巰基化單鏈dna在聚合酶鏈式反應中的應用的製作方法

2023-07-10 05:38:46

巰基化單鏈dna在聚合酶鏈式反應中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了巰基化單鏈DNA在增強聚合酶鏈式反應特異性擴增中的應用，即：利用巰基化單鏈DNA增強聚合酶鏈式反應特異性擴增的方法：將適量巰基化單鏈DNA加入PCR反應體系中進行PCR擴增；所述適量指在20μL反應體系中巰基化單鏈DNA的終濃度不小於15μM。所述巰基化單鏈DNA，滿足以下條件：（1）為一段與靶序列不互補、非同源的任意序列；（2）Tm值≥37.7℃；（3）至少一端含巰烷基基團SH-C6H12-。本發明具有優化擴增的效果顯著、製備簡便、適用性廣、成本低、易操作等優點；對基因的檢測與克隆、遺傳分析、醫學診斷、基因晶片等領域有著巨大的潛在應用價值。
【專利說明】巰基化單鏈DNA在聚合酶鏈式反應中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及巰基化單鏈DNA在增強聚合酶鏈式反應特異性擴增中的應用，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]聚合酶鏈式反應(PloymeraseChainReaction, PCR),又稱體外酶促基因擴增，是一種在體外模擬自然DNA複製的核酸擴增技術，機制非常複雜，在耐熱DNA聚合酶的作用及特異性引物的引導下，在短時間內可以將目的基因擴增至百萬倍。該技術由K.Mullis於1983~1984年發明，在核酸序列分析中得到廣泛應用。經過30年的發展，PCR反應已經發展成一項成熟技術，常規實驗中失誤率較小，然而在實際應用時總會出現一定程度的幹擾副反應，如鹼基錯配、引物間形成二聚體等引起的擴增等。這些副反應輕則引起非特異性擴增，導致擴增效率不高，重則可能造成擴增失敗。
[0003]PCR反應組分和程序的優化是提高PCR擴增特異性的重要途徑。多年以來，眾多研究人員對PCR反應組分的優化做了大量工作，如向反應體系中加入DMS0、甘油、甜菜鹼、納米金屬等可以在一定程度上改善非特異性擴增問題。但在實際應用中，有些效果並不是很理想，比如過多的納米金屬等會抑制聚合酶的活性，造成擴增效率降低。
[0004]經過對現有專利與文獻的檢索，發現中國專利申請CN101983241A中提到以下內容:將修飾(包括巰基修飾 、羥基修飾)的至少部分互補的寡核苷酸與靶核酸的鏈雜交，可用於靶核酸的PCR擴增，由於已證實的在羥基核鹼基或巰基核鹼基與靶核酸的核鹼基之間可以發生更穩定的氫鍵結合，因此可達到增強修飾序列與靶序列結合效率的目的。在該專利申請提到的該項應用中，其所述的「修飾的至少部分互補的寡核苷酸」實際上用作PCR反應中的引物，對引物進行羥基或巰基或其他基團修飾的目的是增加引物與靶序列的結合效率，並不具備增強PCR特異性的功能。

【發明內容】

[0005]針對上述現有技術，本發明提供了一種可有效增強核酸聚合酶鏈式反應特異性擴增的方法，該方法是通過向反應體系中加入巰基化單鏈DNA實現的，其優化擴增的效果顯著，製備簡便，適用性廣，成本低，易操作。
[0006]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0007]巰基化單鏈DNA在聚合酶鏈式反應中的應用:本發明的 申請人:通過實驗研究證明，向PCR反應體系中添加巰基化寡核苷酸，即巰基化單鏈DNA，可實現對PCR體系的優化:將適量巰基化單鏈DNA加入PCR反應體系中進行PCR擴增，對擴增後的產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，並與未添加巰基化單鏈DNA的PCR反應體系的擴增產物進行對比，結果發現，未添加巰基化單鏈DNA的PCR反應體系的擴增產物中，出現了非常嚴重的非特異性擴增，而添加巰基化單鏈DNA的PCR反應體系的擴增產物中，非特異性擴增完全消失，特異性得到明顯改善。[0008]所述巰基化單鏈DNA，是指5』或3』端的核苷酸用巰烷基(SH-C6H12-)修飾的寡核苷酸，該寡核苷酸的Tm值需> 37.7V (Tm值使用生物學軟體01igo7.4計算)。
[0009]所述巰基化單鏈DNA，其鹼基的序列無特定要求，是一段與靶序列不互補的隨機序列，在PCR反應中不做為引物，也不產生PCR產物鏈。
[0010]進一步地，所述巰基化單鏈DNA，滿足以下條件:(1)為一段與靶序列不互補(非同源)的任意序列；(2) Tm值≥37.7 0C ；(3)至少一端含巰烷基基團(SH-C6H12-X
[0011 ] 所述巰基化單鏈DNA，可由生物公司依據引物合成方法合成並進行巰基修飾，為常規方法。
[0012]所述聚合酶鏈式反應，是指分子生物學中常用PCR擴增，包括常規PCR、複雜模板PCR 等。
[0013]所述PCR體系參見各商業ExTaq聚合酶說明書。
