用於定量測定體液中腫瘤細胞的方法和適於此方法的試驗試劑盒的製作方法
2023-10-26 02:42:57 7
專利名稱：用於定量測定體液中腫瘤細胞的方法和適於此方法的試驗試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於定量測定體液中腫瘤細胞的方法，在這種方法中，首先用待測樣品進行反應，在這一反應中端粒酶的RNA組分被特異地擴增，隨後定量測定被擴增的核酸的量；本發明還涉及適於此方法的試驗試劑盒。
實際上，所有實體惡性腫瘤都有形成轉移的潛在趨勢。這種轉移過程包括惡性細胞的微轉移擴散(它通常通過血液或淋巴到達遠處的器官)以及自身次級腫瘤的發展。轉移的程度決定了癌形成的徵兆。
腫瘤預防及治療方案需要早期診斷原發性腫瘤、復發或轉移，甚至在轉移前使得在臨床上是明顯的。這一目的還不能滿足可利用的儀器技術的需要；特別是，在器官中循環腫瘤細胞和轉移初始信息之間有一條診斷灰帶。循環惡性腫瘤細胞(例如正在經受腫瘤治療的病人外周血液中的)的早期診斷，使得使用免疫療法及多化學療法成為可能，這在早期可能是有療效的，也就是說即使在器官轉移之前也是明顯的。在治療前和治療後，外周血中的轉移的定量分析提供了對這種症狀的重要的對照。
例如，GB2260811提出了一種檢測惡性腫瘤的診斷方法，這種惡性腫瘤與特定身體組織的正常細胞相關聯，這種組織的正常細胞形成至少一種對這一組織特異性的基因產物。在這種檢測方法中，健康人的體液(例如血液)通常不產生這種細胞，從病人取得血液，擴增和檢測所說特定基因產物的mRNA。提到的一個例子是在外周血液中檢測黑素瘤細胞的酪氨酸酶。然而，這種方法的不利處在於，它與組織特異性基因產物相聯繫，使得不能定量測定黑素瘤細胞，進而給出假陽性結果。
Kim等描述了一種測定的結果，運用該結果在腫瘤組織中確定端粒酶活性是可能的[Kim等(1994)，科學2662011]。這種端粒酶活性以約1個無限增殖細胞/104個正常細胞的敏感性在98％的癌細胞培養物和90/101的惡性腫瘤中以及在胚組織中檢測到，但是，在22個正常體細胞培養物中卻沒能檢測到。
端粒酶是最新報導的具有反轉錄酶活性的核糖核蛋白[Shippen-Lentz等(1990)，科學247546]，這種蛋白以整合的RNA序列作為模板來獨立地進行DNA合成[Greider等(1989)，自然337331]，由此在染色體末端合成新的端粒DNA。端粒由高度保守的(TTAGGG)n(長度約為5-15千個鹼基(kb)/細胞基因組的串聯序列)組成，端粒具有在核膜上穩定染色體和保護編碼基因組DNA不受到無限制地重組和降解的任務[Mehle等(1994)，癌研究54236[。而低等真核生物要求在縮短染色體末端與通過端粒酶從頭合成端粒序列之間保持動力學平衡，而正常的人類體細胞表現出低的或不能被檢測的端粒酶活性。另外，與其它DNA酶相比，端粒酶沒有生長調節功能，因為沒有有效的增殖細胞培養物顯示出可檢測的端粒酶活性。只有胚細胞和幾乎所有腫瘤細胞系[Ohyashiki等(1994)，Cancer Genet Cytogenet 7864；Rogalla等(1994)Cancer Genet Cytogenet 7719；Schwartz等(1995)，癌751094]和癌組織(肺，[Hiyama等(1995)癌基因10937；Shirotani等(1994)，肺癌1129]；腎[Mehle等(1994)，癌研究54236]；卵巢[Chadeneau等(1995)，癌研究552533]和血液[Counter等(1995)，血液852315]顯示出可測量的端粒酶活性和恆定的端粒長度，並且經過無窮多次細胞分裂後仍保持不變。此外，端粒酶的激活與端粒長度的穩定性相關，因此它在體細胞無限增殖化的方向上被認為是關鍵性步驟。
Feng等能夠克隆出人類端粒酶(hTR)整合RNA序列，這段序列編碼在染色體3的遠側區段(q)上。通過競爭性的聚合酶鏈反應(PCR)，作者能夠證實，與正常體細胞相比，在腫瘤組織和胚組織中，端粒酶的表達有很大的提高。[Feng等(1995)，科學2691236]。hTR序列的反義構建體在轉染的Hela細胞中導致細胞死亡(編程性細胞死亡)。這些數據證實了在體組織中端粒酶的應急表達，以及惡性生長依靠無限增殖細胞的存在和端粒酶的激活這一事實。
因而，本發明的目的是開發一種使定量測定體液中的腫瘤細胞成為可能的方法。
因此，本發明涉及定量測定體液中腫瘤細胞的方法，其中第一步反應是用待測樣品進行的，在這一步反應中，端粒酶的RNA組分被特異地擴增，隨後，定量測定被擴增的核酸的量；本發明還涉及適用於此方法的試劑盒。對本發明的目的而言，體液指例如，血液，尿或者糞便，溢泌物及體腔溢出物，特別是外周血。
例如，外周血通過刺穿動脈、靜脈或指墊從受治療者取得，它被轉移到RNA降解緩衝液中，這種緩衝液包括如尿素或更優選的異硫氰酸胍(為了變性各種現存的RNA酶和從細胞中釋放出的核酸)[參見，例如，Chomczynski等(1987)，分析生物化學162，156]，這種核酸能從RNA降解緩衝液的強鹽介質中分離出來，例如通過二氧化矽顆粒，所有的核酸都能夠結合於其上[Boom等(1990)，J.Clin Microbiol.29，495]。因此，用合適的緩衝液多次洗滌這些二氧化矽顆粒，結合核酸就被洗脫下來。所以，在合適的緩衝液中，用無RNA酶的DNA酶水解各種存在於樣品中的基因組DNA是有利的，以致於沒有假陽性結果或由於過量的背景噪音而出現的不真實的擴增信號，因為在後面端粒酶的RNA組分的擴增中，DNA可能仍然存在。一般情況下，隨後是DNA酶的失活，例如，通過苯酚抽提和/或熱變性。在用DNA酶處理樣品前，或者優選地在處理後，進一步純化存在於樣品中的RNA(例如，通過層析法(如離子交換層析)，優選地是在矽膠上的層析)是可能和有利的。
