一種複方異常黑膽質成熟劑的總酚的提取製備方法
2023-08-05 09:28:06
專利名稱：一種複方異常黑膽質成熟劑的總酚的提取製備方法
技術領域：
本發明涉及總多酚的的提取製備，尤其適應一種複方異常黑膽質成熟劑的總酚的
提取製備方法。
背景技術：
異常黑膽質成熟劑是以破布木果、牛舌草、甘草、鐵線蕨、地錦草等十味藥材按比 例配製，進行煎煮、浸泡、過濾、稀釋而成的維吾爾醫複方製劑，主要用於治療由異常黑膽質 所導致的腫瘤、糖尿病、高血壓、冠心病等疑難雜症，其治療原則是首先使用異常黑膽質成 熟劑使異常黑膽質成熟和堆積到腸黏膜，而後使用異常黑膽質清除劑使已成熟的異常黑膽 質排出體外，從而達到治療目的。此法為維吾爾醫獨有，無法與其它醫學相比。
近年來的研究表明，異常黑膽質成熟劑具有清除活性氧自由基，提高機體抗氧化， 保護淋巴細胞、線粒體及DNA氧化損傷，抗輻射損傷，抗血栓形成，改善機體免疫功能，調節 機體神經-內分泌-免疫網絡功能，抑制人肝癌細胞(H印G2)、人宮頸癌細胞(HeLa)、T淋 巴細胞、乳腺癌細胞(Bc即-37)、人結腸癌細胞(Caco-2)等癌變細胞體外增殖，抑制由1， 2-二甲肼(DMH)誘導的大鼠結腸隱窩病灶的形成，逆轉人肝癌耐藥細胞株多藥耐藥性等功 能。目前，異常黑膽質成熟劑的研究重點在於對異常黑膽質成熟劑有效部位的提取及生物 活性與藥用價值的檢測。 本發明的申請人獲得的複方異常黑膽質成熟劑的處方組成及製備方法的專利，僅 僅對異常黑膽質成熟劑的處方組成、水提物的製備方法及其防治疾病的部分作用機理進行 了闡述，未對異常黑膽質成熟劑進行進一步的提取和分離，更未涉及到從異常黑膽質成熟 劑中提取總酚。 本發明用人早幼粒細胞白血病細胞株(HL-60)體外存活率試驗為導向，對異常黑 膽質成熟劑的體外抗癌活性部位一總酚組分進行了追蹤分離。該製備方法安全可靠，無環 境汙染，製得的異常黑膽質成熟劑總酚體外抗癌活性強，適用於規模化生產，至今未見國內 外任何報導。
發明內容
本發明的目的在於，提供一種複方異常黑膽質成熟劑的抗癌有效部位的提取製備 方法，該方法提取的異常黑膽質成熟劑總酚穩定性良好，可製成片劑、膠囊、口服液、顆粒
齊u、湯齊u、糖漿齊u、丸劑等使用。 按照以下方法，我們實現了本發明的技術解決方案一種複方異常黑膽質成熟劑 的總酚的提取製備方法，取複方異常黑膽質成熟劑的乾粉適量，加1 10倍量30 IO(TC 水，攪拌5 60分鐘使之溶解，趁熱過濾；濾液冷卻至4 25°C ，加入0. 5 6倍量的乙醇， 攪拌10 30分鐘，在4 25t:條件下靜置12 48小時沉澱，過濾。濾液減壓濃縮，加水稀 釋後經聚醯胺柱處置；用3 18柱體積量的水洗脫1 5次，棄去洗脫液。再以0 30% 乙醇洗脫1 5次，棄去洗脫液。然後以30 80%乙醇洗脫1 5次，收集洗脫液。洗脫液減壓回收乙醇，濃縮至無醇味，減壓乾燥成乾粉，得到異常黑膽質成熟劑的總酚產品。
上步的抗癌有效部位的提取製備方法，濾液減壓濃縮至相對密度0. 99 1. 25。
上步的抗癌有效部位的提取製備方法，趁熱過濾所需溫度為30 IO(TC。
上步的抗癌有效部位的提取製備方法，選擇的聚醯胺粒度為40 150目。
上步的抗癌有效部位的提取製備方法，濃縮時採用減壓濃縮，乾燥時採用真空幹 燥或冷凍乾燥或噴霧乾燥。 所述的有效部位，成品可製成片劑、膠囊、口服液、顆粒劑、湯劑、糖漿劑和丸劑等。
本發明所得總酚提取物中總酚含量採用Folin-Ciocalteu法測定，以沒食子酸為 對照，其總酚含量30%以上。 本發明所得總酚提取物中總黃酮含量採用2005版中國藥典法測定，以蘆丁為對 照，其總黃酮含量13%以上。 本發明所得總酚提取物採用人早幼粒細胞白血病細胞株(HL-60)體外存活率試 驗，評價了體外抗癌活性，結果表明所得總酚提取物明顯降低癌細胞存活率，其24小時、48 小時和72小時IC5。值分別為105. 7 ii g/ml，95. 1 y g/ml和72. 3 y g/ml。