[0014]一種利用巰基化單鏈DNA增強聚合酶鏈式反應特異性擴增的方法，如下:將適量巰基化單鏈DNA加入PCR反應體系中進行PCR擴增；所述適量指在20 μ L反應體系中巰基化單鏈DNA的終濃度不小於15 μ M0
[0015]比如，常用PCR擴增程序按照現有技術設定如下:95°C預熱5min ;95°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，35個循環；其中循環數、退火溫度、退火時間、延伸時間可根據不同PCR儀器和不同引物需要而做適當改變，最後72°C延伸7min。
[0016]所述瓊脂糖凝膠電泳參照現有技術，一般包含以下步驟:
[0017](I)製備2%的瓊脂糖凝膠(含染色劑溴乙錠)；
[0018](2) PCR產物點樣，同時點分子量標記作為對照；
[0019](3)加以4~5V/cm的電壓，電泳，30min ；
[0020](4)凝膠成像觀察並分析結果。
[0021]本發明利用巰基化單鏈DNA增強聚合酶鏈式反應特異性擴增的方法，與現有方法相比，具有優化效果顯著、製備簡便、適用性廣、成本低、易操作等優點。巰基化單鏈DNA穩定性好，可在4°C長期保存不會降解或失活，使用極為方便，只需適量加入到PCR體系中即可。本發明中使用的巰基化單鏈DNA不依賴鹼基序列，因此適用廣泛，可直接用於各種基因的PCR擴增而不需要針對性設計。本發明發展的PCR擴增方法對多種PCR體系均具有優化作用，適用於各種PCR擴增，對基因的檢測與克隆、遺傳分析、醫學診斷、基因晶片等領域有著巨大的潛在應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1:實施例1中巰基化單鏈DNA對CaMV35S基因片段PCR擴增反應優化擴增效果圖。
[0023]圖2:實施例2中巰基化單鏈DNA對複雜植物基因組轉基因玉米M0N810PCR擴增反應優化擴增效果圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0025]實施例1巰基化單鏈DNA優化擴增CaMV35S基因片段[0026](I)PCR反應體系的配置:
[0027]反應體系含2XPremixExTaqlOy L，上、下遊引物(l0.moir1)各IyL (序列為:F1:GCTCCTACAAATGCCATCATTGC, Rl:GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC,如 SEQIDN0.1、2 所示)，含CaMV35S基因的DNA (為來源於轉CaMV35S基因玉米的基因組總DNA) 2 μ L，其中，PremixExTaq購自大連TaKaRa公司。
[0028]各樣品的配置如下:
[0029]常規PCR體系配置2管，編號為1、2，用雙蒸水補足至總體積20 μ L ;
[0030]添加未巰基化單鏈DNA的體系配置2管，編號為5、6，每管分別添加未巰基化單鏈DNA至終濃度20 μ Μ,再用雙蒸水補足至總體積20 μ L ;所述未巰基化單鏈DNA的序列為GTATGTGCCCATGTG,如 SEQIDN0.3 所示；
[0031]添加巰基化單鏈DNA的體系配置7管，編號為3、4、7、8、9、10、11，每管分別添加不同序列的巰基化單鏈DNA至終濃度20 μ Μ，再用雙蒸水補足至總體積20 μ L ;每管所添加的巰基化單鏈DNA的序列如下:
[0032]編號3:HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG,核苷酸序列如 SEQIDN0.3 所示；
[0033]編號4:HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG,同上；
[0034]編號7:HS-ssDNAl: HS-C6H12_CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.4 所示；
[0035]編號8:HS-ssDNA2:HS-C6H12_GCCCTCTACTCCACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.5 所示；
[0036]編號9:HS-ssDNA3:HS-C6H12_ACAGCCTCACTGGAA，核苷酸序列如 SEQIDN0.6 所示；
[0037]編號10:HS-ssDNA4:HS-C6H12-TGACTCCATCATCTGTT,核苷酸序列如 SEQIDN0.7 所示；
[0038]編號11:HS-ssDNA5:HS-C6H12_TAGGACAATCCGTATCT，核苷酸序列如 SEQIDN0.8 所示；
[0039]添加巰基化單鏈DNA的優化體系配置6管，編號12、13、14、15、16、17，Tm值分別為12.90C，30.30C，37.7V，47.4°C，53°C，59.1°C ;具體Tm值及所添加的巰基化單鏈DNA序列如下:
