一種標記幹細胞的方法及對應的磁力引導裝置製造方法
2023-07-20 03:51:56 1
一種標記幹細胞的方法及對應的磁力引導裝置製造方法
【專利摘要】本發明公開了一種標記幹細胞的方法及對應的磁力引導裝置。利用超順磁氧化鐵納米顆粒的鐵磁性，採用磁力引導靶向技術使目標幹細胞在靶組織定向富集，具有安全有效，方法簡便等優點，隨著幹細胞治療方法的推廣，具有廣泛的應用前景；同時，磁力引導設備為內徑呈梯度變化的U形磁鐵組成，在使用中，隨著血液流動，磁力強度呈梯度變化，從而可以有效緩解甚至避免由於磁力過大引起的細胞堵塞問題，相對比無變化磁場引導等方法，進一步提高安全性。
【專利說明】一種標記幹細胞的方法及對應的磁力引導裝置
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學、生物【技術領域】，尤其涉及一種帶磁性的幹細胞的標記方法及對應的磁力引導裝置。
【背景技術】
[0002]外周血管病變是糖尿病主要的慢性併發症之一，同時也是導致糖尿病患者截肢的主要原因。近幾年，隨著幹細胞生物學的研究深入，幹細胞移植修復缺血組織及血管側枝循環重建已成為外周血管缺血治療的研究熱點。該治療方法是基於幹細胞具有高度的可塑性，即在一定條件下，能夠分化成為不同的細胞譜系的細胞，如血管內皮細胞等。在治療過程中，將幹細胞植入病變部位，並通過其分化形成新的血管細胞，修復受損部位，從而改善或恢復外周組織的血供，達到治療外周血管病變的目的。
[0003]有報導指出，幹細胞治療方法的效果與幹細胞在病變部位富集程度有密切關係。目前，臨床上經常使用兩種方法增加局部細胞集聚:一種是靜脈注射法，該方法通過將將幹細胞注射入外周靜脈血管內，通過血液循環，使幹細胞到達靶組織區域。然而該方法為全身給藥無特意選擇性，靶組織區域的幹細胞濃度較低，治療效果不甚理想。另一種方法與此相對，在病變部位直接注入幹細胞，採用此方法時，幹細胞直接被注入到靶組織區域，保證了幹細胞的集聚濃度，但此直接注入方法需要手術實現，操作複雜，患者創傷大，康復時間長。綜上所述，設計一種安全有效並且簡便的幹細胞局部富集方法用於治療外周血管病變具有非常重要的臨床意義。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種標記幹細胞的方法及對應的磁力引導裝置，大大提高了安全性。
[0005]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
[0006]一種標記幹細胞的方法，該方法包括:
[0007]基於內吞作用、胞吞作用、胞飲作用、基於超聲原理或基於電穿孔原理使具有鐵磁性的納米顆粒進入幹細胞，完成對幹細胞的標記，獲得帶鐵磁性的幹細胞。
[0008]所述的具有鐵磁性的納米顆粒包括:超順磁氧化鐵SP1納米顆粒。
[0009]一種用於引導所述帶磁性的幹細胞的磁力引導裝置，所述磁力引導裝置包括:多個內徑呈梯度變化的U形磁鐵，形成磁場強度呈梯度變化的磁場，且所述多個內徑呈梯度變化的U形磁鐵通過無磁性有機多聚物固定封裝。
[0010]在有磁性引導時，帶鐵磁性的幹細胞在磁場的作用下向目標區域定向富集。
[0011]由上述本發明提供的技術方案可以看出，利用超順磁氧化鐵納米顆粒的鐵磁性，採用磁力引導靶向技術使目標細胞在靶組織定位富集，具有安全有效，方法簡便等優點，隨著幹細胞治療方法的推廣，具有廣泛的應用前景；同時，磁力引導設備為內徑呈梯度變化的U形磁鐵組成，在使用中，隨著血液流動，磁場呈梯度變化，從而可以有效緩解甚至避免由於磁力突然過大引起的SP1堵塞問題，從而進一步提高安全性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域的普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他附圖。
[0013]圖1為本發明實施例一提供的一種標記幹細胞的方法的流程圖；
[0014]圖2為本發明實施例二提供的磁力引導裝置的示意圖。
【具體實施方式】
[0015]下面結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明的保護範圍。
