG GGTCCTCATC CCAGCCTATG TGGCTGTGTT CGTCGTGGCC180CTGGTGGGCA ACACGCTGGT CTGCCTGGCC GTGTGGCGGA ACCACCACAT GAGGACAGTC240ACCAACTACT TCATTGTCAA CCTGTCCCTG GCTGACGTTC TGGTGACTGC TATCTGCCTG300CCGGCCAGCC TGCTGGTGGA CATCACTGAG TCCTGGCTGT TCGGCCATGC CCTCTGCAAG360GTCATCCCCT ATCTACAGGC TGTGTCCGTG TCAGTGGCAG TGCTAACTCT CAGCTTCATC420GCCCTGGACC GCTGGTATGC CATCTGCCAC CGACTATTGT TCAAGAGCAC AGCCCGGCGG480GCCCGTGGCT CCATCCTGGG CATCTGGGCT GTGTCGCTGG CCATCATGGT GCCCCAGGCT540GCAGTCATGG AATGCAGCAG TGTGCTGCCT GAGCTAGCCA ACCGCACACG GCTCTTCTCA600GTCTGTCATG AACGCTGGGC AGATGACCTC TATCCCAAGA TCTACCACAG TTGCTTCTTT660ATTGTCACCT ACCTGGCCCC ACTGGGCCTC ATGGCCATGG CCTATTTCCA GATATTCCGC720AACCTCTGGG GCCGCCAGAT CCCCGGCACC ACCTCAGCAC TGGTGCGGAA CTGGAAGCGC760CCCTCAGACC AGCTGGGGGA CCTGGAGCAG GGCCTGAGTG GAGAGCCCCA GCCCCGGGGC840CGCGCCTTCC TGGCTGAAGT GAAGCAGATG CGTGCACGGA GGAAGACAGC CAAGATGCTG900ATGGTGGTGC TGCTGGTCTT CGCCCTCTGC TACCTGCCCA TCAGCGTCCT CAATGTCCTT960AAGAGGGTGT TCGGGATGTT CCGCCAAGCC AGTGACCGCG AAGCTGTCTA CGCCTGCTTC 1020ACCTTCTCCC ACTGGCTGGT GTACGCCAAC AGCGCTGCCA ACCCCATCAT CTACAACTTC 1080CTCAGTGGCA AATTCCGGGA GCAGTTTAAG GCTGCCTTCT CCTGCTGCCT GCCTGGCCTG 1140GGTCCCTGCG GCTCTCTGAA GGCCCCTAGT CCCCGCTCCT CTGCCAGCCA CAAGTCCTTG 1200TCCTTGTAG 1209(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度402個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Glu Pro Ser Ala Thr Pro Gly Ala Gln Met Gly Val Pro Pro5 10 15Gly Sar Arg Glu Pro Ser Pro Val Pro Pro Asp Tyr Glu Asp Glu20 25 30Phe Leu Arg Tyr Leu Trp Arg Asp Tyr Leu Tyr Pro Lys Gln Tyr35 40 45Glu Trp Val Leu Ile Ala Ala Tyr Val Ala Val Phe Val Val Ala50 55 60Leu Val Gly Asn Thr Leu Val Cys Leu Ala Val Trp Arg Asn His65 70 75His Met Arg Thr Val Thr Asn Tyr Phe Ile Val Asn Leu Ser Leu80 85 90Ala Asp Val Leu Val Thr Ala Ile Cys Leu Pro Ala Ser Leu Leu95 100 105Val Asp Ile Thr Glu Ser Trp Leu Phe Gly His Ala Leu Cys Lys110 115 120Val Ile Pro Tyr Leu Gln Ala Val Ser Val Ser Val Ala Val Leu125 130 135Thr Leu Ser Phe Ile Ala Leu Asp Arg Trp Tyr Ala Ile Cys His140 145 150Pro Leu Leu Phe Lys Ser Thr Ala Arg Arg Ala Arg Gly Ser Ile155 160 165Leu Gly Ile Trp Ala Val Ser Leu Ala Ile Met Val Pro Gln Ala170 175 