雪膽素類衍生物及其製備方法和作為抗菌劑的應用的製作方法

2023-08-05 15:36:31

專利名稱：雪膽素類衍生物及其製備方法和作為抗菌劑的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及雪膽素衍生物，其製備方法，以該化合物為有效成分的抗菌劑。
背景技術：
現有技術中未對雪膽素的衍生物和類似物的活性和結構進行深入研究，迄今沒有從葫蘆科雪膽屬植物中雪膽素類四環三萜類物質在抗菌抗炎的活性及應用方面的報告。

發明內容
本發明的目的在於提供一種與現有技術不同的雪膽素衍生物，其製備方法，以該化合物為有效成分的抗菌劑。為了實現本發明的目的，本發明提供了如下技術方案如結構式(I)所示的雪膽甲素異構體化合物， R1＝COCH3，COCH2CH3，CO(CH2)nCH3n＝1-8；Glc，Xyl，ArR2＝COCH3，COCH2CH3，CO(CH2)nCH3n＝1-8R3＝COCH3，COCH2CH3，CO(CH2)nCH3n＝1-8R4＝COCH3，COCH2CH3，CO(CH2)nCH3n＝1-8R5＝COCH3，COCH2CH3，CO(CH2)nCH3n＝1-8本發明同時提供了式(I)雪膽素類衍生物的製備方法，不涉及化合物的全合成，是在從植物中分離出雪膽素類化合物的基礎上，就原有的骨架，用常規的酯化反應製備。
更具體地方法是取麗江雪膽地下塊莖粉碎後用乙醇回流提取3次，每次4小時，減壓濃縮得浸膏，溶於水後先用石油醚60-90℃萃取，再用乙酸乙酯萃取，最後用水飽和的正丁醇萃取；乙酸乙酯部分進行反覆矽膠柱層析分離，洗脫劑分別用石油醚；氯仿∶丙酮；氯仿∶甲醇；氯仿∶甲醇∶水；純甲醇，正丁醇部分先經D101大孔樹脂柱層析，依次用10％，20％，80％和95％乙醇洗脫，80％乙醇洗脫流分經矽膠柱層析，分別用氯仿∶甲醇；氯仿∶甲醇∶水；甲醇為洗脫劑，從乙酸乙酯萃取部位，從氯仿∶丙酮；氯仿∶甲醇洗脫餾分，得式(I)化合物。
此外，本發明還提供了一種抗菌劑，其中含有抗菌有效量的式(I)化合物和抗菌學上可接受的載體。
同時提供了式(I)化合物在製備抗菌劑中的應用。
具體實施例方式下面結合實施例進一步對本發明實質性內容進行說明，但本發明的內容並不局限於此。
實施例11、提取與分離取麗江雪膽地下塊莖風乾，稱取2公斤，粉碎後用乙醇回流提取3次，每次4小時。提取液減壓濃縮得浸膏201.6克，溶於水後先用石油醚(60-90℃)萃取，再用乙酸乙酯萃取，得43.7克，最後用水飽和的正丁醇萃取，得99.1克。乙酸乙酯部分進行反覆矽膠柱層析分離，洗脫劑分別用石油醚；氯仿∶丙酮；氯仿∶甲醇；氯仿∶甲醇∶水；純甲醇。正丁醇部分先經D101大孔樹脂柱層析，依次用10％，20％，80％和95％乙醇洗脫，80％乙醇洗脫流分經矽膠柱層析，分別用氯仿∶甲醇；氯仿∶甲醇∶水；甲醇為洗脫劑。共得化合物21個。其中從乙酸乙酯萃取部位，從氯仿∶丙酮；氯仿∶甲醇洗脫餾分，得到3個新葫蘆素類化合物，稱為雪膽素D(200mg)，雪膽素E(800mg)，雪膽素F(500mg)。
2、新雪膽素的結構鑑定雪膽素D，白色粉末，C34H52O9，M604；[α]D27.2+11.7°(c，0.34 in CDCl3)，mp110-115℃；IR νmaxKBr3446，2977，1736，1697，1371，1251，1026cm-1；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ5.67(1H，d，J＝5.8Hz，H-6)，5.10(1H，t，J＝7.96，7.92Hz，H-16β)，1.94，1.92，1.44，1.15，1.40，1.18，1.18，1.11，0.98，0.95(30H，s，10×CH3)；13C NMR(CDCl3，100.6MHz)δ，C-1-C-3030.4t，68.3d，78.7d，41.6s，137.8s，120.7d，23.8t，33.7d，47.9s，42.4d，212.4s，48.6t，48.4s，50.0s，43.3t，74.2d，54.0d，20.1q，18.9q，78.5s，24.2q，212.4s，29.2t，35.2t，81.0s，26.5q，28.0q，19.5q，20.9q，25.3q；25-OAc171.4s，22.4q；16-OAc171.4s，20.9q.FAB-MS(neg.)m/z603[M-H]-，EI-MS m/z..544[M-CH3COOH]+，447[M-CH3COOH-C6H9O]+，387，219，113。
