以抑制Smurf1泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選方法

2023-04-24 04:32:16 2

以抑制Smurf1泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選方法
【專利摘要】以抑制Smurf1泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選方法，涉及抗癌症藥物篩選。將候選化合物與物質實體接觸；觀察候選化合物對所述一種抑制E3泛素連接酶Smurf1泛素化降解其底物RhoB的檢測結果的影響，所述候選化合物若能夠使細胞內的檢測結果發生負向改變，即表徵Smurf1泛素化降解RhoB的能力減弱，則表明該候選化合物是抗腫瘤的潛在藥物。所述表明該候選化合物是抗腫瘤的潛在藥物後，可進一步選擇能提高癌細胞中RhoB蛋白含量的化合物，其具體方法：將候選化合物與不同類型的腫瘤細胞接觸；觀察候選化合物對不同類型的腫瘤細胞中RhoB蛋白含量的影響。實驗周期短、檢測過程快、靈敏度高、應用範圍廣。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗癌症藥物篩選，尤其是涉及以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB為靶點 的抗腫瘤藥物篩選方法。 以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選 方法

【背景技術】
[0002] 2010年，癌症已超過心腦血管疾病成為第一大危害人類健康的疾病。2013年世界 衛生組織公布，全世界每年患癌症人數大幅度增長，至今每年檢驗出的新增癌症患者數已 經超過1400萬名。這與2008年的統計結果1270萬人相比，人數明顯增加。同期，癌症患 者的死亡人數也有所增加，從過去的760萬人增加到820萬人。癌細胞區別正常細胞的一 個重要標誌就是逃逸細胞程序性死亡，即細胞凋亡（apoptosis)。細胞凋亡是由於內外環境 變化或死亡信號觸發，在相關基因調控下引起的細胞主動死亡過程，在生理狀態下能消除 機體內老化細胞及潛在性異常生長細胞，對於保持機體穩態發揮重要作用。凋亡調控失調 可引起人體多種疾病，也是腫瘤發生的重要原因之一。近年研究也發現，放化療等多種抗腫 瘤治療的部分機制與誘導凋亡有關。因此，探明凋亡的相關機制以及利用凋亡機制對腫瘤 進行治療具有重要意義。腫瘤細胞通常具有一定的凋亡抵抗機制，利用細胞凋亡機制針對 腫瘤的治療也就是在凋亡調節的各個水平上使促凋亡和抗凋亡的平衡發生改變，誘導腫 瘤細胞凋亡。
[0003] 隨著對腫瘤細胞凋亡機制的深入研究，藥物誘導腫瘤細胞凋亡已成為目前腫瘤治 療的重要途徑之一。在目前的抗癌藥物中，無論是細胞周期特異性藥物，還是細胞周期非特 異性藥物，對癌細胞的殺傷作用都服從一級動力學原理，即只能按比例而不能全部殺傷腫 瘤細胞。目前，臨床上用於治療腫瘤的藥物大都無法避免對機體產生副作用，因此尋求高效 誘導細胞凋亡的藥物，在殺傷殘存的癌細胞的同時，又能避免對正常細胞的殺傷，具有非常 重要的意義。
[0004] Smurf 1 (SMAD Ubiquitination Regulatory Factorl)是一種 E3 泛素連接酶，在 1999年由Zhu等人以Smadl為誘餌利用酵母雙雜交技術，在非洲爪蟾中發現並鑑定出來。 它能選擇性地結合受體調節蛋白Smad家族的成員，並使其泛素化降解，進而調節TGFi3信 號通路。近幾年的研究發現，Smurfl在腸癌、胰腺癌和前列腺癌中高表達，提示其可能作為 一個原癌基因促進腫瘤的發生。有文獻報導，Smurfl可以泛素化降解RhoA促進腫瘤細胞 的上皮 _基質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程，還可以通過單泛素 化TRAF4分子促進乳腺癌細胞的遷移。而且，Smurfl還可以通過穩定細胞內MDM2的蛋白 水平抑制P53蛋白的穩定性，從而抑制細胞凋亡。