180Ala Val Met Glu Cys Ser Ser Val Leu Pro Glu Leu Ala Asn Arg185 190 195Thr Arg Leu Phe Ser Val Cys Asp Glu Arg Trp Ala Asp Asp Leu200 205 210Tyr Pro Lys Ile Tyr His Ser Cys Phe Phe Ile Val Thr Tyr Leu215 220 225Ala Pro Leu Gly Leu Met Ala Met Ala Tyr Phe Gln Ile Phe Arg230 235 240Lys Leu Trp Gly Arg Gln Ile Pro Gly Thr Thr Ser Ala Leu Val245 250 255Arg Asn Trp Lys Arg Pro Ser Asp Gln Leu Gly Asp Leu Glu Gln260 265 270Gly Leu Ser Gly Glu Pro Gln Pro Arg Gly Arg Ala Phe Leu Ala275 280 285Glu Val Lys Gln Met Arg Ala Arg Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu290 295 300Met Val Val Leu Leu Val Phe Ala Leu Cys Tyr Leu Pro Ile Ser305 310 315Val Leu Asn Val Leu Lys Arg Val Phe Gly Met Phe Arg Gln Ala320 325 330Ser Asp Arg Glu Ala Val Tyr Ala Cys Phe Thr Phe Ser His Trp335 340 345Leu Val Tyr Ala Asn Ser Ala Ala Asn Pro Ile Ile Tyr Asn Phe350 355 360Leu Ser Gly Lys Phe Arg Glu Gln Phe Lys Ala Ala Phe Ser Cys365 370 375Cys Leu Pro Gly Leu Gly Pro Cys Gly Ser Leu Lys Ala Pro Ser380 385 390Pro Arg Ser Ser Ala Ser His Lys Ser Leu Ser Leu395 400(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度1110個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3ATGGAGCCCT CAGCCACCCC AGGGGCCCAG ATGGGGGTCC CCCGTGGCAG CAGAGAGCCG60TCCCCTGTGC CTCCAGACTA TGAAGATGAG TTTCTCCGCT ATCTGTGGCG TGATTATCTG 120TACCCAAAAC AGTATGAGTG GGTCCTCATC GCAGCCTATG TGGCTGTGTT CGTCGTGGCC 180CTGGTGGGCA ACACGCTGGT CTGCCTGGCC GTGTGGCGGA ACCACCACAT GAGGACAGTC 240ACCAACTACT TCATTGTCAA CCTGTCCCTG GCTGACGTTC TGGTGACTGC TATCTGCCTG 300CCGGCCAGCC TGCTGGTGGA CATCACTGAG TCCTGGCTGT TCGGCCATGC CCTCTGCAAG 360GTCATCCCCT ATCTACAGGC TGTGTCCGTG TCAGTGGCAG TGCTAACTCT CAGCTTCATC 420CCCCTGGACC GCTGGTATGC CATCTGCCAC CCACTATTGT TCAAGAGCAC AGCCCGGCGG 480GCCCGTGGCT CCATCCTGGG CATCTGGGCT GTGTCGCTGG CCATCATGGT GCCCCAGGCT 540GCAGTCATGC AATCCAGCAG TGTGCTGCCT GAGCTAGCCA ACCGCACACG GCTCTTCTCA 600CTCTGTCATG AACGCTGGGC AGATGACCTC TATCCCAAGA TCTACCACAG TTGCTTCTTT 660ATTGTCACCT ACCTGGCCCC ACTGGGCCTC ATGGCCATGG CCTATTTCCA GATATTCCGC 720AAGCTCTGGG GCCGCCAGAT CCCCGGCACC ACCTCAGCAC TGGTGCGGAA CTGGAAGCGC 780CCCTCAGACC AGCTGGGGGA CCTGGAGCAG GGCCTGAGTG GAGAGCCCCA GCCCCGGGGC 840CGCGCCTTCC