[0040]編號12:12.90C ；HS-C6H12-GTATGTGC,核苷酸序列如 SEQIDN0.9 所示；
[0041]編號13:30.30C ;HS-C6H12-GTATGTGCCC，核苷酸序列如 SEQIDN0.10 所示；
[0042]編號14:37.70C ;HS-C6H12_GTATGTGCCCAT，核苷酸序列如 SEQIDN0.11 所示；
[0043]編號15:47.40C ;HS-C6H12_GTATGTGCCCATGTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.3 所示；
[0044]編號16:53°C ;HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.12 所示；
[0045]編號17:59.10C ；HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTGCG,核苷酸序列如 SEQIDN0.13 所 /Jn ο
[0046](2)利用PCR技術對模板分子進行擴增，擴增程序為:95°C 5min ；95 °C 30s，58°C 30s, 72°C 30s，35 個循環；72°C 7min。
[0047](3)對擴增後的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測:
[0048]擴增結果如圖1所示，其中，各泳道所對應的樣品如下:
[0049]M:分子量標記(北京天根公司MarkerI,自下至上分別為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp)；
[0050]1-2:常規 PCR 體系；[0051 ] 3-4:添加巰基化單鏈DNA的優化改進體系；
[0052]5-6:添加未巰基化單鏈DNA的對照體系；
[0053]7-11:分別添加 HS-ssDNA1、HS-ssDNA2、HS-ssDNA3、HS-ssDNA4、HS-ssDNA5 的巰基化單鏈DNA優化改進體系；
[0054]12-17:分別添加巰基化單鏈 DNATm 值為 12.9°C,30.3°C, 37.7°C,47.4°C，53°C，59.1°C的優化改進體系。
[0055]該擴增的目的基因片段為195bp，由圖1可見，在常規PCR中出現了嚴重的非特異性擴增，表現為2條非特異性條帶(大小約為450bp和550bp，泳道1_2)，加入Tm≥37.7V的隨機巰基化單鏈DNA的PCR體系非特異性擴增完全消失(泳道3-4，7-11，14-17)，而加入未巰基化單鏈DNA和Tm 值< 37.7 V的巰基化單鏈DNA的對照體系非特異性擴增依然存在(泳道 5-6，12-13)。
[0056]實施例2巰基化單鏈DNA優化擴增複雜植物基因組轉基因玉米M0N810
[0057](I) PCR反應體系的配置:
[0058]反應體系含2 XPrem ixExTaqlO μ L，上、下遊引物(10 μ molL-1)各 I μ L (Fl:CAAGTGTGCCCACCACAGC, Rl:GCAAGCAAATTCGGAAATGAA，如 SEQIDN0.14、15 所示)，轉基因玉米M0N810基因組DNA2 μ L，其中，PremixExTaq購自大連TaKaRa公司。
[0059]各樣品的配置如下:
[0060]常規PCR體系配置3管，編號為1、2、3，用雙蒸水補足至總體積20μ L ;
[0061]添加巰基化單鏈DNA的體系配置3管，編號為4、5、6，每管分別添加序列不同的巰基化單鏈DNA至終濃度為20 μ Μ，再用雙蒸水補足至總體積20 μ L ;所述巰基化單鏈DNA的序列如下:
[0062]編號4:HS-ssDNAl: HS-C6H12_CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.4 所示；
[0063]編號5:HS-ssDNA2:HS-C6H12_GCCCTCTACTCCACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.5 所示；
[0064]編號6:HS-ssDNA3:HS-C6H12_ACAGCCTCACTGGAA，核苷酸序列如 SEQIDN0.6 所示；
[0065]添加未巰基化單鏈DNA的體系配置I管，編號為7，添加未巰基化單鏈DNA至終濃度為20 μ M，再用雙蒸水補足至總體積20 μ L ;所述未巰基化單鏈DNA的序列為:CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.4 所示；
[0066]添加巰基化單鏈DNA的優化體系配置6管，編號8_13，分別添加巰基化單鏈DNATm值為12.9。。，30.3。。，37.7。。，47.4。。，53。。，59.1。。;具體Tm值及所添加的巰基化單鏈DNA序列如下:
[0067]編號8:12.90C ；HS-C6H12-GTATGTGC,核苷酸序列如 SEQIDN0.9 所示；
[0068]編號9:30.30C ；HS-C6H12-GTATGTGCCC,核苷酸序列如 SEQIDN0.10 所示；
[0069]編號10:37.70C ;HS-C6H12_GTATGTGCCCAT，核苷酸序列如 SEQIDN0.11 所示；
[0070]編號11:47.40C ；HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG,核苷酸序列如 SEQIDN0.3 所示；
[0071]編號12:53°C ;HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.12 所示；
[0072]編號13:59.10C ；HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTGCG,核苷酸序列如 SEQIDN0.13 所
/Jn ο
[0073](2)利用PCR技術對模板分子進行擴增，擴增程序為:95°C 5min ；95 °C 30s，58°C 30s, 72°C 30s，35 個循環；72°C 7min。[0074](3)對擴增後的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測:
[0075]擴增結果如圖2所示，其中，各泳道所對應的樣品如下:
[0076]M:分子量標記(北京天根公司MarkerI,自下至上分別為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp)；
[0077]1-3:常規 PCR 體系；
[0078]2:加入Tm=O0C的隨機非同源巰基化單鏈DNA的優化改進體系(GTATGT)；
[0079]4-6:分別為添加HS-ssDNAl、HS_ssDNA2、HS_ssDNA3的巰基化單鏈DNA優化改進體系；
[0080]7:添加序列為CATACGCTCCAGACC的未巰基化單鏈DNA的對照體系；
[0081 ] 8-13:分別添加巰基化單鏈 DNATm 值為 12.9 °C，30.3 °C，37.7 °C，47.4 °C，53 °C，59.1°C的優化改進體系。
[0082] 該擴增的目的基因片段為106bp，由圖2可見，在常規PCR中出現了嚴重的非特異性擴增，表現為2條非特異性條帶(200bp上下，泳道1-3)，加入Tm≥37.7°C的隨機巰基化單鏈DNA的PCR體系非特異性擴增完全消失(泳道4-6，10-13)，而加入未巰基化單鏈DNA和1'111值< 37.7°C的巰 基化單鏈DNA的對照體系非特異性擴增依然存在(泳道7_9)。
【權利要求】
1.巰基化單鏈DNA在增強聚合酶鏈式反應特異性擴增中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於:所述巰基化單鏈DNA，滿足以下條件:(I)為一段與靶序列不互補、非同源的任意序列；(2) Tm值> 37.7°C; (3)至少一端含巰烷基基團 SH-C6H12-。
3.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於:具體應用方法為:將適量巰基化單鏈DNA加入PCR反應體系中進行PCR擴增；所述適量指在20 μ L反應體系中巰基化單鏈DNA的終濃度不小於15 μ Mo
4.根據權利要求1或2或3所述的應用，其特徵在於:所述巰基化單鏈DNA包括但不限於以下序列: HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.3 所示； HS-ssDNA1:HS-C6H12-CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.4 所示； HS-ssDNA2:HS-C6H12-GCCCTCTACTCCACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.5 所示； HS-ssDNA3:HS-C6H12-ACAGCCTCACTGGAA，核苷酸序列如 SEQIDN0.6 所示； HS-ssDNA4:HS-C6H12-TGACTCCATCATCTGTT，核苷酸序列如 SEQIDN0.7 所示； HS-ssDNA5:HS-C6H12-TAGGACAATCCGTATCT，核苷酸序列如 SEQIDN0.8 所示； HS-C6H12-GTATGTGC，核苷酸序列如 SEQIDN0.9 所示； HS-C6H12-GTATGT GCCC，核苷酸序列如 SEQIDN0.10 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCAT，核苷酸序列如 SEQIDN0.11 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.12 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTGCG，核苷酸序列如 SEQIDN0.13 所示。