為了檢查可能干擾的DNA是否仍存在於樣品中，利用下文描述的端粒酶特異性寡核苷酸引物進行擴增反應是可能的，在這種情況下，樣品中現存的RNA不能通過事先的反轉錄反應轉錄成cDNA。只有在樣品中無端粒酶特異性DNA的情況下確實沒有擴增發生，其結果是沒有擴增的DNA可以測量到。
接著樣品中現存的RNA轉錄成cDNA，一般利用反轉錄反應，例如，用AMV反轉錄酶。這種方法一般是已知的並且在，例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，紐約·冷泉港出版社，1989中有描述。在一種反轉錄的優選的實施方案中，使用一種在WO 90/07641描述的熱穩定的依賴於RNA的DNA聚合酶是可能的。適合於反轉錄酶的多核苷酸引物是例如下文描述的有用的多核苷酸引物以及具有特定長度的隨機引物。
例如，可以利用如DNA聚合酶通過聚合酶鏈反應(PCR)進行隨後的擴增[參見，例如，美國專利4,683,195；4,683,202；4,965,188]或者，優選地，利用RNA聚合酶，如通過等溫的基於核酸序列的擴增(NASBA)來進行。特異多核苷酸引物來源於待擴增的核酸，這種引物是每種情況下的擴增所需的。在本發明中使用各種用於合成寡核苷酸引物的端粒酶RNA組分的序列片段都是可能的，這種寡核苷酸引物優選的長度約20到約30個核苷酸，更優選地，約20到25個核苷酸。一般地，擴增產物長約100到約2000個鹼基，更優選地，長約200到約1500個鹼基，特別是長約300到350個鹼基。對所述的新方法而言，下面的寡核苷酸引物(來源於
圖1的序列)是特別優選的5′GACTCGGCTC ACACATGCAG TTCGC 3′(TM1)，和/或5′CTGGTCGAGA TCTACCTTGG GAGAAGC 3′(TM2)。
其中TM1和/或TM2(合適時)還可以包含RNA聚合酶的啟動子序列。寡核苷酸引物TM1相應於5′引物，TM2相應於3′引物。擴增產物長為327bp。這種引物可用例如三酯法合成製備[Matteucci等(1981)，美國化學會雜誌103,3185-3191]。能被使用的DNA聚合酶是例如，象T4DNA聚合酶、TTDNA聚合酶、大腸桿菌聚合酶I及大腸桿菌Klenow片段這類非熱穩定DNA聚合酶和諸如Taq聚合酶之類的熱穩定聚合酶(參見，例如，美國專利4,889,818)。
PCR的一般原理包括，在幾個重複的反應循環中，熱變性DNA和在合適的具有相反取向的寡核苷酸引物存在下使用DNA聚合酶使單鏈恢復成雙鏈。然後重複這種循環，直到形成用於下文描述的一種定量方法的足夠的DNA為止。一般來說，大約20到約40個循環，優選地約30到約35個循環就足夠了。
在NASBA方法(也叫3SR系統)中，至少使用一個寡核苷酸引物，優選地是TM2；其包含RNA聚合酶啟動子，優選地，T7RNA聚合酶的引物[參見，例如，Guatelli等(1990)，美國國家科學院院報，87,1874-1878或者Kievits等(1991)，J.Virol，Methods，35,273-286]。首先，如前文已經詳細描述過的，藉助於一個前文描述過的寡核苷酸引物和一種反轉錄酶(優選地是AMV反轉錄酶)，將RNA反轉錄成cDNA。反應產物為一條RNADNA雙鏈，然後用RNA酶(優選地，RNA酶H)降解其RNA組分，得到一條DNA單鏈。使用了一個前文描述的寡聚核苷酸引物，用DNA聚合酶將這條DNA單鏈補成DNA雙鏈。AMV反轉錄酶又一次成為合適的優選的DNA聚合酶，因為這種轉錄酶不僅有依賴於RNA的DNA聚合酶活性，而且還有依賴於DNA的DNA聚合酶活性。反應產物是包括如T7RNA聚合酶啟動子的DNA雙鏈。然後這種RNA聚合酶又一次合成一條「反義」RNA鏈，這樣，循環可以重新開始。一般地，大約20到40個循環(優選地約30到約35個循環)就足夠提供充足的用於接下來的定量的擴增產物(優選地是「反義」RNA)。
例如，在瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠中，通過用溴化乙錠染色，可以直接檢測和確定這些擴增產物的量。然而在擴增期間，對於已經標記的擴增產物來說是有利的，因為這獲得了更高的敏感性。合適的標記的例子有放射性標記、生物素標記、螢光的及電化學發光標記。一般說來，這些標記物被用作由DNA或者RNA聚合酶擴增的起始物質的核苷酸攜帶。放射性標記的擴增產物(例如PCR或NASBA產物)能夠通過測量放射性檢測，生物素標記的擴增產物能夠通過攜帶親和素或鏈黴親和素的染料檢測，螢光標記的擴增產物能夠通過螢光計檢測，而電化學發光標記的擴增產物能夠通過ECL檢測器檢測。然而，最優選的檢測方法是在體外與互補於擴增產物的事先標記的寡核苷酸進行雜交。寡核苷酸一般攜帶前文所述的標記，並且與NASBA擴增方法有關，雜交探針攜帶有電化學發光標記，優選地是，tris〔2，2-二吡啶〕釕[II]複合標記〔參見，例如，Van Gemen等(1994)，J.Virol.Methods，49,157-168〕。