TGGCTGAAGT GAAGCAGATG CGTGCACGGA GGAAGACAGC CAAGATGCTG 900ATGGTGGTGC TGCTGGTCTT CGCCCTCTGC TACCTCCCCA TCAGCGTCCT CAATGTCCTT 960AAGAGGGTGT TCGGGATGTT CCGCCAAGCC AGTGACCGCG AAGCTGTCTA CGCCTGCTTC 1020ACCTTCTCCC ACTGGCTGGT GTACGCCAAC AGCGCTGCCA ACCCCATCAT CTACAACTTC 1080CTCAGTGGCC TTCCCTGGAG TCTGCTCTAA 1110(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度369個鹼基對(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Glu Pro Ser Ala Thr Pro Gly Ala Gln Met Gly Val Pro Pro5 10 15Gly Ser Arg Glu Pro Ser Pro Val Pro Pro Asp Tyr Glu Asp Glu20 25 30Phe Leu Arg Tyr Leu Trp Arg Asp Tyr Leu Tyr Pro Lys Gln Tyr35 40 45Glu Trp Val Leu Ile Ala Ala Tyr Val Ala Val Phe Val Val Ala50 55 60Leu Val Gly Asn Thr Leu Val Cys Leu Ala Val Trp Arg Asn His65 70 75His Met Arg Thr Val Thr Asn Tyr Phe Ile Val Asn Leu Ser Leu80 85 90Ala Asp Val Leu Val Thr Ala Ile Cys Leu Pro Ala Ser Leu Leu95 100 105Val Asp Ile Thr Glu Ser Trp Leu Phe Gly His Ala Leu Cys Lys110 115 120Val Ile Pro Tyr Leu Gln Ala Val Ser Val Ser Val Ala Val Leu125 130 135Thr Leu Ser Phe Ile Ala Leu Asp Arg Trp Tyr Ala Ile Cys His140 145 150Pro Leu Leu Phe Lys Ser Thr Ala Arg Arg Ala Arg Gly Ser Ile155 160 165Leu Gly Ile Trp Ala Val Ser Leu Ala Ile Met Val Pro Gln Ala170 175 180Ala Val Met Glu Cys Ser Ser Val Leu Pro Glu Leu Ala Asn Arg185 190 195Thr Arg Leu Phe Ser Val Cys Asp Glu Arg Trp Ala Asp Asp Leu200 205 210Tyr Pro Lys Ile Tyr His Ser Cys Phe Phe Ile Val Thr Tyr Leu215 220 225Ala Pro Leu Gly Leu Met Ala Mat Ala Tyr Phe Gln Ile Phe Arg230 235 240Lys Leu Trp Gly Arg Gln Ile Pro Gly Thr Thr Ser Ala Leu Val245 250 255Arg Asn Trp Lys Arg Pro Ser Asp Gln Leu Gly Asp Leu Glu Gln260 265 270Gly Leu Ser Gly Glu Pro Gln Pro Arg Gly Arg Ala Phe Leu Ala275 280 285Glu Val Lys Gln Met Arg Ala Arg Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu290 295 300Met Val Val Leu Leu Val Phe Ala Leu Cys Tyr Leu Pro Ile Ser305 310 315Val Leu Asn Val Leu Lys Arg Val Phe Gly Met Phe Arg Gln Ala320 325 330Ser Asp Arg Glu Ala Val Tyr Ala Cys Phe Thr Phe Ser His Trp335 340 345Leu Val Tyr Ala Asn Ser Ala Ala Asn Pro Ila Ile Tyr Asn Phe350 355 360Leu Ser Gly Leu Pro Trp Ser Leu