[0005] RhoB和其同家族的RhoA和RhoC在胺基酸序列有86 %的同源性，生 物學功能也有重合：以前的觀點認為，RhoA，RhoB，RhoC協同調控細胞骨架運動 (Etienne-Manneville, S.，and Hall, A. 2002. Nature420, 629-635)。但更多的證據顯不， RhoB具有許多獨特於RhoA和RhoC的性質。最有意思的是，與RhoA和RhoC促進細胞增長 的作用不同，RhoB作為一個抑癌基因，抑制細胞增長。雖然RhoB敲除的小鼠沒有明顯的 生理缺陷，但是RhoB-/-的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF)在纖維蛋白原（fibronectin)上的 運動能力明顯減弱。過表達RhoB基因的細胞生長緩慢，並易於發生凋亡。小鼠腹腔注射 RhoB-/-細胞的成瘤效率明顯高於Rh〇B+/+細胞。而且，用DMBA，一種導致皮膚癌變的化學 誘變劑處理野生型和RhoB敲除型小鼠的皮膚，敲除小鼠的皮膚瘤發生率顯著增高（Liu，A. X.，2001. Mol Cell Biol21，6906-6912)。臨床樣本也顯示，隨著肺癌、頭頸癌和腦癌腫瘤 惡性程度的增加，RhoB蛋白水平呈逐漸下降的趨勢，提示其可能作為一個抑癌基因發揮抗 腫瘤的功能（Adnane, J.，2002. Clin Cancer Res8, 2225-2232 ;Karlsson, R.，2009. Biochim Biophys Actal796, 91-98 ；Mazieres, J. , 2004. Clin Cancer ReslO, 2742-2750)〇
[0006] RhoB這種抑制細胞增殖的功能可能和其在外界環境壓力下協助細胞走向凋亡途 徑相關。經E1A和突變的H-Ras轉化過的Rh 〇B-/-MEF細胞在γ射線，拓撲異構酶抑制 劑阿黴素（Doxorubcin，D0X)等DNA損傷試劑處理後，其凋亡程度明顯低於野生型對照組 (Liu, A.X，2001. Proc Natl Acad Sci U S A98, 6192-6197)。而呼吸鏈阻斷劑疊氮化納 (NaN3)引起的細胞凋亡似乎和RhoB無關，說明RhoB獨特應答由DNA損傷（DNA damage)引 起的凋亡信號。同樣，幹涉內源的RhoB後，人胃癌細胞NUGC-3對抗癌藥物表現出不敏感性， 凋亡比例明顯下降（Kim, Β· K.，2011. Carcinogenesis32, 254-261)。因此，RhoB 被認為是一 個良好的藥物靶點。


【發明內容】

[0007] 本發明的第一目的在於提供一種抑制E3泛素連接酶Smurfl泛素化降解其底物 RhoB的檢測方法。
[0008] 本發明的第二目的在於提供一種抑制E3泛素連接酶Smurfl泛素化降解其底物 RhoB的用途。
[0009] 本發明的第三目的在於提供一種以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤 藥物篩選的方法。
[0010] 所述一種抑制E3泛素連接酶Smurf 1泛素化降解其底物RhoB的檢測方法，選自但 不限於細胞分子生物學檢測方法或化學生物學檢測方法，所述細胞分子生物學檢測方法包 括但不限於免疫共沉澱方法、免疫印跡、體內和體外泛素化及流式細胞技術檢測細胞凋亡 等；所述化學生物學檢測方法包括但不限於螢光滴定法、BIAcore方法等。
[0011] 所述一種抑制E3泛素連接酶Smurfl泛素化降解其底物RhoB可用於抑制Smurfl 泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物的篩選。
[0012] 所述一種以抑制Smurfl泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選的方法，包括 以下步驟：