一個或多個已知的核酸(標準核酸)的限定量的共擴增能夠有利地實現擴增產物既精確又靈敏的定量[參見，例如，van Gemen等(1993)，病毒學方法雜誌，43,177-188]。在這種情況下，向未知量的待測樣品中以例如稀釋系列形式加入不同但確切已知量的共擴增標準核酸，在獨立的混合物中定量測定樣品擴增產物和一個或多個共擴增標準核酸。測量結果的比較能夠揭示出樣品中被測定的端粒酶RNA組分的量。
當待測樣品和擴增產物也有本質上相同的長度時，用同樣的寡核苷酸引物擴增共擴增的標準核酸是有利的。特別優選地是共擴增核酸具有與待測樣品的擴增產物相同的序列(除在寡核苷酸引物結合位點之間的大約20個核酸外)其具有任意的但卻是已知的序列。因此，在共擴增的擴增產物樣品中，獨立地定量待測擴增產物是可能的，例如通過詳細描述的使用合適的互補標記寡核苷酸進行雜交，如Sambrook等(上述)。
如果多個(優選地為3個)不同共擴增核酸以不同濃度加到樣品中，那將是特別有利的，因為這使減少個體擴增反應(本可能發生)的數目成為可能[參見Van Gemen等(1994)，病毒學方法雜誌49,157-168]。把共擴增核酸加到前文所述的RNA降解緩衝液也是特別優選的，因為在隨後的樣品的病情檢查中，排除可能的核酸損耗是可能的。
本發明中，合適而有利的共擴增標準核酸是來自從構建體體外轉錄的RNA單鏈序列，例如利用Sp6或T7 RNA聚合酶，所說的構建體包含待測樣品的DNA或cDNA並且在任何情況下都提供約10到約30個(優選地，20個)核苷酸的序列的隨機交換。
構建體優選地由一個轉錄載體組成，這個轉錄載體在「多克隆位點」之間有供Sp6或T7 RNA聚合酶的結合位點，在「多克隆位點」上，擴增樣品的DNA或cDNA被克隆。克隆序列能被限制性內切酶的選擇性水解打開，優選地是被兩種不同的限制性內切酶打開；並且，限定長度的片段能被切除或被等長的片段置換(例如，使用T4連接酶)。克隆片段可以包括各種長度序列的置換，例如從大約10到約30個，更優選地約20個核酸；這些克隆片段優選地定位在寡核苷酸引物結合位點。為了在同一位點插入另外的核酸序列可以重複這一步驟。如果沒有找到合適的切割位點，如因為也切割了載體，那麼產生人工切割位點是必要的。這一點能夠發生，例如通過本質上如Higuchi等描述的[Higuchi，R(1988)。核酸研究167351-7367；Higuchi，R.(1990).M.Innis A等eds.聖地牙哥，紐約，柏林，波士頓，倫敦，雪梨，東京，多倫多，Academic Press，Inc.177-183]和在本發明的實驗部分描述的重組PCR。
為了本發明的目的優先使用的序列是構建體的體外轉錄的RNA單鏈序列，所述構建體a)包含人類端粒酶RNA組分的全部cDNA和b)其中已引入了約20個核苷酸的序列的隨機交換。
這些構建體來源於圖5a和5b顯示的構建體pGEM-hTR和圖6a和6b顯示的構建體pGEM-hTR(Ka)。
通過具有Sp6 RNA聚合酶的構建體的體外轉錄來製備標準的RNA核酸是可能的，這些標準RNA核酸各自長為975個鹼基對，並且有序列hTRKa(示於圖7)hTRKb(示於圖8)、htRKc(示於圖9)。
標準核酸在隨機序列上不同於野生型RNA，本例中的隨機序列被定位在位置591-610(見圖5a)，它的長度為20鹼基對。
因為在這個例子中僅僅在長為20個鹼基對的隨機和已知序列上標準核酸相互不同和與野生型序列不同，所以可以通過在四種分離的混合物中標記的寡核苷酸的互補結合檢測標準核酸和野生型序列的擴增產物。通過本發明，特別適合端粒酶RNA組分(wt)和標準核酸(hTRKa)、(hTRKb)及(hTRKc)的擴增cDNA的特異性檢測的寡核苷酸具有以下的序列(這些序列來源於圖7-9顯示的序列)5′CGACTTTGGA GGTGCCTTCA 3′O(Wt)5′AAGTCGGATC CACTTAGGTC 3′O(Ka)5′CGCTCGATTT GGCGAGGGA 3′O(Kb)5′GAGAGTATAG CGATTGGACG 3′O(Kc)相應的反向互補序列被用於檢測擴增的「反義」RNA。
在這之後，測定野生型和標準核酸的各自擴增的量。通過比較標準核酸(起始數量是已知的)的不同擴增數量來計算野生型序列的未知起始數量(例如hTRKa102，hTRKb104和hTRKc106分子)。於是，從這推斷出移去的體液的轉移的數量是可能的。
正如所述方法和待測樣品的內部陽性對照一樣，額外地擴增和檢測核酸(一般總在體液中產生)是可能的。合適核酸的例子是編碼β-珠蛋白或甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH)的mRNA(參見，例如，GB2260811)，它們總在體液細胞中出現。例如，對於人類β-珠蛋白mRNA，合適的寡核苷酸具有序列5′ACCCAGAGGT TCTTTGA GTC 3′和5′TCTGATAGGC AGCCTGCACT 3′，其中寡核苷酸引物在合適時還可以包含RNA聚合酶的啟動子序列。