Leu365(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度1133個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5ATGGAGCCCT CAGCCACCCC AGGGGCCCAG ATGGGGGTCC CCCCTGGCAG CAGAGACCCC 60TCCCCTGTGC CTCCAGACTA TGAAGATGAG TTTCTCCGCT ATCTGTGGCG TGATTATCTG120TACCCAAAAC AGTATGAGTG GGTCCTCATC GCAGCCTATG TGGCTGTGTT CGTCGTGGCC180CTGGTGGGCA ACACGCTGGT CTGCCTGGCC GTGTGGCGGA ACCACCACAT GAGGACAGTC240ACCAACTACT TCATTGTCAA CCTGTCCCTG GCTGACGTTC TGGTGACTGC TATCTGCCTG300CCGGCCAGCC TGCTGGTGGA CATCACTGAG TCCTGGCTGT TCGGCCATGC CCTCTGCAAG360GTCATCCCCT ATCTACAGGC TGTGTCCGTG TCAGTGGCAG TGCTAACTCT CAGCTTCATC420GCCCTGGACC GCTGGTATGC CATCTGCCAC CCACTATTGT TCAAGAGCAC AGCCCGGCGG480GCCCGTGGCT CCATCCTGGG CATCTGGGCT GTGTCGCTGG CCATCATGGT GCCCCAGGCT540GCAGTCATGG AATGCAGCAG TGTGCTGCCT GAGCTAGCCA ACCGCACACG GCTCTTCTCA600GTCTGTGATG AACGCTGGGC AGATGACCTC TATCCCAAGA TCTACCACAG TTGCTTCTTT660ATTGTCACCT ACCTGGCCCC ACTGGGCCTC ATGGCCATGG CCTATTTCCA GATATTCCGC720AAGCTCTGGG GCCGCCAGAT CCCCGGCACC ACCTCAGCAC TGGTGCGGAA CTGGAAGCGC780CCCTCAGACC AGCTGGGGGA CCTGGAGCAG GGCCTGAGTG GAGAGCCCCA GCCCCGGGGC840CGCGCCTTCC TGGCTGAAGT GAAGCAGATG CGTGCACGGA GGAAGACAGC CAAGATGCTG900ATGGTGGTGC TGCTGGTCTT CGCCCTCTGC TACCTGCCCA TCAGCGTCCT CAATGTCCTT960AAGAGGGTGT TCGGGATGTT CCGCCAAGCC AGTGACCGCG AAGCTGTCTA CGCCTGCTTC 1020ACCTTCTCCC ACTGGCTGGT GTACGCCAAC AGCGCTGCCA ACCCCATCAT CTACAACTTC 1080CTCAGTGGAT GTAAAGAGAA GAGTCTAGTT CTGTCCTGAC CATCGTGCCC CGG 1133(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特徵(A)長度377個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Glu Pro Ser Ala Thr Pro Gly Ala Gln Met Gly Val Pro Pro5 10 15Gly Sar Arg Glu Pro Ser Pro Val Pro Pro Asp Tyr Glu Asp Glu20 25 30Phe Leu Arg Tyr Leu Trp Arg Asp Tyr Leu Tyr Pro Lys Gln Tyr35 40 45Glu Trp Val Leu Ile Ala Ala Tyr Val Ala Val Phe Val Val Ala50 55 60Leu Val Gly Asn Thr Leu Val Cys Leu Ala Val Trp Arg Asn His65 70 75His Met Arg Thr Val Thr Asn Tyr Pha Ile Val Asn Leu Ser Leu80 85 90Ala Asp Val Leu Val Thr Ala Ile Cys Leu Pro Ala Ser Leu Leu95 l00 105Val Asp Ile Thr Glu Ser Trp Leu Phe Gly His Ala Leu Cys Lys110 115 120Val Ile Pro Tyr Leu Gln Ala Val Ser Val Ser Val Ala Val Leu125 130 135Thr Leu Ser Phe Ile Ala Leu Asp