[0013] (a)將候選化合物與物質實體接觸；
[0014] 在步驟（a)中，所述物質實體可選自細胞或體外表達純化的蛋白質等。
[0015] (b)觀察候選化合物對所述一種抑制E3泛素連接酶Smurfl泛素化降解其底物 RhoB的檢測結果的影響，所述候選化合物若能夠使細胞內的檢測結果發生負向改變，即表 徵Smurfl泛素化降解RhoB的能力減弱，則表明該候選化合物是抗腫瘤的潛在藥物。
[0016] 在步驟（b)中，所述表明該候選化合物是抗腫瘤的潛在藥物後，可進一步選擇能 提高癌細胞中RhoB蛋白含量的化合物；所述進一步選擇能提高癌細胞中RhoB蛋白含量的 化合物的具體方法可為：
[0017] (1)將候選化合物與不同類型的腫瘤細胞接觸；
[0018] (2)觀察候選化合物對不同類型的腫瘤細胞中RhoB蛋白含量的影響。
[0019] 在步驟（2)中，所述觀察候選化合物對不同類型的腫瘤細胞中RhoB蛋白含量的影 響後，可對篩選出的且能夠提高不同腫瘤細胞中RhoB含量的潛在化合物進行進一步的細 胞凋亡實驗和裸鼠成瘤模型實驗，以選出有效抗腫瘤的藥物（化合物）。
[0020] 本發明的主要優點在於：
[0021] 1、首次提供了一種以抑制Smurfl泛素化降解RhoB的抗腫瘤藥物靶點，提供了一 種以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選方法，所述方法包含蛋白-蛋 白相互作用的檢測，RhoB泛素化化水平的檢測，細胞凋亡檢測以及裸鼠成瘤實驗模型。
[0022] 2、本發明的方法包含了三個層層遞進的篩選方法，靶點功能明確，作用效果直觀， 系統穩定，結果可靠，具有實驗周期短、檢測過程快、靈敏度高、應用範圍廣等特點，為高通 量的抗腫瘤藥物的篩選提供了新的方法，可應用於藥物開發前沿，及建立化合物規模篩選 的技術平臺。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為過表達E3泛素連接酶Smurfl影響HeLa細胞內源RhoB蛋白水平。實驗結 果表明，Smurfl野生型（Smurf 1WT)可以有效降低RhoB的蛋白水平，而其E3連接酶失活體 (SmurflCA)卻對RhoB的蛋白穩定性無影響。Flag-SmurflWT和Flag-SmurflCA質粒轉染 HeLa細胞，24h後常規收集細胞，然後進行免疫印跡實驗（Western blotting)檢測細胞裂 解液中RhoB的蛋白水平。
[0024] 圖2為幹涉細胞內源E3泛素連接酶Smurfl後對RhoB蛋白水平的影響。實驗結 果表明，用兩種特異幹涉細胞內Smurfl的幹涉RNA(sh-Smurfl_l，sh-Smurfl-2)可以提高 RhoB蛋白的穩定性。分別用Smurfl的幹涉RNA(sh-Smurfl_l，sh-Smurfl-2)轉染HeLa細 胞，48h後用免疫印跡實驗（Western blotting)檢測RhoB的蛋白水平。
[0025] 圖3為Smurf 1和RhoB的體外GST-Pulldown實驗。實驗結果表明，大腸桿菌表達 的GST-Smurfl和RhoB可以直接結合。利用大腸桿菌BL21表達的GST-Smurfl和RhoB蛋 白可以相互結合。
[0026] 圖4為細胞內Smurfl對RhoB泛素化水平的影響。實驗結果表明，Smurfl可以增 強 RhoB 的泛素化水平。Myc-SmurflWT，Myc-SmurflCA，Flag-RhoB 及 HA_Ub 按圖所不共同 轉染293T細胞20h後用蛋白酶體抑制劑MG-132處理細胞（5yM，18h)。然後常規收集細 胞，並用Flag抗體進行免疫沉澱實驗（Co-immunoprecipitation assay),然後用免疫印跡 實驗（Western blotting)檢測免疫沉澱複合物中Flag-RhoB泛素化水平。