為了避免或減少假陽性結果或所謂的背景噪音(這些背景噪音由可能在非腫瘤細胞中存在的端粒酶活性引起)，因而，在新測定之前純化取得的體液是有益的。具體地說，意圖是在待測樣品中排除幹細胞和/或激活的免疫細胞，以及濃縮腫瘤細胞。因為一般說來，個體細胞有特異性表面標記，所以通過免疫吸附進行細胞的排除和濃縮是特別有用的。合適方法的例子是磁體(MACS)或螢光激活細胞分選(FACS)[參見，例如，Gottlinger和Radbruch(1993)mta.8,530-536，No.5].因而，例如，造血幹細胞能夠通過它們的CD34表面標記利用MACS方法從血樣中除去[Kato和Radruch(1993)細胞計量術，14,384-392]。例如，B細胞能夠通過它們的CD10，CD19和/或CD20表面標記除去；T細胞能夠通過CD45RA和/或CD7表面標記除去。腫瘤細胞能夠通過它們的特異性腫瘤標記(例如CEA)濃縮。除了MACS和FACS之外，對於恰當細胞的排除或濃縮，也特別合適的是抗特異表面標記的抗體，其是特別地結合到市售的磁珠(例如動珠450，Dynal公司)上的。
因為為了腫瘤細胞測定目的，與100％的動脈血樣中細胞相比，測定僅約20％的靜脈血樣中的所有細胞是可能的，所以單獨或組合前文所述的純化方法以比較靜脈血與動脈血的端粒酶RNA組分的量也是特別有益的[Koop，S.等(1995)，癌研究55，2520-2523]。它同樣地適用於比較指墊的血與靜脈或動脈的血。
樣品中端粒酶RNA組分的定量測定使測定惡性腫瘤的腫瘤細胞(尤其是轉移，特別是微轉移的)是否在體液中存在和在數量上有多大成為可能。這對早期臨床診斷惡性腫瘤轉移的形成和監測腫瘤治療具有特別重要的用途。能用本發明檢測的腫瘤細胞特別是來自轉移(優選的是微轉移)的腫瘤細胞及來自惡性腫瘤的腫瘤細胞，尤其是來自例如T-細胞淋巴母細胞、T-細胞白血病細胞、慢性骨髓白血病細胞、急性淋巴白血病細胞和慢性淋巴白血病細胞轉移腫瘤和/或癌，畸胎癌，黑素瘤，肺瘤，大腸癌，胸癌，肝細胞癌，腎腫瘤，腎上腺腫瘤，前列腺癌，成神經細胞瘤，腦腫瘤，肺小細胞瘤，彈狀肌瘤，平滑肌肉瘤和/或淋巴瘤的細胞。
本發明進一步涉及具有以下序列的寡核苷酸引物5′GACTCGGCTC ACACATGCAG TTCGC 3′(TM1)，5′CTGGTCGAGA TCTACCTTGG GAGAAGC 3′(TM2)，5′ATAAGAATGC GGCCGCGGGT TGCGGAG GGTGGGCCTGGGA GGG3′(TMK1)5′CCCAAGCTTG TGGGGGTTAT ATCCTA 3′(TMK2)5′CGCGGATCCA CTTAGGTCAT CGATCTGCCAATTTGCAGCA CACT 3′(TMK3)和/或5′CGCGGATCCGAC TTGGTACC ATGAATGGGCAGTGAGCCGG3′(TMK4)其中TM1和/或TM2在合適時還包含RNA聚合酶的啟動子序列；本發明還涉及具有下列序列的寡核苷酸5′CCATCGATTC CCGTCGCCAA ATCGAGCGGG TACCCC3′(Kb)3′ GGTAGCTAAG GGCAGCGGTT TAGCTCGCCCATGGGG5′或5′CCATCGATCG TCCAATCGCT ATACTCTCGG TACCCC3′(Kc)3′ GGTAGCTAGC AGGTTAGCGA TATGHGAGCCATGGGG5′；和圖5a和5b所顯示的核酸構建體pGEM-hTR或圖6a和6b所顯示的核酸構建體pGEM-hTR(Ka)；具有下列序列的共擴增標準RNA核酸；圖7顯示的(hTRKa)，圖8顯示的(hTRKb)，圖9顯示的(hTRKc)和它們的cDNA；用於檢測野生型核酸和hTRKa，hTRKb及hTRKc標準核酸的cDNA的擴增的cDNA的寡核苷酸，其具有下列序列5′CGACTTTGGA GGTGCCTTCA 3′O(wt)5′AAGTCGGATC CACTTAGGTC 3′O(Ka)5′CGCTCGATTT GGCGACGGGA 3′O(Kb)5′GAGAGTATAG CGATTGGACG3′O(Kc)；和用於檢測擴增的「反義」RNA的寡核苷酸的相應的反向互補序列。
本發明還涉及在體液中定量腫瘤細胞的試劑盒，所述體液例如血液、尿及其它糞便、溢泌物及體腔的分泌物，尤其是外周血，該試劑盒包含(a)用於共擴增的核酸和(b)寡核苷酸引物對，這些引物對用於特異性擴增編碼端粒酶的核酸和(a)中限定的核酸，在(a)中提到的用於共擴增的標準RNA核酸具有下列序列圖7顯示的(hTRKa)、圖8顯示的(hTRKb)，圖9顯示的(hTRKc)，和/或優選地具有下列序列的寡核苷酸引物對5′GACTCGGCTC ACACATGCAG TTCGC 3′(TM1)和/或5′CTGGTCGAGA TCTACCTTGG GAGAAGC3′(TM2)其中TM1和/或TM2在合適時還可以包含RNA聚合酶的啟動子序列。
另外，正如前文詳細描述的一樣，所述新試劑盒可以還包含作為特異性檢測野生型序列的擴增的cDNA的雜交探針的標記寡核苷酸和/或多個作為特異檢測標準核酸的擴增的cDNA的雜交探針的標記寡核苷酸，此外，用於PCR擴增的新試劑盒可以還包含前文詳細描述的酶，在合適時可以包含標記的核苷酸和/或合適的緩衝液，例如，反轉錄酶(優選的是AMV反轉錄酶)，DNA聚合酶(優選的是Taq聚合酶)和/或DNA酶，並且在合適時可以包含如前文詳細描述，用於幹細胞和/或激活的免疫細胞的排除和/或腫瘤細胞的濃縮的方法。
供NASBA用的其它新試劑盒，除包含前面詳細描述的標準核酸外，同樣可以包含用作特異性檢測野生型序列的擴增的「反義」RNA之雜交探針的標記的寡核苷酸和/或多個用作特異檢測標準核酸的擴增的「反義」RNA之雜交探針的標記的寡核苷酸。還可以同樣地包含前文所述的酶，在合適時可以包含標記的核苷酸和/或合適的緩衝液，例如，反轉錄酶(優選的是AMV反轉錄酶)，RNA聚合酶(優選的是T7RNA聚合酶)，RNA酶H和/或DNA酶，在合適時可以包含如上文描述的，用於幹細胞和/或激活免疫細胞的排除和/或腫瘤細胞的濃縮的方法。