5.一種利用巰基化單鏈DNA增強聚合酶鏈式反應特異性擴增的方法，其特徵在於:將適量巰基化單鏈DNA加入PCR反應體系中進行PCR擴增；所述適量指在20 μ L反應體系中巰基化單鏈DNA的終濃度不小於15 μ M0
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於:所述巰基化單鏈DNA包括但不限於以下序列: HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.3 所示； HS-ssDNA1:HS-C6H12-CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.4 所示； HS-ssDNA2:HS-C6H12-GCCCTCTACTCCACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.5 所示； HS-ssDNA3:HS-C6H12-ACAGCCTCACTGGAA，核苷酸序列如 SEQIDN0.6 所示； HS-ssDNA4:HS-C6H12-TGACTCCATCATCTGTT，核苷酸序列如 SEQIDN0.7 所示； HS-ssDNA5:HS-C6H12-TAGGACAATCCGTATCT，核苷酸序列如 SEQIDN0.8 所示； HS-C6H12-GTATGTGC，核苷酸序列如 SEQIDN0.9 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCC，核苷酸序列如 SEQIDN0.10 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCAT，核苷酸序列如 SEQIDN0.11 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.12 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTGCG，核苷酸序列如 SEQIDN0.13 所示。
7.巰基化單鏈DNA，其特徵在於:所述巰基化單鏈DNA滿足以下條件:(I)為一段與靶序列不互補、非同源的任意序列；(2)Tm值≤37.7°C; (3)至少一端含巰烷基基團SH_C6H12-。
8.權利要求7所述的巰基化單鏈DNA，其特徵在於:所述巰基化單鏈DNA包括但不限於以下序列: HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.3 所示； HS-ssDNA1:HS-C6H12-CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.4 所示； HS-ssDNA2:HS-C6H12-GCCCTCTACTCCACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.5 所示； HS-ssDNA3:HS-C6H12-ACAGCCTCACTGGAA，核苷酸序列如 SEQIDN0.6 所示； HS-ssDNA4:HS-C6H12-TGACTCCATCATCTGTT，核苷酸序列如 SEQIDN0.7 所示； HS-ssDNA5:HS-C6H12-TAGGACAATCCGTATCT，核苷酸序列如 SEQIDN0.8 所示； HS-C6H12-GTATGTGC，核苷酸序列如 SEQIDN0.9 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCC，核苷酸序列如 SEQIDN0.10 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCAT，核苷酸序列如 SEQIDN0.11 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.12 所示； HS-C6H12-GTATGTGC CCATGTGTTGCG，核苷酸序列如 SEQIDN0.13 所示。
【文檔編號】C12N15/11GK103993005SQ201410157936
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月18日 優先權日:2014年4月18日
【發明者】路興波, 張廣遠, 孫紅煒, 李凡, 楊淑珂, 高瑞, 徐曉輝 申請人:山東省農業科學院植物保護研究所