[0027] 圖5為細胞內Smurfl的蛋白水平對RhoB泛素化水平的影響。實驗結果表明，抑制 細胞內Smurf 1的蛋白表達可以降低RhoB的泛素化水平。Smurfl的幹涉RNA(sh-Smurfl_l， sh-Smurfl-2)，Flag-RhoB及HA-Ub按圖所示共同轉染293T細胞48h後用蛋白酶體抑制 劑MG-132處理細胞（5 μ M，18h)。然後常規收集細胞，並用Flag抗體進行免疫沉澱實驗 (Co-immunoprecipitation assay),然後用免疫印跡實驗（Western blotting)檢測免疫沉 澱複合物中Flag-RhoB泛素化水平。
[0028] 圖6為Smurfl和RhoB的體外泛素化實驗。實驗結果表明，大腸桿菌表達的 GST-Smurfl可以泛素化RhoB。利用大腸桿菌BL21表達的GST-Smurfl可以利用泛素（Ub) 對RhoB蛋白進行泛素化。
[0029] 圖7為化合物XM01對HeLa細胞中RhoB蛋白穩定性的影響。實驗結果表明，XM01 可以有效提高HeLa細胞內RhoB蛋白的穩定性。XM01按不同濃度處理細胞24h後，用免疫 印跡實驗（Western blotting)檢測細胞裂解液中RhoB的蛋白含量。
[0030] 圖8為免疫印跡方法檢測化合物XM01對Smurf 1泛素化降解RhoB能力的影響。實 驗結果表明，XM01可以有效抑制Smurfl泛素化降解RhoB。Flag-SmurflWT、Flag_SmurflCA 和Flag-RhoB質粒共轉染293T細胞，24h後用不同濃度的化合物XM01處理細胞，然後常規 收集細胞進行免疫印跡實驗（Western blotting)檢測細胞裂解液中RhoB的蛋白水平。
[0031] 圖9為體外泛素化方法檢測化合物XM01對Smurfl泛素化降解RhoB能力的影響。 實驗結果表明，XM01可以在體外系統中有效抑制Smurfl泛素化降解RhoB。
[0032] 圖10為流式細胞技術檢測細胞凋亡。實驗結果表明，隨著化合物XM01濃度的升 高，HeLa細胞的凋亡程度也隨之升高，說明XM01可以通過引起細胞凋亡抑制腫瘤生長。
[0033] 圖11為裸鼠成瘤能力的檢測。將HeLa細胞以5X106的密度接種於裸鼠後腿腿 根的側皮下，四周後用化合物XM01處理右側皮下腫瘤，對照溶劑DMS0處理左側皮下腫瘤， 一周後再觀察腫瘤大小。實驗結果表明，化合物XM01顯著抑制了腫瘤細胞在裸鼠體內的生 長。

【具體實施方式】
[0034] 本發明的結果表明，E3泛素連接酶Smurf 1通過泛素化降解RhoB，從而調控細胞在 DNA損傷條件下發生的凋亡。在正常條件下，Smurfl泛素化降解RhoB將其蛋白保持在較低 的水平。而在DNA損傷的條件下，Smurfl自身泛素化降解增強，從而導致RhoB的蛋白穩定 性增強，促進細胞發生凋亡。
[0035] 基於以上結果，建立了抑制Smurf 1泛素化降解RhoB的檢測系統，並能夠從候選化 合物中篩選出能夠抑制Smurfl泛素化降解RhoB的化合物，從而為抗腫瘤新藥開發提供一 個有利的技術平臺。重要的是，針對這一靶點的藥物，將可能解決現有的抗腫瘤藥物靶點特 異性不強、副作用強及藥物毒性等問題，從而為治療癌症提供更好的治療手段。
[0036] 抑制E3泛素連接酶活性的靶點
[0037] 本發明提供了一種E3泛素連接酶降解其底物的靶點，S卩Smurfl降解RhoB靶點。 實驗表明，通過常規手段（但不限於）可檢測該底物的泛素化強度，並可觀察候選化合物對 該泛素化強度的影響，用於篩選抗腫瘤的化合物。
[0038] 所述的檢測Smurfl降解RhoB的手段包括但不限於：免疫共沉澱、免疫印跡、體內 及體外泛素化實驗。只要適用於檢測泛素化強度的其它方法也被包含在本發明中。作為本 發明的優選方式，所述的檢測方法是體內-體外泛素化及流式細胞技術。該方法的優點是 快速準確，結果更可靠。
[0039] 篩選方法