下列實施例和附圖用於詳細描述本發明，然而不用來限制本發明。
附圖描述圖1顯示了人類端粒酶RNA組分和設計的寡核苷酸引物的位置具有327個鹼基對(bp)的擴增產物的5′引物TM1(位置428-452)和3′引物TM2(位置728-754)或具有981bp的擴增產物的5′引物TMK1([16bp]+1-27)和3′引物TMK2(位置940-962+[3bp]。限制性內切酶NotI和Hind III的水解給出了962bp的片段hTR。
圖2顯示了對腫瘤細胞系cDNA的PCR擴增。
帶1MT4，T-細胞淋巴母細胞系；帶2C8166，T-細胞白血病細胞系；帶3K562，慢性骨髓白血病(CML)細胞系；帶4Molt4，急性淋巴白血病(ALL)細胞系和帶5畸胎瘤細胞系；M100bp標記。hTR具有TM1和TM2引物的RT-PCR；hTR/4RT不具反轉錄(RT)反應的對照PCR；GAPDH用甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH)引物的對照RT-PCR。
圖3顯示了用引物TM1和TM2對腫瘤組織和健康參照組織cDNA的PCR擴增。M100bp的標記；帶1腎腫瘤，帶2健康腎組織；帶3甲狀腺癌，帶4健康甲狀腺組織；帶5胸癌，帶6健康胸組織；帶7結腸癌，帶8健康大腸癌；帶6H2O對照反應。
圖4顯示了用TM1和TM2引物對正常受試者和白血病病人外周血中的cDNA的PCR擴增。M100bp的標記；帶1-3健康血液供體；帶4-8患急性骨髓白血病的病人；帶9H2O對照反應。
圖5a和5b顯示了具有轉錄載體pGEM-13Zf(+)和在圖1中顯示的片段hTR(Not I/HindIII)的構建體pGEM-hTR，它包含人類端粒酶RNA組分的cDNA(鹼基1-956位置12-975)。點線顯示了經寡核苷酸引物TMK1的Not I添加的位置(位置12-17)。
圖6a和6b顯示了具有Cla I-BamHI-Kpn I盒(位置585-616)的構建體pGEM-hTR(Ka)(4118bp)和具有606bp的擴增產物的設計的寡核苷酸引物的位置(5′引物TMK1位置[16bp]+1-27，3′引物TMK3位置565-605+〔24bp〕)以及具有387bp的擴增產物的設計的寡核甘酸引物的位置(5′引物TMK4位置601-636+〔20bp〕，3′引物TMK2位置940-962+[3bp])，限制性內切酶Not I和Bam HI或BamHI和HindIII的水解分別給出588或375bp的產物。在pGEM-13 Zf(+)中的片段連接反應給出963bp的產物。
圖7顯示了在對構建體pGEM-hTRKa用Sp6RNA聚合酶體外轉錄之後的標準RNA hTRKa(975 bp)，其已由HindIII線性化；並且顯示了20bp隨機序列的位置(位置591-610)。
圖8顯示了對構建體pGEM-hTRKb用Sp6RNA聚合酶體外轉錄之後的標準RNA hTRKb(975bp)，其已由HindIII線性化；並且顯示了20bp隨機序列的位置(位置591-610)。
圖9顯示了對構建體pGEM-hTRKc用Sp6 RNA聚合酶體外轉錄後的標準RNA hTRKc(975bp)，其已由HindIII線性化；並且顯示了20bp隨機序列的位置(位置591-610)。
實施例除非有其它說明，按照標準方法(例如Sambrook等(1989)所描述的)或按照所使用的試劑盒和酶的製造商的說明完成下面的實施例。
1.外周血，組織和細胞的培養與分離按ATCC(美國典型培養物保藏中心)推薦的方法培養腫瘤細胞系，如MT4(T-細胞淋巴母細胞)，C8166(T-細胞白血病細胞)，K562(慢性骨髓白血病細胞(CML))，Molt4(急性淋巴白血病細胞(ALL))和畸胎瘤細胞。用EDTA-monovets(Saarsted)刺穿白血病(急性骨髓白血病)病人和健康對照受試者的前臂靜脈取得靜脈血。切除人類腫瘤組織和健康參照組織後，立即在液氮中進行震蕩冰凍(shock-frozen)，然後在-70℃保藏。
2.細胞RNA的分離用標準方法分離總細胞RNA[Chomczynski等(1987)，分析生物化學162，156；Sambrook，J等，(1989)，冷泉港，紐約，美國，冷泉港出版社]。除去外周血後，將它立即轉移到RNA降解緩衝液(4M異硫氰酸胍；0.1MTris-HClpH7.5，1％巰基乙醇)中，利用Ultra-Turrax T25分散裝置(Laborreaktor-Systeme，IKA)在RNA降解緩衝液中使組織和細胞混勻。這種混合物要麼立即進一步加工，要麼貯藏在-70℃。
3.反轉錄和聚合酶鏈反應(RT-PCR)如製造商詳細描述的那樣，利用GeneAmpRNA-PCR試劑盒進行RT-PCR。將外周血中分離的總RNA分成若干等份，這些等份、細胞系和組織在每種情況下都應先用20U DNA酶(Boehringer，Mannheim)在10μl混合物(50mMKCl；10mM Tris-HCl，pH8.3和2.5mM MgCl2)中在37℃下水解60分鐘，然後在95℃下放置30分鐘使DNA酶失活。為了從蛋白質和DNA片段中徹底純化RNA，在每種情況下，再在矽膠基質(RNeasy，Qiagen)中純化DNA水解酶，然後用測光計進行測量。