Arg Trp Tyr Ala Ila Cys His140 145 150Pro Leu Leu Phe Lys Ser Thr Ala Arg Arg Ala Arg Gly Ser Ile155 160 165Leu Gly Ile Trp Ala Val Sar Leu Ala Ile Met Val Pro Gln Ala170 175 180Ala Val Met Glu Cys Ser Ser Val Leu Pro Glu Leu Ala Asn Arg185 190 195Thr Arg Leu Phe Ser Val Cys Asp Glu Arg Trp Ala Asp Asp Leu200 205 210Tyr Pro Lys Ile Tyr His Ser Cys Phe Phe Ile Val Thr TyT Leu215 220 225Ala Pro Leu Gly Leu Met Ala Met Ala Tyr Phe Gln Ile Phe Arg230 235 240Lys Leu Trp Gly Arg Gln Ile Pro Gly Thr Thr Ser Ala Leu Val245 250 255Arg Asn Trp Lys Arg Pro Ser Asp Gln Leu Gly Asp Leu Glu Gln260 265 270Gly Leu Ser Gly Glu Pro Gln Pro Arg Gly Arg Ala Phe Leu Ala275 280 285Glu Val Lys Gln Met Arg Ala Arg Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu290 295 300Met Val Val Leu Leu Val Phe Ala Leu Cys Tyr Leu Pro Ile Ser305 310 315Val Leu Asn Val Leu Lys Arg Val Phe Gly Met Phe Arg Gln Ala320 325 330Ser Asp Arg Glu Ala Val Tyr Ala Cys Phe Thr Phe Ser His Trp335 340 345Leu Val Tyr Ala Asn Ser Ala Ala Asn Pro Ile Ile Tyr Asn Phe350 355 360Leu Ser Gly Cys Lys Glu Lys Ser Leu Val Leu Ser Pro Ser Cys365 370 375Pro Gly(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7CACTAAAGCT TAATGGAGCC CTCAGCCACC 30(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特徵(A)長度26個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8ACAAGTCCTT GTCCTTCTAG AGGGC 26(2)SEQ ID NO9的信息、(i)序列特徵(A)長度26個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO9CCTAGGATGC CCCTCTGCTG CAGCGG 26(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特徵
(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO10ACAAGTCCTT GTCCTTCTAG AGGGC 25(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO11CGGGATCCGC CATCATGGAG CCCTCAGCCA CC 32(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO12ACAAGTCCTT GTCCTTCTAG AGGGC 2權利要求
1.一種分離的多核苷酸，這種多核苷酸包括選自如下一組的成員(a)一種多核苷酸，這種多核苷酸編碼SEQ ID NO2所示的多肽；(b)一種多核苷酸，這種多核苷酸能夠和(a)的多核苷酸雜交，並且和它們具有至少70％的相同性；(c)一種(a)或(b)的多核苷酸的多核苷酸片段。
2.權利要求1的多核苷酸，這種多核苷酸編碼SEQ ID NO2所示的多肽。
3.權利要求1的多核苷酸，其中所說的多核苷酸是DNA。
4.權利要求1的多核苷酸，其中所說的多核苷酸是RNA。
5.權利要求1的多核苷酸，其中所說的多核苷酸是基因組DNA。
6.權利要求1的多核苷酸，該多核苷酸包含SEQ ID NO1所示的1至1209位核苷酸。
7.權利要求1的多核苷酸，其編碼SEQ ID NO2所示的多肽的可溶形式。