[0040] 所述的篩選方法是抑制Smurf 1泛素化降解RhoB的檢測方法，可以是細胞水平上 的檢測方法，也可以是對體外表達純化的蛋白質進行檢測的方法。通過在細胞培養物中加 入候選化合物，或者使體外純化表達的蛋白質與候選化合物接觸產生作用，觀察候選化合 物對所述Smurfl泛素化降解RhoB的影響，從而篩選潛在的抗腫瘤化合物。
[0041] 因此，本發明還提供一種以抑制Smurfl泛素化降解RhoB為靶點的篩選抗腫瘤的 潛在藥物（化和物）的方法，所述方法包括步驟：
[0042] (a)將候選化合物與所述的相互作用檢測方法中的物質實體（如細胞，體外表達 純化的蛋白質）接觸；和
[0043] (b)觀察候選化合物對所述的相互作用檢測方法中的檢測結果的影響；
[0044] 其中，如果候選化合物能夠使細胞內的檢測結果發生負向改變，即表徵Smurf 1泛 素化降解RhoB能力減弱，則表明該化合物是抗腫瘤的潛在藥物（化合物）。
[0045] 作為本發明的優選方式，將分別攜帶所述的兩種蛋白的編碼序列的重組載體瞬時 共同轉染哺乳動物細胞，通過免疫印跡方法檢測所述兩種蛋白間的相互作用，篩選潛在的 抗腫瘤藥物。為了實現上述目的，採用以下技術：Smurfl表達載體及RhoB表達載體的構建； Smurfl表達載體、RhoB表達載體瞬時共同轉染系統的構建；免疫印跡方法檢測Smurfl對 RhoB泛素化能力。
[0046] 通過上述方法初步篩選出的化合物可構成一個篩選庫，以便於最終可以從中選擇 到對腫瘤生長有抑制作用的藥物。
[0047] 在另一優選例中，所述的方法還包括選擇能提高腫瘤細胞內RhoB蛋白水平的化 合物。所述方法包括步驟：
[0048] (a)將候選化合物與腫瘤細胞接觸；和
[0049] (b)觀察候選化合物對腫瘤細胞內RhoB蛋白水平水平的影響。
[0050] 通過上述方法，可以對初步篩選到的化合物進行進一步的篩選或驗證。
[0051] 在另一優選例中，所述的方法還包括步驟：對如上獲得的潛在化合物進行進一步 的流式細胞凋亡檢測及裸鼠成瘤實驗，以選出有效抗腫瘤的藥物（化合物）。
[0052] 通過上述方法，可從上兩次篩選出的潛在化合物中選擇到抗腫瘤藥物（化合物）。
[0053] 以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本 發明而非用於限定本發明的範圍。任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於 本發明中。所述的優選實施方法與材料僅做示範之用。
[0054] 實施例1
[0055] 採用免疫印跡分析（Western blotting)方法檢測Smurfl對RhoB蛋白穩定性的 影響。
[0056] 試驗方法如下：
[0057] 1)細胞轉染：
[0058] 將細胞接種於直徑12孔培養板，24h後轉染，轉染前細胞換新鮮的培養液。轉染步 驟為：取1. 5mL離心管，依次加入水180 μ L，相應質粒，2· 5M CaCl220 μ L，HBS200 μ L，輕柔 混勻後，於室溫靜置15?30min，隨後緩慢滴加到培養液中，輕輕晃動培養盤，使分布均勻。
[0059] 轉染12h後，將細胞培養液換為新鮮的DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium)，繼續培養12h後，常規收集細胞以用於後續實驗。
[0060] 溶液配方：
[0061] HBS ：280mM NaCl, lOmM KC1, 1. 5mM Na2HP04, 12mM Glucose, 50mM HEPES, pH7. 05〇
[0062] 2) Western-blot 檢測：
[0063] a.蛋白電泳：
[0064] 取20?40μ g蛋白樣品，加等體積4XSDS樣品緩衝液，95°C煮沸5min，於不連續 SDS-PAGE膠中電泳，電壓100V，待樣品進入分離膠後將電壓調為150V。
[0065] b.電轉移：