下面兩個寡核苷酸引物TM1 5′GACTCGGCTC ACACATGCAG TTCGC 3′TM2 5′CTGGTCGAGA TCTACCTTGG GAGAAGC 3′是按照Feng等公布的人類端粒酶RNA組分的序列設計的)Feng等(1995)，科學2691236-41)(圖1)，並且使用應用生物系統380A合成器合成出這兩個引物。通過使用BLASTN 1.4.9 MP對GenBank，EMBL，DDBJ和PDB資料庫中的核酸序列的計算機輔助同源性分析檢查TM1和TM2引物的特異性[Altschul，S.F.等(1990).J Mol Biol 215403-410]。
為了讓擴增數量保持一致，在每次實驗中，對RT反應應使用相同數量的RNA。為了消除基因組DNA對RNA製品的汙染，每個用RNA酶水解的包含RNA的樣品首先必須進行後文描述的PCR和有關擴增的檢測。對於隨後的cDNA合成和PCR使用包含RNA的樣品，在這些樣品中沒有擴增產物是可檢測的，GAPDH的寡核苷酸用作中間標準參照物。
按照下面的說明，在5μl cDNA反應物或150的分離的質粒DNA的稀釋液中進行PCR(95℃2分鐘，預熱)；(94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，35個循環)；(72℃7分鐘，最終延伸)。在1.5％TAE瓊脂糖凝膠上經凝膠電泳分級分離擴增產物，用溴化乙錠染色然後在紫外光下進行顯示和記錄(參見圖2-4)。
4.標準RNA核酸hTRKa，hTRKb和hTRKc的製備所使用的酶，如Sp6RNA聚合酶，T4連接酶和限制性內切酶，特別是來自Boehringer Mannheim，Biolabs和Promega的酶，象製造商介紹的那樣使用。在1.5％TAE瓊脂糖上經凝膠電泳並洗脫分級分離預期的供克隆的PCR擴增產物(Qiagen)。經苯酚/氯仿抽提，在乙醇和鹽液中進行沉澱或者利用DNA純化法(Qiagen)純化限制性水解產物。通過用T4連接酶將所述片段連接到在克隆和轉錄載體pGEM-13Zf(+)中的相應的切割位點來克隆所說的構建體。這種載體允許選用Sp6或者T7RNA聚合酶體外轉錄克隆片段。經電穿孔(BioRad)轉化活性細菌(XL-1Blue，Stratagene)。用質粒純化試劑盒(Qiagen)純化質粒DNA。用載體或序列特異寡核苷酸引物通過PCR來證實陽性克隆。經半自動序列分析進行對構建體的序列證實。
構建體pEGM-hTR(圖5a和5b)作為構建體pGEM-hTR(Ka)(圖6a和6b)，pGEM-hTR(Kb)和pGEM-hTR(Kc)的原初構建體產生。pGEM-hTR(Ka)不同於pGEM-hTR之處在於在位置585-616上序列的隨機交換，構建體pGEM-hTRKb和pGEM-hTRKc也不同於pGEM-hTR之處在於在位置587-615上序列的隨機交換。所說的構建體用於使用標準核酸hTRKa(圖7)，hTRKb(圖8)和hTRKc(圖9)的Sp6RNA聚合酶的體外轉錄。為了形成構建體pGEM-hTR，將人類端粒酶hTR(圖1)的RNA組分的cDNA克隆到pGEM-13Zf(+)的Not I和Hind III切割位點。利用後面的寡核苷酸引物採用RT-PCR能夠達到這個目的，這些引物來源於在上文描述過的條件下，在預先從腫瘤細胞或細胞系分離的RNA中的序列hTR(圖1)5′ATAAGAATGC GGCCGCGGGT TGCGGAGGGTGGGCCTGGGA GGG3′(TMK1)5′CCCAAGCTTG TGGGGGTTAT ATCCTA3′(TMK2)寡核苷酸引物TMK1(位置1-27，圖1)包含一個附加的16bp的5′突出端和一個Not I切割位點，寡核苷酸引物TMK2(位置940-962，圖2)包含一個附加的3bp突出端和一個HindIII切割位點。TMK1和TMK2引物對擴增一個979bp的片段。用NotI和HindIII限制性水解後，963bp的片段hTR(NotI+HindIII)(位置1-957，圖5)被克隆到pGEM-B Zf(+)相應的切割位點(位置12和38)，並且4118bp的構建體pGEM-hTR也被產生。通過在構建體pGEM-hTR(位置585-616)中由一個32bp的ClaI-BamHI-KpnI盒置換一個32bp的序列構建pGEM-hTR(Ka)，這個ClaI-BamHI-KpnI盒為5′ATCGATGACC TAAGTGGATC CGACTTGGTA CC 3′3′TAGCTACTGG ATTCACCTAG GCTGAACCAT GG 5′經重組PCR進行這種置換反應，這種反應是Higuchi等描述的方法的改進[Higuchi，R.(1988).核酸研究167351-7367，Higuchi，R.(1990).M.Innis A.等eds.聖地牙哥，紐約，柏林，波士頓，倫敦，雪梨，東京，多倫多，學術出版社177-183]。在第一步中，在pGEM-hTR上進行兩個獨立的PCR反應第一個PCR反應用下面的寡核苷酸引物進行，這個引物來源於序列hTR(圖1)5′ATAAGAATGC GGCCGCGGGT TGCGGAGGGTGGGCCTGGGA GGG3′(TMK1)5′CGCGGATCCA CTTAGGTCAT CGATCTGCCAATTTGCAGCA CACT 3′(TMK3)寡核苷酸引物TMK3(位置565-605，圖6)包含一個附加的24bp具有一個BamHI和ClaI切割位點的5′突出端，它編碼21bp的ClaI-BamHI-Kpn I盒。來自第一次PCR反應的擴增產物給出606bp的5′片段，並且用Not I和Bam HI酶切消化後得到一個588bp的5′片段。