我們還採用二極體陣列高效液相色譜技術從本發明所得總酚提取物中鑑定出 8種酚類化合物，即咖啡酸(caffeic acid)、蘆丁 (rutin)、異槲皮苷(isoquercitrin)、 異鼠李素-3-0-芸香糖苷(isorhamnetin 3-0-rutinoside)、芹菜素7-0-葡萄糖苷 (即igenin7-0-glucoside)、迷迭香酸(rosmarinic acid)、木犀草素(luteolin)禾口芒柄花 素(formononetin)。 本發明取材於民族藥，原料特質，選擇最佳的提取方法，首次用癌細胞存活率為導 向實現了對一種複方異常黑膽質成熟劑總酚的成功提取與製備，既拓展了醫藥研製和醫用 範圍，又為維藥增添新產品，提取製備方法簡便實用，成本低，應用範圍廣，所得總酚提取物 對癌細胞具有明顯的抑制作用，彰顯技術進步。
實驗例 複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物中總酚和總黃酮含量的測定
1.試驗材料 1)試劑沒食子酸，純度^ 98%，德國Carl Roth公司生產，批號48792593。 Folin-Ciocalteu試劑，德國Merck集團生產，批號HC807325。戸丁，純度99. 5%，德國 Merck集團生產，批號148423。其它試劑均為分析純。 2)儀器Beckman DU-640紫外分光光度計，美國Beckman公司。Sartorius BP210D 精密電子天平，德國Sartorius集團。 3)被測藥物複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物，按本發明方法製備。
2.實驗方法
1)總酚含量的測定 精確稱取複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物乾粉三份，每份約3mg，分別置於5mL 容量瓶中，用60%乙醇溶解，定容，為樣品待測液。取160iU樣品待測液於5mL容量瓶中， 加入蒸餾水至2. 5ml，再加入0. 25ml Folin-Ciocalteu試劑，6分鐘後加入0. 75ml 20% Na2C03溶液，用水定容至刻度，混勻，室溫下反應2小時，採用可見分光光度法，以沒食子酸 為對照品，在765nm處測定吸光值，代入回歸方程得到總酚含量。
總酚含量(％ )=(酚類化合物質量/乾物料質量)X 100%
2)總黃酮含量的測定 精密稱取複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物三份，每份約3mg，分別置於5mL容量 瓶中，加入lml 60%乙醇溶解，加去離子水2ml和5%亞硝酸鈉水溶液0. 15ml，搖勻。6分 鍾後加10%硝酸鋁水溶液0. 15ml，搖勻後在室溫下靜置6分鐘。加1M氫氧化鈉溶液lml， 立即用去離子水定容至5ml，採用可見分光光度法，以蘆丁為對照品，以不含硝酸鋁的樣品 溶液作空白，在510nm波長處測定供試品溶液的吸光度，代入回歸方程得到總酚含量。 [OOSO] 總黃酮含量(％ )=(黃酮類類化合物質量/乾物料質量)X 100%
3.實驗結果 表1複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物中總酚含量和總黃酮含量
樣品中總 樣品中總
平均含量 RSD 平均含量 RSD
樣品號 酚含量 黃酮含量
(%) (%) (%) (%)
(%) (%)
1 33.5 13.2
2 33.9 33.3 2.214.5 13.9 4.8
3 32.4 13.9 實驗結果表明，複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物中總酚含量和總黃酮含量分別 為33. 3%和13. 9%。 複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物薄層色譜分析
1.實驗材料 1)試劑蘆丁購自德國Carl Roth，矽膠60F254薄層板(鋁板)購自德國Merck集 團。其它試劑均為分析純。 2)被測藥物複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物，按本發明方法製備。
2.實驗方法 將所得複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物溶解於60%乙醇，點樣於矽膠60F254薄