[0066] 電轉液於4°C預冷，切好膠後將同樣大小的甲醇預處理的PVDF膜以及濾紙浸於 電轉液中；PVDF膜貼於膠後，兩面覆蓋濾紙，趕盡氣泡，按膜朝正極的順序裝於電轉槽中， 於一 20°C 電轉（100V，60min)。
[0067] c.抗原抗體反應：
[0068] ①封閉：封閉液室溫封閉lh ;
[0069] ②一抗反應：封閉後膜與相應一抗於室溫孵育1?3h ;
[0070] ③二抗反應：TBST洗3次，每次5min，之後加入相應的二抗，於室溫孵育1?3h。
[0071] d.ECL 檢測：
[0072] TBST洗3次，每次lOmin。ECL的A液和B液以1 : 1 (V/V)混和，滴加於膜表面， 孵育lmin後曝光。
[0073] 試驗結果如下：
[0074] 如圖1及圖2所示，；Smurfl野生型（SmurflWT)可以有效降低RhoB的蛋白水平， 而其E3連接酶失活體（Smurf 1CA)卻對RhoB的蛋白穩定性無影響。同樣，用兩種特異幹涉 細胞內Smurfl的幹涉RNA(sh-Smurfl_l，sh-Smurfl-2)可以提高RhoB蛋白的穩定性。
[0075] 試驗結果表明，Smurf 1可以調經細胞內RhoB蛋白的穩定性。
[0076] 實施例2
[0077] 用GST融合蛋白沉降技術（GST-Pulldown)檢測Smurfl和RhoB的結合。
[0078] 試驗方法如下：
[0079] 1)蛋白的體外表達及純化
[0080] 首先將目的DNA片段克隆到合適的細菌表達載體中，正確的質粒轉化 E. coliBL-21或DH-5 α細胞，在LB/氨苄青黴素平板上選擇轉化子，接種到適量的LB/amp 培養基中，37°C搖動培養過夜。第二天以此為種子，以1 : 100的比例接種到大體積的LB/ amp培養基中，37°C搖動培養到0D_大約為0. 6,加入IPTG到終濃度為lmmol/L以誘導融 合蛋白的表達，20°C低溫誘導以減少包涵體的形成，繼續培養6h以上。對於不同的載體或 不同的蛋白，最佳的的誘導前細菌濃度，誘導所需的IPTG濃度和誘導的溫度、誘導的時間 均不同。
[0081] 蛋白表達完成後，離心收集菌體，用適量預冷的裂解緩衝液（lysis buffer)重懸 菌體，用超聲破碎儀破碎菌體，超聲前加入蛋白酶抑制劑PMSF到終濃度為lmmol/L。超聲破 碎的功率及時間根據不同的細菌濃度和不同大小的蛋白而不同。破碎後的菌體以12000r/ min的轉速，4°C離心10min，上清轉移到新的管子中。加入預先洗好的GST beads,在4°C的 旋轉混合儀上混合3h以上。親和有蛋白的GST beads用預冷的裂解緩衝液洗幾次後，得到 相對較純的融合蛋白。
[0082] 2)蛋白質體外GST pull down實驗
[0083] 利用穀胱甘肽S-轉移酶（GST)基因融合載體體外表達純化出GST、GST-RhoB和 GST-Smurf 1CA融合蛋白，其中，GST-RhoB蛋白用TEV酶將GST標籤去除，得到RhoB蛋白。 按圖2所示加入相應量的純化蛋白。旋轉搖床4?孵育lh，加入20 μ L4X loading buffer 終止反應，加熱至95°C，5min。樣品進行SDS-PAGE和Western blot分析。
[0084] 試驗結果如下：
[0085] 如圖3所示，GST-Smurfl蛋白可以在體外直接和RhoB蛋白相互結合。
[0086] 實施例3
[0087] 通過細胞內泛素化實驗檢測Smurfl是否影響RhoB的泛素化水平。
[0088] 試驗方法如下：