雪膽素E，白色粉末，C32H50O8，M560；[α]D27.1+7.8°(c，0.55 in CHCl3)；IRνmaxKBr3448，2974，1735，1696，1376，1249，1041，1028cm-1；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ5.63(1H，d，J＝5.36Hz，H-6)，5.09(1H，t，J＝7.96，8.12Hz，H-16β)，1.87，1.34，1.15，1.15，1.10，1.10，0.96，0.92(27H，s，9×CH3)；13C NMR(CDCl3，100.6MHz)δ，C-1-C-3030.8t，68.2d，78.8d，41.5s，137.9s，120.5d，23.7t，33.7d，47.8s，42.4d，212.5s，48.5t，48.4s，50.0s，43.3t，74.2d，53.9d，20.0q，18.9q，78.4s，24.2q，213.7s，29.0t，37.1t，9.8s，26.5q，29.2q，19.5q，20.9q，25.3q；16-OAc170.0s，20.9q；FAB-MS(neg.)，561[M-H]-，EI-MS m/z544[M-H2O]+，447[M-H2O-C6H9O]+，387，219，142，113。
雪膽素F，白色粉末，C40H62O14，M766；IRνmaxKBr3448，2978，2881，1735，1372，1026cm-1；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ5.67(1H，d，J＝5.5Hz，H-6)，5.41(1H，t，J＝7.75，8.3Hz，H-16β)，1.97，1.95，1.46，1.45，1.39，1.25，1.21，1.12，1.06，0.94(30H，s，10×CH3)；13C NMR(CDCl3，100.6MHz)δ，C-1-C-3030.5t，73.2d，77.3d，41.3s，138.0s，120.0d，23.7t，33.7d，47.8s，42.5d，212.5s，48.7s，50.0s，43.3t，74.1d，54.0d，20.1q，18.7q，78.7s，24.3q，213.5s，27.6t，35.1t，81.0s，26.5q，25.9q，19.5q，20.8q，25.5q，170.1s，22.2q，170.0s，20.8q；25-OAc170.1s，22.2q；16-OAc170.0s，20.8q；2-O-Glu101.1d，75.5d，77.8d，69.4d，76.3d，61.4t；FAB-MS(neg.)m/z765[M-H]-；EI-MSm/z603[M-163]+，447，369，219，113。
3、雪膽素C的製備方法雪膽甲素300mg加適量氫氧化鉀-乙醇溶液，加熱回流0.5-1.5小時，加入大量水之後，再加鹽酸酸化，減壓除去乙醇，放置冷卻後，用氯仿提取。提取液用蒸餾水洗後，氯仿層蒸乾，殘留物加少量乙醇，再加適量水放置，析出雪膽素C晶體，約280mg。TLC檢測氯仿∶丙酮(1∶1)Rf＝0.57；氯仿∶甲醇(10∶1)Rf＝0.58；丙酮∶甲醇(3∶1)Rf＝0.70。 雪膽素C雪膽素C的結構鑑定白色針晶，C32H50O8；M562；mp 163-170℃。IRνmaxKBr3433，2971，2932，2883，1692，1615，1451，1432，1391，1261，1134cm-1。1H NMR(C5D5N，400MHz)δ1.06，1.20，1.26，1.32，1.36，1.41，1.43，1.56(24H，s，8xCH3)，2.24(3H，s，COCH3)，2.95(1H，d，J＝6.5Hz，17-H)，3.22(1H，d，J＝14.5Hz，12-He)，3.40(1H，d，J＝8.7Hz，3-H)，4.11(1H，m，16-H)，4.64(1H，brs，12-H)，5.67(1H，m，6-H)；13C