層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(ioo : ii : ii : 26， v/v/v/v)為展開劑展開。
同時點蘆丁標準品溶液於同一薄層板上，乾燥後先噴以1%二苯基硼酸-2-氨基乙基酯甲 醇溶液，再噴以5%聚乙二醇4000乙醇溶液。在波長366nm的紫外光下觀察斑點。
3.實驗結果 結果表明，複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物含黃酮類化合物(黃色或黃綠色斑 點)。樣品與蘆丁在同一位置顯相同顏色(黃色)斑點，提示，複方異常黑膽質成熟劑總酚 提取物含蘆丁。 複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物高效液相色譜分析
1.實驗材料 1)試劑木犀草素、迷迭香酸、芹菜素7-0-葡萄糖苷和異鼠李素-3-0-芸香糖苷 購自法國Extrasynth6se，咖啡酸購自美國Sigma-Aldrich，芒柄花素、戸丁和異槲皮苷購自德國Carl Roth。色譜純乙腈購自比利時VWR International,冰醋酸(純度>99. 8%) 和二甲基亞碸購自德國Carl Roth。其它試劑均為分析純。 2)儀器日本島津LC-10AD液相色譜儀，SCL-10A系統操作器，SPD-M20A 二極體 陣列檢測器，SIL-10AD自動進樣器，DGU-14A脫氣機。色譜工作站為Shimadzu Class VP software。
3)被測藥物複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物，按本發明方法製備。
2.實驗方法 1)液相色譜條件色譜柱為Hypersil BDS-C18柱(4. OmmX 250mrn， 5 ii m)，美國 安捷倫；保護柱為LiChosphe/ 100RP-18(4.0mmX4.0mm，5iim)，德國惠普。檢測波長為 254nm，並在190 450nrn範圍內對樣品進行紫外波長掃描。流動相由A(水-冰醋酸， pH2. 8)和B(乙腈-冰醋酸，其中冰醋酸量與A相等)組成。樣品梯度洗脫條件0 60min， 流動相B由15%線性遞增至50% ;60 70min，流動相B由50%線性遞增至99% ;70 75min，流動相B保持99% ;75 76min，流動相B由99%線性遞減至15%。流速1. 2ml/ min，柱壓140 172巴。柱溫室溫，進樣量10iU。高效液相色譜分析前，流動相始終新 鮮配製，且用前脫氣。 2)樣品處理2mg複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物加入60%甲醇-二甲基亞碸 (4 : 1，v/v)lml，在室溫下超聲使溶解(5min)，超速離心IO分鐘(14800rpm)，上清液進樣。
3.實驗結果 複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物及標準品混合物的高效液相色譜圖見圖 1。通過比較標準品、樣品和加入標準品的樣品中所測成分的保留時間及紫外光譜圖，在 異常黑膽質成熟劑總酚提取物中鑑定出八種酚類化合物，即木犀草素(luteolin)、迷迭 香酸(rosmarinicacid)、藎菜素-7-0-葡萄糖苷(即igenin 7-0-glucoside)、異鼠李 素-3-0-芸香糖苷(isorhamnetin 3-0-rutinoside)、咖啡酸(caffeic acid)、芒柄花素 (formononetin)、戸丁 (rutin)禾口異搬皮苷(isoquercitrin)。
複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物對HL-60癌細胞存活率的抑制作用