[0089] 以1.5?2X105個/mL的密度接種細胞於10cm細胞培養盤中，待細胞密度達到 40%至50%時，用磷酸鈣法轉染相應組合的質粒。轉染24h後換液同時加藥，10 μ M MG-132 處理細胞，加藥的目的是抑制已經被不同程度泛素化的底物蛋白通過溶酶體途徑降解，轉 染後36h收集細胞，用含有PMSF和ΝΕΜ的ΤΝΤΕ (0. 5 % ) buffer進行裂解。從得到的lmL細 胞裂解液中，取45 μ L作為 total lysate加入 15 μ L4X loading buffer用於Western blot 分析，剩餘955 μ L用於第一次IP。第一次IP時細胞裂解液中加入lyL Flag-抗，旋轉搖 床4°C孵育2h，加入30 μ L預先封閉好的proteinA/G，旋轉搖床4°C孵育2h。用TNTE (0· 1 % ) buffer洗滌3次，加入60 μ L的1 % SDS，加熱至95°C，5min，使被IP下來的各種處於結合 狀態的蛋白質相互分離。取上清，用TNTE(0. 1% )buffer稀釋至500μ L的體積，進行第二 次ΙΡ，步驟同上。製備好的樣品用於Western blot分析，其中用ΗΑ抗體檢測檢測底物蛋白 的泛素化情況。
[0090] 試驗結果如下：
[0091] 如圖4及圖5所示，Smurfl野生型（Smurf 1WT)可以有效提高RhoB泛素化水平， 而其E3連接酶失活體（SmurflCA)卻對RhoB的泛素化水平無影響。而幹涉細胞內Smurf! 後RhoB的泛素化水平明顯降低。
[0092] 實施例4
[0093] 採用體外泛素化實驗檢測Smurfl是否影響RhoB的泛素化水平。
[0094] 試驗方法如下：
[0095] 體外表達純化出泛素活化酶E1，泛素結合酶E2,泛素連接酶E3, RhoB蛋白，泛素 Ubiquitin。根據圖6加入相應量的純化蛋白。室溫孵育15min，使底物蛋白RhoB和E3泛 素連接酶充分結合，然後加入E1啟動泛素化反應，室溫孵育45min，等體積的2% SDS加熱 至95°C，5min。取上清用ΤΝΤΕ0. 5擴大體積，加 Flag抗體和protein A/G4°C孵育過夜，樣 品進行 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。
[0096] 試驗結果表明，如圖6所示，Smurfl野生型（SmurflWT)而非其E3連接酶失活體 (SmurflCA)可以有效的提高RhoB泛素化水平。
[0097] 實施例5
[0098] 化合物XM01對HeLa細胞中RhoB蛋白穩定性的影響。
[0099] 實驗方法如下：
[0100] 利用實施例1採用的細胞培養及免疫印跡方法用不同濃度的化合物XM01處理 HeLa細胞24h，按常規收集細胞，然後進行免疫印跡實驗（Western blotting)檢測細胞裂 解液中RhoB的蛋白水平。
[0101] 實驗結果表明，如圖7所示，隨著化合物XM01濃度的升高，HeLa細胞中RhoB蛋白 的穩定也逐步提高，表明XM01是潛在的抑制Smurfl泛素化降解RhoB的化合物。
[0102] 實施例6
[0103] 免疫印跡方法檢測化合物XM01對Smurfl泛素化降解RhoB能力的影響。
[0104] 利用實施例1採用的細胞培養、細胞轉染及免疫印跡方法，用不同濃度的化合物 XM01處理轉染後的293T細胞，24h後按常規收集細胞，然後進行免疫印跡實驗（Western blotting)檢測細胞裂解液中RhoB的蛋白水平。
[0105] 實驗結果表明，如圖8所示，隨著化合物XM01濃度的升高，293T細胞中Flag-RhoB 蛋白的穩定也逐步提高，表明XM01是潛在的抑制Smurfl泛素化降解RhoB的化合物。
[0106] 實施例7
[0107] 體外泛素化方法檢測化合物XM01對Smurfl泛素化降解RhoB能力的影響。利用 實施例4採用的體外泛素化方法檢測用不同濃度的化合物XM01在體外系統中對Smurf 1對 RhoB泛素化能力的影響。根據圖9加入相應量的純化蛋白及不同濃度的XM01，反應後進行 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。
[0108] 實驗結果表明，如圖9所示，隨著化合物XM01濃度的升高，Smurfl在體外系統中 對RhoB泛素化能力逐漸減弱，表明XM01抑制Smurfl泛素化降解RhoB。
[0109] 實施例8
[0110] 流式實驗及裸鼠成瘤實驗檢測化合物XM01對腫瘤生長的抑制效果。