第二個PCR反應用下面的寡核苷酸引物進行，這個引物來源於序列hTR(圖1)5′CGCGGATCCG ACTTGGTACC ATGAATGGGCAGTGAGCCGG 3′(TMK4)5′CCCAAGCTTG TGGGGGTTAT ATCCTA 3′(TMK2)寡核苷酸引物TMK4(位置599-618，圖6)包含一個附加的20bp具有一個BamHI和ClaI切割位點的5′突出端，它編碼17bp的ClaI-BamHI-KpnI盒。來自第二個PCR反應的擴增產物給出387bp的3′片段，並且用BamHI和HindIII水解後得到375bp的3′片段。T4連接酶用於連接5′和3′的BamHI切割位點，得到963bp的NotI-HindIII片段，這個片段被克隆進pGEM-13Zf(+)的相應切割位點(位置13和38)產生4118bp的構建體pGEM-hTR(Ka)(圖6)。通過在構建體pGEM-hTR(Ka)中用29bp的隨機序列置換29bp的序列構建pGEM-hTR(Kb)和pGEM-hTR(Kc)。在構建體pGEM-hTR(Ka)用ClaI和KpnI選擇性限制消化和下面的寡核苷酸Kb和Kc之後，在兩個T4連接酶反應中，將寡核苷酸Kb和Kc的ClaI-KpnI片段克隆到pGEM-hTR(Ka)的相應切割位點中，產生4118bp的構建體pGEM-hTR(Kb)和pGEM-hTR(Kc)ClaI KpnI5′CCATCGATTC CCGTCGCCAA ATCGAGCGGGTACCCC 3′Kb3′GGTAGCTAAG GGCAGCGGTT TAGCTCGCCCATGGGG 5′
ClaIKpnI5′CCATCGATCG TCCAATCGCT ATACTCTCGGTACCCC 3′Kc3′ GGTAGCTAGC AGGTTAGCGA TATGAGAGCCATGGGG 5′在體外，用Sp6RNA聚合酶從pGEM-hTR(Ka)(hTRKa，圖7)，pGEM-hTR(Kb)(hTRKb，圖8)和[pGEM-hTR(Kc)(hTRKc，圖9)產生長度為975bp的RNA。用標準方法進行RNA的進一步加工如DNA酶切消化，純化和標定。
5.結果腫瘤細胞系的研究揭示，人類端粒酶RNA組分在所有腫瘤細胞系(在GAPDH對照反應中具有相同量的擴增)中可以以不同的量被檢測到。在每種情況下，通過不加入反轉錄酶的對照反應，排除基因組DNA的汙染是可能的。
腫瘤組織和健康組織的比較研究揭示，不但在腫瘤組織，而且在健康參照組織中，人類端粒酶RNA組分都可以明確地檢測出來(圖3)。從腫瘤組織中獲得的RNA個體的量能夠解釋擴增產物的強度變化。
靜脈血液的研究揭示，健康受試者和白血病病人血液中的端粒酶活性的不同水平是可檢測的，並且發現，與癌症病人比較，對照受試者的端粒酶活性明顯較低(圖4)。
用Sp6 RNA聚合酶體外轉錄構建體pGEM-hTR(Ka)，pGEM(Kb)和pGEM-hTR(Kc)揭示出在每種情況下的長度為975個鹼基的所需RNA轉錄物hTRKa，hTRKb和hTRKc。
權利要求
1.一種在體液中定量分析腫瘤細胞的方法，該方法包括(a)用待測樣品進行反應，端粒酶的RNA組分在這一反應中被特異地擴增，和(b)定量測定擴增的核酸的量。
2.如權利要求1所要求的方法，其中在用待測樣品進行擴增反應之前進行反轉錄反應，包含在樣品中的RNA在這一反應中被轉錄成cDNA。
3.如權利要求1或2所要求的方法，其中在RNA轉錄成cDNA之前，利用待測樣品進行DNA酶反應。
4.如權利要求1-3之任一所要求的方法，其中所說的待測樣品是純化的，優選地是通過離子交換層析，特別是在矽膠上的層析純化的。
5.如權利要求1-4之任一所要求的方法，其中，為了定量測定編碼端粒酶的核酸，共擴增至少一種(優選地是三種)標準核酸，並以不同的濃度添加到待測樣品中。
6.如權利要求5所要求的方法，其中共擴增的標準核酸具有圖7，8和/或9顯示的序列。
7.如權利要求1-6之任一所要求的方法，其中直接定量或通過標記(優選地，通過放射性標記、生物素標記，螢光標記或電化學發光標記)定量擴增產物。
8.如權利要求1-6之任一所要求的方法，其中通過與標記的寡核苷酸的雜交檢測擴增產物，這裡所說標記優選地是放射性標記，生物素標記，螢光標記或電化學發光標記。
9.如權利要求5-8之任一所要求的方法，其中，為了定量待測編碼端粒酶的核酸，將共擴增的核酸或核酸的量和編碼端粒酶的核酸的量比較。
10.如權利要求1-9之任一所要求的方法，其中待測樣品是外周血，並且其中用待測樣品作為陽性對照進行反應，在這一反應中，出現在外周血中的核酸(優選地是編碼β-珠蛋白或甘油醛磷酸脫氫酶的mRNA)被特異地擴增和檢測。
11.如權利要求1或3-10之任一所要求的方法，其中，作為陰性對照，在用待測樣品進行擴增反應之前，無反轉錄反應進行和/或用水替代體液。
12.如權利要求1-11之任一所要求的方法，其中將下面的寡核苷酸引物用於擴增5′GACTCGGCTC ACACATGCAG TTCGC 3′(TM1)和/或5′TGGTCGAGA TCTACCTTGG GAGAAGC 3′(TM2)其中TM1和/或TM2在合適時包含RNA聚合酶的啟動子序列。