1.實驗材料 1)癌細胞及培養液HL-60細胞購自American Type Culture Collection-ATCC(Manassas, VA) 。 RPMI 1640培養液及其附加成分購自美國Life Technologies, Inc公司。 2)儀器Vi-CELLTMXR細胞存活率分析儀，美國Beckman公司。 3)被測藥物複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物，按本發明方法製備。 2.實驗方法 於37°C 、5% C02培養箱中，以含10%小牛血清、1 % L_穀氨醯胺和1 %青黴素_鏈 黴素的RPMI 1640培養液培養HL-60細胞，檢測時將其按0. 1 X 106個/毫升的濃度接種 於12孔培養板中，24小時後將複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物60%乙醇溶液(用前用 0. 45 ii m的微孔濾膜過濾)以25、50、100、200和250 y g/ml的五種不同終濃度分別加入上 述HL-60細胞培養液中，同時設不加樣品只加相同體積60%乙醇的細胞培養液為對照組。 每種樣品測三次後取平均值和SD值，經不同濃度樣品處理的細胞分別於24、48、72h用臺盼 藍染色法檢測細胞存活率。
3.實驗結果 表2複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物不同濃度對HL-60癌細胞生長的抑制作用
濃度24 (Pg/ml)小時後細胞存活率； (%)3 48小時後細胞存活率" (%)72小時後細胞存活率" (%)
0100. 00±8. 50100. 00±8.84100. 00土22.26
2590. 51±10. 1764. 16±10.9092. 07±2. 03
5084. 31±3.9564. 60±5. 1071.21±2. 84
10064. 23±1.2632. 01±5. 8928.18±1. 57
20044. 16±4. 1511.06±3. 075. 19±1.61
25039. 05±1. 268.41±1.603. 29±1.45 a檢測進行三次，測定結果以"平均值±標準差"表示。 結果，複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物顯著降低HL-60癌細胞體外存活率。經 計算，其24小時ICs。為105. 7ii g/ml，其95X可信區間下限和上限分別為71.4和156. 5ii g/ ml，48小時IC5。為95. 1 P g/ml，其95%可信區間下限和上限分別為75. 2和120. g/ml， 72小時IC5。為72. 3 ii g/ml，其95%可信區間下限和上限分別為68. 5和76. 4 y g/ml (表3)。 複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物抑制HL-60細胞增殖作用的量效曲線見圖2。
圖1複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物及標準品混合物的高效液相色譜圖。A : 標準品混合物；B :複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物。1 :咖啡酸(caffeic acid) ;2 :蘆 丁 (rutin) ;3:異槲皮苷(isoquercitrin) ;4 :異鼠李素-3-0-芸香糖苷(isorhamnetin 3-0-rutinoside) ;5 :片菜素-7-0-葡萄糖苷(即igenin 7-0-glucoside) ;6:迷迭香酸 (rosmarinic acid) ;7 :木犀草素(luteolin) ;8 :芒柄花素(formononetin)。
圖2複方異常黑膽質成熟劑總酚提取物抑制HL-60細胞增殖作用的量效曲線。每 種樣品測三次後取平均值和SD值，經不同濃度樣品處理的細胞分別於24、48、72h用臺盼藍 染色法檢測細胞存活率。縱坐標為細胞存活率，橫坐標為藥物終濃度(g)的對數值。實驗 數據採用Gr即hPad software Prism軟體計算半數抑制濃度(IC5。值)為105. 7 y g/ml (24 h) 、95. 1 ii g/mL(48h)和72. 3 ii g/mL(72h)。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明，下述各實施例僅用於說明本發明而並非