8.一種分離的多核苷酸，這種多核苷酸包括選自如下一組的成員(a)一種多核苷酸，這種多核苷酸編碼一種由包含在ATCC-----號保藏物中的DNA編碼的成熟多肽；(b)一種多核苷酸，這種多核苷酸編碼由包含在ATCC-----號保藏物中的DNA表達的多肽；(c)一種多核苷酸，這種多核苷酸能夠和(a)或(b)的多核苷酸雜交，並且和它們具有至少70％的相同性；(d)一種(a)、(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。
9.權利要求8的多核苷酸，其中所說的多核苷酸編碼由包含在ATCC-----號保藏物中的DNA表達的多肽。
10.權利要求8的多核苷酸，其中所說的多核苷酸編碼由包含在ATCC-----號保藏物中的DNA表達的多肽。
11.一種載體，這種載體包含權利要求2的DNA。
12.一種用權利要求11的載體轉化或轉染過的宿主細胞。
13.一種生產多肽的方法，這種方法包括從權利要求12的宿主細胞表達由所說的DNA編碼的多肽。
14.一種生產能夠表達多肽之細胞的方法，這種方法包括用權利要求11的載體轉化或轉染所述細胞。
15.一種受體多肽，這種多肽選自如下一組(a)一種多肽，這種多肽具有SEQ ID NO2的推導的胺基酸序列和其片段、類似物及衍生物；和(b)一種由ATCC-----號保藏物的cDNA編碼的多肽和其片段、類似物及衍生物。
16.權利要求15的多肽，其中所說的多肽具有SEQ ID NO2的推導的胺基酸序列。
17.一種權利要求15的多肽的抗體。
18.一種激活權利要求15的多肽的化合物。
19.一種抑制權利要求15的多肽的激活的化合物。
20.一種治療需要激活神經肽受體之患者的方法，這種方法包括對患者施用治療有效量的權利要求18的化合物。
21.一種治療需要抑制神經肽受體之患者的方法，這種方法包括對患者施用治療有效量的權利要求19的化合物。
22.權利要求20的方法，其中所說的化合物是一種多肽，並且治療有效量的所說化合物是通過對患者提供編碼所說激動劑的DNA並在體內表達所說的激動劑來施用的。
23.權利要求21的方法，其中所說的化合物是一種多肽，並且治療有效量的所說化合物是通過對患者提供編碼所說拮抗劑的DNA並在體內表達所說的拮抗劑來施用的。
24.一種鑑別結合併激活權利要求15的受體多肽之化合物的方法，該方法包括提供在其表面表達所述受體多肽的重組宿主細胞，所述受體與能夠提供應答一種化合物與所說受體多肽的結合的可檢測信號的第二組分相關聯；在足以允許化合物與所說受體多肽結合的條件下使多種化合物與所說宿主細胞接觸；和通過檢測由所說第二組分產生的信號鑑別能夠與受體結合的那些化合物。
25.由權利要求24的方法鑑別的激動劑化合物。
26.一種鑑別結合權利要求15的多肽並抑制其激活的化合物的方法，該方法包括提供在其表面表達所述受體多肽的重組宿主細胞，所述受體與能夠提供應答一種化合物與所說受體多肽的結合的可檢測信號的第二組分相關聯；在足以允許結合所說受體多肽的條件下，使已知結合受體多肽的分析上可檢測的配體和多種化合物與所說宿主細胞接觸；和通過檢測由配體與多肽相互作用產生的信號是否存在，確定所述配體是否結合到所述多肽上。
27.由權利要求26的方法鑑別的拮抗劑化合物。
28.一種測定未知能否結合到權利要求15的多肽上的配體是否可以連接到所述多肽上的方法，該方法包括在允許結合的條件下，使一種在其表面表達所述多肽的重組宿主細胞與一種待鑑別的配體接觸，並檢測任何結合配體的受體的存在。
29.權利要求28的方法，其中在與待鑑別的配體接觸之前，從所說的細胞分離受體多肽或包含該受體的膜組分。
30.一種篩選化合物以鑑別結合權利要求15的受體多肽的那些化合物的方法，該方法包括在允許結合到受體上的條件下，使一種在其表面表達所述多肽的重組宿主細胞與許多候選化合物和已知結合所述受體的分析上可檢測的配體接觸；和鑑別能夠增強或抑制所述配體結合到所述受體上的那些候選化合物。
31.一種由權利要求30的方法鑑別的拮抗劑或激動劑化合物。
32.一種診斷與權利要求15的多肽表達不足相關的疾病或者疾病易感性的方法，這種方法包括測定在編碼所說多肽的核酸序列中的突變。
33.權利要求15的多肽，其中所說的多肽是多肽的可溶性片段，並且能夠結合受體的配體。
34.一種診斷方法，該方法包括分析來源於宿主的樣品中權利要求33的多肽的存在。
全文摘要
本文公開了人類神經肽受體多肽和編碼這些多肽的DNA(RNA)以及通過重組技術產生這些多肽的方法。本文也公開了利用這些多肽鑑別它們的拮抗劑和激動劑的方法,以及分別將這些激動劑和拮抗劑治療性地用於治療與所述神經肽受體多肽表達不足和過量表達相關之疾病的方法。本文還公開了用於檢測所述神經肽受體核酸序列中的突變和該受體的可溶形式之改變的水平的診斷方法。
文檔編號C12N15/12GK1182432SQ9519784
公開日1998年5月20日 申請日期1995年5月5日 優先權日1995年5月5日
發明者丹尼爾·R·索佩特, 李毅, 克雷格·A·羅森 申請人:人體基因組科學有限公司