13.如權利要求1-12之任一所要求的方法，其中將DNA聚合酶或RNA聚合酶用於擴增。
14.如權利要求1-13之任一所要求的方法，其中，就使用DNA聚合酶的擴增來說，進行聚合酶鏈反應(PCR)；就使用RNA聚合酶來說，進行等溫的基於核酸序列的擴增反應(NASBA)。
15.如權利要求1-14之任一所要求的方法，其中待測的樣品是血液，並且其中待測血樣在幹細胞和/或激活的免疫細胞中被排除，優選地通過免疫吸附排除。
16.如權利要求1-15之任一所要求的方法，其中待測樣品是血液，並且來自待測血樣的腫瘤細胞被濃縮，優選地，通過免疫吸附濃縮。
17.如權利要求1-16之任一所要求的方法，其中待測樣品是血液，並且，一方面用所說的方法測定靜脈血樣，另一方面用所說的方法測定動脈血樣，然後比較兩者的結果。
18.如權利要求1-17之任一所要求的方法，其中待測樣品是血液，並且，一方面用所說的方法測定指墊血樣，另一方面用所說的方法測定靜脈或動脈血樣，然後比較兩者的結果。
19.如權利要求1-18之任一所要求的方法，其中所說的腫瘤細胞來源於惡性腫瘤的轉移，優選地是微轉移。
20.如權利要求1-19之任一所要求的方法，其中所說的腫瘤細胞選自來自T-細胞淋巴母細胞、T-細胞白血病細胞、慢性骨髓白血病細胞、急性淋巴白血病細胞、慢性淋巴白血病細胞的轉移腫瘤和/或瘤，畸胎癌、黑素瘤、肺瘤、大腸癌、胸癌、肝細胞癌、腎腫瘤、腎上腺腫瘤、前列腺癌、成神經細胞癌、腦神經瘤、肺小細胞瘤、彈狀肌瘤，平滑肌肉瘤和/或淋巴瘤的細胞。
21.一種寡核苷酸引物，其具有序列5′GACTCGGCTC ACACATGCAG TTCGC 3′(TM1)5′CTGGTCGAGA TCTACCTTGG GAGAAGC 3′(TM1)5′ ATAAGAATGC GGCCGCGGGT TGCGGAGGGTGGGCCTGGGA GGG3′(TMK1)5′CCCAAGCTTG TGGGGGTTAT ATCCTA 3′(TMK2)5′ CGCGGATCCA CTTAGGTCAT CGATCTGCCAATTTGCAGCA CACT3′(TMK3)；和/或5′ CGCGGATCCG ACTTGG TACC ATGAATGGGCAGTGAGCCGG 3′(TMK4)
22.一種寡核苷酸，其具有序列5′CCATCGATTC CCGTCGCCAA ATCGAGCGGG TACCCC3′(Kb)3′ GGTAGCTAAG GGCAGCGGTT TAGCTCGCCCATGGGG 5′，和/或5′CCATCGATCG TCCAATCGCT ATACTCTCGG TACCCC3′(Kc)3′ GGTAGCTAGC AGGTTAGCGATATGAGAGCCATGGGG 5′
23.一種用於與圖7、8及9所示的序列及其相應的cDNA共擴增的標準核酸。
24.一種如圖5a和5b所示的核酸構建體pGEM-hTR。
25.一種如圖6a和6b所示的核酸構建體pGEM-hTR(Ka)。
26.一種用於在體液中定量測定腫瘤細胞的試劑盒，其包含(a)用於共擴增的標準核酸，和(b)一種用於特異性擴增編碼端粒酶的核酸和在(a)中限定的核酸的寡核苷酸引物對。
27.如權利要求26所要求的試劑盒，其中，在(a)中限定的標準核酸具有如圖7、8和/或9所示的序列。
28.如權利要求26或27所要求的試劑盒，其中，在(b)中限定的寡核苷酸引物對具有下列序列5′GACT CGGCTC ACACATGCAG TTCGC 3′(TM1)和5′CTGGTCGAGA TCTACCTTGG GAGAAGC 3′(TM2)其中TM1和/或TM2在合適時包含RNA聚合酶的啟動子序列。
29.如權利要求26-28之任一所要求的試劑盒，該試劑盒還包含用於檢測待測樣品的擴增的核酸的標記的寡核苷酸和/或用於檢測共擴增的標準核酸的一個或多個標記的寡核苷酸，特別是具有以下序列的寡核苷酸5′CGACTTTGGA GGTGCCTTCA 3′O(Wt)5′AAGTCGGATC CACTTAGGTC 3′O(Ka)5′CGCTCGATTT GGCGACGGGA 3′O(Kb)5′GAGAGTATAG CGATTGGACG 3′O(Kc)和其相應的反向互補序列。
30.如權利要求26-29之任一所要求的試劑盒，該試劑盒還包含反轉錄酶、DNA聚合酶(優選的是Taq聚合酶)，DNA酶和/或合適的緩衝液和(在適當時的)標記的核苷酸以及(在適當時的)適於排除幹細胞和/或激活的免疫細胞和/或適於濃縮腫瘤細胞的方法。
31.如權利要求26-29之任一所要求的試劑盒，該試劑盒還包含反轉錄酶，RNA聚合酶(優選的是T7RNA聚合酶)、RNA酶H、DNA酶和/或合適的緩衝液和(在適當時的)標記的核苷酸，以及(在適當時的)適於排除幹細胞和/或激活的免疫細胞和/或適於濃縮腫瘤細胞的方法。
全文摘要
本文公開了在體液中定量分析腫瘤細胞的方法,該方法需要首先用待測樣品進行反應,在這一反應中,端粒酶的RNA組分被特異性地擴增,然後定量測定被擴增的核酸的量,本文還公開了適用於該方法的試驗試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1202206SQ96198364
公開日1998年12月16日 申請日期1996年11月14日 優先權日1995年11月16日
發明者M·W·達姆 申請人:M·W·達姆