[0016]實施例一
[0017]本發明實施例一提供一種標記幹細胞的方法，該方法基於內吞作用、胞吞作用、胞飲作用、基於超聲原理或基於電穿孔原理使具有鐵磁性的納米顆粒進入幹細胞，完成對幹細胞的標記，獲得帶鐵磁性的幹細胞。
[0018]在本發明實施例中，所述標記方法可以使用簡單的共同孵育，或受體介導胞吞，或使用協助內吞的轉染試劑，或使用超聲標記的方法，或使用電穿孔(電擊法)等方法，使具有鐵磁性納米顆粒可以進入到幹細胞內；所述具有鐵磁性的納米顆粒包括:SP10(超順磁氧化鐵)納米顆粒，或其他基於Fe且具有鐵磁性的納米顆粒。
[0019]示例性的，下面以SP1納米顆粒為例簡述各種標記方法:
[0020]1、直接孵育，如圖1所示，主要包括如下兩個步驟:
[0021]步驟11、將幹細胞與SP1納米顆粒放置於容器中共同孵育2小時，直至所述SP1納米顆粒進入所述幹細胞。
[0022]步驟12、再使用生理鹽水對所述幹細胞進行洗滌，獲得內含鐵磁性顆粒的幹細胞。
[0023]2、受體介導胞吞。將SP1與特定的受體(如多聚陽離子HIV tat肽結合或與抗轉鐵蛋白受體的單克隆抗體等)結合，將複合物與幹細胞共同培養，通過和幹細胞膜表面相應的受體結合，形成內飲小泡，使SP1轉運進入細胞，使細胞得以標記。
[0024]3、轉染試劑介導標記。將轉染試劑與細胞及SP1共同培養，使SP1顆粒通過融合進入細胞，從而促使細胞內化，用於標記細胞。
[0025]4、電穿孔方法(也稱電擊法)。利用脈衝電場改變細胞膜的通透性達到使SP1顆粒進入細胞。該方法通過將細胞膜置於高強度的電脈衝下，引起局部短暫的屏障失穩，細胞膜在攪動中形成微孔，使培養液中的SP1顆粒進入細胞，從而標記細胞。
[0026]5、超聲標記(也稱聲穿孔法)。其方法是使用超聲波對幹細胞懸浮液進行輻照，使細胞膜可以對大分子暫時開放，在此期間SP1進入細胞內，而後細胞膜再封閉起來，從而達到標記細胞的目的。
[0027]上述方法中利用帶有磁性的納米顆粒對幹細胞進行標記，之後可以根據幹細胞帶有磁性的特點可以利用磁性進行引導，使得幹細胞在磁場作用下定向富集於靶組織。
[0028]本發明實施例中，所述幹細胞為具有特定細胞表面標記，具有多種分化潛能的細胞，細胞來源可以是人臍帶、臍帶血、骨髓以及脂肪及其他器官；下面簡述獲得人臍帶間充質幹細胞過程。
[0029]I)選擇健康產婦於手術中無菌採集的剖宮產胎兒的臍帶(事先經患者同意)，用預冷的雙抗PBS衝洗臍帶外表面，去除表面的凝血塊。
[0030]2)用止血鉗夾住臍帶兩端開口，放入過濾除菌的75%醫用酒精中，浸泡約lmin。
[0031]3)取出酒精浸泡的臍帶，洗去殘餘酒精，將臍帶剪成2-3cm的小段，放入新的PBS中。
[0032]4)分離臍帶:用組織鑷去除臍帶的兩根動脈、一根靜脈，以及外膜，分離出華通膠質組織,放入加入PBS中。
[0033]5)收集分離出的所有華通膠組織，剪刀剪碎，用PBS清洗膠體小組織塊兩次，加入培養基，分瓶培養。
[0034]6) 3-5天以後，對膠體組織換液一次。
[0035]7) 5-7天後，hUMSC會由膠體小組織塊長出，並攜帶膠體組織塊貼壁。
[0036]8)3天後，用0.125%的Trypsin消化細胞，所得細胞懸液按照常規細胞培養步驟進行培養，即可得到人臍帶間充質幹細胞。
[0037]利用內吞作用使得幹細胞帶有磁性。本發明實施例中，採用包裹葡聚糖的SP1 (超順磁氧化鐵)納米顆粒使用經FDA批准的商品化造影劑Ferridex 1.V (AdvancedMagnetics, Inc.)，也可以使用其他的合成的基於Fe且具有鐵磁性的造影劑。即將利用前述方法得到的幹細胞與Ferridex 1.V共同孵育2小時,此時SP1納米顆粒進入幹細胞；再經生理鹽水洗滌幹細胞，得到帶標記的可收到磁場引導的幹細胞。
[0038]本發明實施例中，所述SP1納米顆粒直徑在15-200納米左右，由於SP1具有鐵磁性，因而進入幹細胞後，所述幹細胞也具有鐵磁性。
[0039]根據幹細胞帶有磁性的特點可以利用磁性進行引導，使得幹細胞在磁場作用下定向富集於靶組織，當無磁性引導時，幹細胞被定向引導的能力，細胞中的SP1顆粒進入代謝循環，不會特異性滯留於靶組織區，對機體無毒副作用。本方法具有安全有效，方法簡便等優點，隨著幹細胞治療方法的推廣，具有廣泛的應用前景。