對本發明的限制。 實施例一 取複方異常黑膽質成熟劑的乾粉350g，加1050ml 6(TC水，攪拌IO分鐘溶解，趁熱過濾。濾液冷卻至l(TC，加入1. 5倍量的無水乙醇，攪拌15分鐘，在4t:條件下靜置24小 時沉澱，過濾。濾液減壓濃縮，加水稀釋後經聚醯胺柱處置；用3柱體積量的水洗脫2次，棄 去洗脫液，再以60%乙醇洗脫3次，收集洗脫液。洗脫液減壓回收乙醇，濃縮至無醇味，減壓 乾燥成乾粉，得到異常黑膽質成熟劑的總酚產品。成品總酚和總黃酮含量分別為33. 3%和 13. 9%。 實施例二 取複方異常黑膽質成熟劑的乾粉350g，加1050ml 6(TC水，攪拌IO分鐘溶解，趁熱 過濾。濾液冷卻至l(TC，加入1. 5倍量的無水乙醇，攪拌15分鐘，在4t:條件下靜置24小 時沉澱，過濾。濾液減壓濃縮，加水稀釋後經聚醯胺柱處置；用3柱體積量的水洗脫2次，棄 去洗脫液，再以40%乙醇洗脫3次，收集洗脫液。洗脫液減壓回收乙醇，濃縮至無醇味，減壓 乾燥成乾粉，得到異常黑膽質成熟劑的總酚產品。成品總酚和總黃酮含量分別為39. 1%和 16. 8%。 實施例三 取複方異常黑膽質成熟劑的乾粉350g，加1050ml 6(TC水，攪拌IO分鐘溶解，趁熱 過濾。濾液冷卻至l(TC，加入1. 5倍量的無水乙醇，攪拌10分鐘，在4t:條件下靜置24小 時沉澱，過濾。濾液減壓濃縮，加水稀釋後經聚醯胺柱處置；用3柱體積量的水洗脫2次，棄 去洗脫液，以20%乙醇洗脫3次，棄去洗脫液。以60%乙醇洗脫3次，收集洗脫液，洗脫液 減壓回收乙醇，濃縮至無醇味，減壓乾燥成乾粉，得到異常黑膽質成熟劑的總酚產品。成品 總酚和總黃酮含量分別為34. 5%和14. 2% 。
權利要求
一種複方異常黑膽質成熟劑的總酚的提取製備方法，其特徵在於一種複方異常黑膽質成熟劑的總酚的提取製備方法，取異常黑膽質成熟劑的乾粉適量，加1～10倍量30～100℃水，攪拌5～60分鐘溶解，趁熱過濾；濾液冷卻至4～25℃，加入0.5～6倍量的乙醇，攪拌10～30分鐘，在4～25℃條件下靜置12～48小時沉澱，過濾。濾液減壓濃縮，加水稀釋後經聚醯胺柱處置；用3～18柱體積量的水洗脫1～5次，棄去洗脫液。再以0～30％乙醇洗脫1～5次，棄去洗脫液。然後以30～80％乙醇洗脫1～5次，收集洗脫液。洗脫液減壓回收乙醇，濃縮至無醇味，減壓乾燥成乾粉，得到異常黑膽質成熟劑的總酚產品。
2. 根據權利要求l所述的提取製備方法，其特徵在於，濾液減壓濃縮至相對密度 0. 99 1. 25。
3. 根據權利要求1所述的提取製備方法，其特徵在於，趁熱過濾所需溫度為30 IO(TC。
4. 根據權利要求1所述的提取製備方法，其特徵在於，所選聚醯胺粒度為40 150目。
5. 根據權利要求1所述的複方異常黑膽質成熟劑的總酚的提取製備方法，其特徵在 於，濃縮時採用減壓濃縮，乾燥時採用真空乾燥或冷凍乾燥或噴霧乾燥。
6. 根據權利要求1的複方異常黑膽質成熟劑的總酚提取物，其特徵在於，成品可製成 片劑、膠囊、口服液、顆粒劑、湯劑、糖漿劑、丸劑等使用。
7. 根據權利要求l的複方異常黑膽質成熟劑的總酚提取物，其特徵在於，其中的總酚 含量大於30%，其中的總黃酮含量大於13%。
8. 根據權利要求1的複方異常黑膽質成熟劑的總酚提取物明顯降低HL-60癌細胞存活率。
全文摘要
本發明提供一種複方異常黑膽質成熟劑的總酚的提取製備方法，其中異常黑膽質成熟劑由破布木果、牛舌草、甘草、鐵線蕨、地錦草等十味藥材按比例配製，進行煎煮、浸泡、過濾、減壓濃縮乾燥成浸膏固體，並粉碎得乾粉；此乾粉加熱水溶解，過濾，濾液加乙醇沉澱，攪拌，靜置，過濾，所得濾液減壓濃縮，經聚醯胺柱處置，先後以水和稀乙醇洗脫，洗脫液棄去，用較高濃度乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，乾燥，粉碎，得到體外抗癌活性較強的總酚產品，其總酚含量30％以上，總黃酮含量13％以上。本發明提取製備方法成本低，簡便實用，安全，製得的總酚穩定性良好，可製成片劑、膠囊、口服液、顆粒劑、湯劑、糖漿劑、丸劑等使用。
文檔編號A61K36/185GK101757128SQ20091011335
公開日2010年6月30日 申請日期2009年6月5日 優先權日2009年6月5日
發明者哈木拉提·吾甫爾, 木拉提·克扎衣別克, 阿不都熱依木·玉蘇甫 申請人:新疆醫科大學