NMR(CDCl3，100.6MHz)δ，C-1-C-3034.73t，71.05d，81.47d，42.86s，142.46s，118.62d，24.12t，34.41d，48.15s，43.31d，212.93s，48.91s，51.10s，46.23t，70.23d，59.56d，89.46s，207.42s，42.18s，35.98t，71.44s，184.80s，15.52q，19.02q，20.19q，20.42q，22.37q，22.47q，25.47q，29.47q，30.59q.EI-MS m/z(％)544[M-H2O，]+(2)，526[M-2H2O]+(7)，508[M-3H2O]+(7)，486，468(9)，184(46)，166(100)，150(51)，139(47)，126(40)，107(25)，95(17)，79(12)，69(16)，59(51)。 R＝H 雪膽素DR＝Glc 雪膽素E 雪膽素F4、雪膽素D，雪膽素E，雪膽素F，雪膽素C等化合物的體外抑菌試驗4-1材料與方法材料(1)培養基營養肉湯(本室自配)(2)微孔細胞培養板及微量移液器(本室自備)(3)菌種A、大腸桿菌(ATCC8099)；B、傷寒沙門桿菌(ATCC14028)；C、福氏痢疾桿菌(ATCC12022)；D、普通變形桿菌(ATCC14153)；E、黃色葡萄球菌(ATCC6538)。均由北京生物製品所提供。
(4)供試樣品四環三萜葫蘆素類化合物雪膽素C，雪膽素D，雪膽素E，雪膽素F。以黃連素為對照。其原液濃度為50mg/ml。4-2方法(1)樣品配製用適量二甲亞礬(DMS)溶解樣品，用無菌肉湯稀釋，雪膽素C-F原液濃度(mg/ml)分別為33.75、16.25、18.00、21.00、18.33、26.67、70.00。以黃連素為對照。其原液濃度為50mg/ml。
(2)菌液配製將適量各菌接種於肉湯，37℃培養18小時，取出比濁測濃度，稀釋為105個/ml含菌量(3)MIC試驗採用微量稀釋法，用12×8的96孔微孔稀釋板進行。每排12孔，每排的第1~10孔各加入50ml用培養基稀釋成一系列藥液，第11孔加50ml培養基，第10孔加0.1ml培養基作空白對照，第12孔加5％DMS為溶劑對照，然後在第1~9孔加入50ml菌液，使第1~8孔中的藥液濃度倍比遞減(見表1)。操作完成，振蕩混合後，在37℃下培養24小時，取出在黑色背景下觀察結果。無菌生長孔中所含藥液最低的藥物濃度即為該樣品的MIC。
表1四種化合物在各微孔中的濃度(mg/ml)H 原液 1 2 3 45 6 7 8雪膽素 20.0010.055.252.631.31 0.66 0.330.16 0.08C雪膽素 20.0010.005.002.501.25 0.63 0.310.16 0.08D雪膽素 26.6713.346.673.331.62 0.83 0.420.21 0.10E雪膽素 18.339.17 4.582.291.15 0.57 0.290.14 0.07F黃連素 50.0025.0012.506.253.131.56 0.780.39 0.205、結果 八種化合物對五種細菌的MIC(mg/ml)(見表2)表2 八種化合物對五種細菌的MIC(mg/ml)菌種 雪膽素C雪膽素D 雪膽素E 雪膽素F黃連素A ＞10.5 ＞10.00 ＞13.34 ＞9.17 12.50B ＞10.5 ＞10.00 ＞13.34 ＞9.17 25.00C ＞10.5 ＞10.00 ＞13.34 ＞9.17 1.56D ＞10.5 ＞10.00 ＞13.34 ＞9.17 ＞50E1.31 10.00 ＞13.34 ＞9.17 ＞50
從上可以得出本發明與現有技術相比所具有的優益效果在於八種四環三萜類化合物中，雪膽素C、雪膽素D兩種對金黃色葡萄球菌有很好的抗菌活性，MIC均≤10mg/ml，效果與黃連素類似或稍好。金黃色葡萄球菌的耐抗生素菌株日益增多，其中耐青黴素G的菌株比例已達96％~98％。
本發明確定了雪膽素甲、乙的化學結構屬於四環三萜葫蘆素類物質，為葫蘆素F的衍生物，其抗菌活性試驗表明雪膽素(甲素、乙素混合物)對福氏桿菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、豬霍亂沙門氏桿菌等都有不同程度的抗菌活性。在濃度低達0.1mg/ml的情況下，也顯示抗菌作用。以氯黴素作陽性對照，結果表明雪膽素對傷寒桿菌、痢疾桿菌和引起化膿性金色葡萄球菌的抗菌作用相當強，對結核桿菌也有作用。雪膽素的毒性也比較低，小鼠口服10g/kg，無中毒反應；而該藥臨床使用成人劑量肌肉注射為1-2mg/day，口服為15-30mg/day，由此可見該藥安全性極高。只是靜脈注射劑量增大時，對一些動物心臟有一定影響，如麻醉犬靜脈注射劑量為40mg/kg時，血壓、呼吸、心率無明顯改變，豚鼠腹腔注射劑量為40mg/kg時，心電圖無變化；而兔子靜脈注射劑量為20-40mg/kg時，出現傳導阻滯，最後心跳停止。