[0111] 利用實施例1採用的細胞培養方法檢測用不同濃度的化合物XM01對HeLa細胞凋 亡程度的影響。根據圖10加入不同濃度（對照，10 μ M，20 μ M)的化合物XM01，24h後收集 細胞進行流式細胞儀檢測。
[0112] 實驗結果表明，如圖10所示，隨著化合物XM01濃度的升高，HeLa細胞的凋亡程度 也隨之升高，表明XM01可以通過引起細胞凋亡抑制腫瘤生長。在圖10中，圖（a)為對照組， 凋亡比率為2.7%，圖（b)為ΧΜΟΙΙΟμΜ，凋亡比率為37.6%，圖（c)為ΧΜ0120μΜ，凋亡比 率為64. 7%。
[0113] 利用實施例1採用的細胞培養方法檢測化合物ΧΜ01對裸鼠成瘤能力的影響。將 HeLa細胞以5Χ 106的密度接種於裸鼠後腿腿根的側皮下，四周後用化合物ΧΜ01處理右側 皮下腫瘤，對照溶劑DMS0處理左側皮下腫瘤，一周後再觀察腫瘤大小。
[0114] 實驗結果表明，如圖11所示的兩隻裸鼠，化合物XM01顯著抑制了腫瘤細胞在裸鼠 體內的生長。
【權利要求】
1. 一種抑制E3泛素連接酶Smurf 1泛素化降解其底物RhoB的檢測方法，其特徵在於選 自但不限於細胞分子生物學檢測方法或化學生物學檢測方法，所述細胞分子生物學檢測方 法包括但不限於免疫共沉澱方法、免疫印跡、體內和體外泛素化及流式細胞技術檢測細胞 凋亡；所述化學生物學檢測方法包括但不限於螢光滴定法、BIAcore方法。
2. -種抑制E3泛素連接酶Smurfl泛素化降解其底物RhoB在用於抑制Smurfl泛素化 降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物的篩選中應用。
3. -種以抑制Smurfl泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選的方法，其特徵在於 包括以下步驟： (a) 將候選化合物與物質實體接觸； (b) 觀察候選化合物對所述一種抑制E3泛素連接酶Smurf 1泛素化降解其底物RhoB 的檢測結果的影響，所述候選化合物若能夠使細胞內的檢測結果發生負向改變，即表徵 Smurfl泛素化降解RhoB的能力減弱，則表明該候選化合物是抗腫瘤的潛在藥物。
4. 如權利要求3所述一種以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選的 方法，其特徵在於在步驟（a)中，所述物質實體選自細胞或體外表達純化的蛋白質。
5. 如權利要求3所述一種以抑制Smurfl泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選的 方法，其特徵在於在步驟（b)中，所述表明該候選化合物是抗腫瘤的潛在藥物後，進一步選 擇能提高癌細胞中RhoB蛋白含量的化合物。
6. 如權利要求5所述一種以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選的 方法，其特徵在於所述進一步選擇能提高癌細胞中RhoB蛋白含量的化合物的具體方法為： (1) 將候選化合物與不同類型的腫瘤細胞接觸； (2) 觀察候選化合物對不同類型的腫瘤細胞中RhoB蛋白含量的影響。
7. 如權利要求6所述一種以抑制Smurfl泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選的 方法，其特徵在於在步驟（2)中，所述觀察候選化合物對不同類型的腫瘤細胞中RhoB蛋白 含量的影響後，對篩選出的且能夠提高不同腫瘤細胞中RhoB含量的潛在化合物進行進一 步的細胞凋亡實驗和裸鼠成瘤模型實驗，以選出有效抗腫瘤的藥物。
【文檔編號】C12Q1/02GK104101714SQ201410335052
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】王洪睿, 郭磊, 王梅林, 曾濤玲, 林琦 申請人:廈門大學