[0040]實施例二
[0041]本發明實施例提供一種磁力引導裝置，該裝置可以引導實施例一所述的帶磁性的幹細胞。
[0042]如圖2所示，所述磁力引導裝置包括:多個內徑呈梯度變化的U形磁鐵，形成磁場強度呈梯度變化的磁場，且所述多個內徑呈梯度變化的U形磁鐵通過無磁性有機多聚物固定封裝。
[0043]示例性的，材料選用銣鐵硼等用磁性材料，外圍尺寸300X250X82mm，寬端U形內徑為230mm,窄端U形內徑為142mm。
[0044]本發明實施例中，所述磁力引導裝置為內徑呈梯度變化的U形磁鐵組成，兩磁極間距離逐漸變小，磁極逐漸變厚。此時，在兩磁極間形成磁場且隨磁極間距離變小，逐漸增強，磁場強度可以使帶有磁性的幹細胞具有良好的富集效果，增加幹細胞在該部位的錨定，增加幹細胞存活率，增強幹細胞治療效果；另外，梯度磁場還可以有效緩解甚至避免由於磁力突然加大引起的SP1堵塞問題，相比於無梯度磁場強度變化的引導，安全性得到顯著提聞。
[0045]示例性的，下面以具體示例為例進行說明。
[0046]本發明實施例中，使用下肢動脈腔內注射幹細胞至靶組織區，細胞濃度為109/肢幹細胞。
[0047]1)1%利多卡因行股動脈區域的局部麻醉，成功後穿刺同側股動脈或者對側股動脈，放置5F動脈鞘管後備用。
[0048]2)將患者下肢放置於磁力引導裝置中，本裝置使用銣鐵硼等永磁性材料可提高磁場強度，使幹細胞在下肢缺血區聚集；前寬後窄設計可形成梯度場，避免磁力引導細胞時產生的堵塞現象。
[0049]3)用導絲和導管到下肢動脈，交換導絲送入球囊到病變部位，充盈球囊，阻斷動脈，將幹細胞混合液推入動脈腔內，之後放鬆球囊並撤除。
[0050]4)退出動脈鞘管，壓迫穿刺口 15-20分鐘後包紮穿刺口。
[0051]將下肢缺血部位定位於磁力引導裝置中，使缺血下肢位於磁場中，在帶有磁性的幹細胞注入體內的後，沿血液循環分布於體內的各級血管，由於下肢處於磁場中，內含鐵磁性粒子的幹細胞將受到磁力引導，增加在下肢血管的集聚，更多的錨定在此區域血管，從而使細胞富集於此區域，加強此區域的幹細胞治療效果。
[0052]本發明上述實施例中，利用超順磁氧化鐵納米顆粒的鐵磁性，採用磁力引導靶向技術使標記的幹細胞在靶組織定位富集，具有安全有效，方法簡便等優點，隨著幹細胞治療方法的推廣，具有廣泛的應用前景；同時，磁力引導設備為內徑呈梯度變化的U形磁鐵組成，在使用中，隨著血液流動，磁力逐漸增大，從而可以有效緩解甚至避免由於磁力過大引起的SP1堵塞問題，從而進一步提高安全性。
[0053]以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發明披露的技術範圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。因此，本發明的保護範圍應該以權利要求書的保護範圍為準。
【權利要求】
1.一種標記幹細胞的方法，其特徵在於，該方法包括: 基於內吞作用、胞吞作用、胞飲作用、基於超聲原理或基於電穿孔原理使具有鐵磁性的納米顆粒進入幹細胞，完成對幹細胞的標記，獲得帶鐵磁性的幹細胞。
2.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述具有鐵磁性的納米顆粒包括:超順磁氧化鐵3？10納米顆粒。
3.一種用於引導權利要求1-2任一項所述帶磁性的幹細胞的磁力引導裝置，其特徵在於，所述磁力引導裝置包括:多個內徑呈梯度變化的V形磁鐵，形成磁場強度呈梯度變化的磁場，且所述多個內徑呈梯度變化的V形磁鐵通過無磁性有機多聚物固定封裝。
4.根據權利要求3所述方法，其特徵在於， 在有磁性引導時，帶鐵磁性的幹細胞在磁場的作用下向目標區域定向富集。
【文檔編號】C12N5/0775GK104357384SQ201410597230
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月29日 優先權日:2014年10月29日
【發明者】南翔, 邱本勝 申請人:中國科學技術大學