實施例2麗江雪膽片取麗江雪膽細粉300-500克，加敷料適量，壓製成1000片麗江雪膽片。功能清熱解毒，抗菌消炎。用於急性細菌性痢疾，急性腸胃炎，扁桃腺炎，咽喉炎等；用法與用量飯後服用；每日2-3次，每次0.3-0.5克。
實施例3雪膽素C片取雪膽素C(折百)50克，加敷料適量，壓製成10000片雪膽素C片。功能清熱解毒，抗菌消炎。作用急性細菌性痢疾，急性腸胃炎，扁桃腺炎等；主要用於痢疾桿菌、大腸桿菌、結核桿菌感染。用法與用量飯後服用；每日2-3次，每次5-10毫克。
實施例4雪膽素C注射液取雪膽素C(折百)50克，加敷料適量，配製成10000支雪膽素C注射液。功能清熱解毒，抗菌消炎。作用急性細菌性痢疾，急性腸胃炎，扁桃腺炎等；主要用於痢疾桿菌、大腸桿菌、結核桿菌感染。用法與用量每日2-3次，每次5-10毫克。
實施例5雪膽素D片取雪膽素D(折百)50克，加敷料適量，壓製成10000片雪膽素C片。功能清熱解毒，抗菌消炎。作用急性細菌性痢疾，急性腸胃炎，扁桃腺炎等；主要用於痢疾桿菌、大腸桿菌、結核桿菌感染。用法與用量飯後服用；每日2-3次，每次5-10毫克。
實施例6雪膽素E片取雪膽素F(折百)50克，加敷料適量，壓製成10000片雪膽素C片。功能清熱解毒，抗菌消炎。作用急性細菌性痢疾，急性腸胃炎，扁桃腺炎等；主要用於痢疾桿菌、大腸桿菌、結核桿菌感染。用法與用量飯後服用；每日2-3次，每次5-10毫克。
實施例7雪膽素F片取雪膽素F(折百)50克，加敷料適量，壓製成10000片雪膽素C片。功能清熱解毒，抗菌消炎。作用急性細菌性痢疾，急性腸胃炎，扁桃腺炎等；主要用於痢疾桿菌、大腸桿菌、結核桿菌感染。用法與用量飯後服用；每日2-3次，每次5-10毫克。
實施例8麗江雪膽素片麗江雪膽乙醇提取物，用乙酸乙酯分配，得到總雪膽素類物質含量佔70％以上的粗麗江雪膽素，取100克，加敷料適量，壓製成10000片麗江雪膽素片。功能清熱解毒，抗菌消炎。用於急性細菌性痢疾，急性腸胃炎，扁桃腺炎，咽喉炎等；用法與用量飯後服用；每日2-3次，每次10-20毫克。
權利要求
1.如結構式(I)所示的雪膽素類衍生物， R1＝COCH3，COCH2CH3，CO(CH2)nCH3n＝1-8；Glc，Xyl，ArR2＝COCH3，COCH2CH3，CO(CH2)nCH3n＝1-8R3＝COCH3，COCH2CH3，CO(CH2)nCH3n＝1-8R4＝COCH3，COCH2CH3，CO(CH2)nCH3n＝1-8R5＝COCH3，COCH2CH3，CO(CH2)nCH3n＝1-8
2.權利要求1式(I)化合物的製備方法，其特徵是雪膽素類衍生物不涉及化合物的全合成，是在從植物中分離出雪膽素類化合物的基礎上，就原有的骨架，用常規的酯化反應製備。
3.根據權利要求2所述的雪膽素類衍生物的製備方法，其特徵是取麗江雪膽地下塊莖粉碎後用乙醇回流提取3次，每次4小時，減壓濃縮得浸膏，溶於水後先用石油醚60-90℃萃取，再用乙酸乙酯萃取，最後用水飽和的正丁醇萃取；乙酸乙酯部分進行反覆矽膠柱層析分離，洗脫劑分別用石油醚；氯仿∶丙酮；氯仿∶甲醇；氯仿∶甲醇∶水；純甲醇，正丁醇部分先經D101大孔樹脂柱層析，依次用10％，20％，80％和95％乙醇洗脫，80％乙醇洗脫流分經矽膠柱層析，分別用氯仿∶甲醇；氯仿∶甲醇∶水；甲醇為洗脫劑，從乙酸乙酯萃取部位，從氯仿∶丙酮；氯仿∶甲醇洗脫餾分，得式(I)化合物。
4.抗菌劑，其中含有抗菌有效量的權利要求1化合物和抗菌學上可接受的載體。
5.權利要求1中的化合物在製備抗菌劑中的應用。
全文摘要
本發明的提供一種與現有技術不同的雪膽素衍生物，其製備方法，以該化合物為有效成分的抗菌劑。
文檔編號A61P31/04GK1424320SQ0213416
公開日2003年6月18日 申請日期2002年11月21日 優先權日2002年11月21日
發明者邱明華, 寶福凱, 高娟, 聶瑞麟 申請人:中國科學院昆明植物研究所