一種利用微衛星引物鑑定草魚的方法
2023-08-02 16:01:56
專利名稱:一種利用微衛星引物鑑定草魚的方法
技術領域：
本發明涉及DNA分子標記檢測領域，具體涉及一種利用微衛星引物鑑定草魚的方法。
背景技術：
草魚(Ctenopharyngodon idellus)，又名鯇、草鯇、白鯇等，為我國主要淡水養殖魚類之一，分布在全國各大水系。近年來因過度捕撈、大規模興建水利工程、水質汙染等影響，使草魚資源量銳減，為了儘快掌握群體結構及其種質資源狀況，從而制定和實施更科學合理的漁業管理政策，有必要對草魚建立一種種的分子識別技術，微衛星標記則成為首選的標記之一，研究表明，在真核生物中大約每隔10-501Λ就存在1個微衛星，如在魚類基因組中，微衛星被認為每隔101Λ左右就會出現一次(Wright，1993)，廣泛分布於編碼區、內含子以及非編碼區中；微衛星DNA的側翼序列較為保守，從而保證了 PCR擴增的高效性和穩定性，由於重複單元數目的變化，因此表現出長度多態性(即SSR)，該標記方法尤其表現在對 DNA樣品的要求不高，即使樣品DNA有一定程度的降解，利用微衛星分析也能得到較好的結果，非常有利於分析特殊樣品(如化石樣品、乙醇固定的魚苗等)，由於其具有上述優點，SSR 被廣泛應用於遺傳圖譜的構建、QTL、品種鑑定等領域。
目前，對草魚的鑑別方法主要有3種(1)形態法通過對草魚的外部形態特徵進行鑑定，如體型、肌節數等，該法簡便、經濟、直觀，對成體草魚都能得到較好的鑑定結果，但是並不能將其應用於仔稚魚的鑑定研究，因為早期發育的仔稚魚經乙醇固定後會脫水、變形、某些色素會有所消失，而且會帶一定的主觀色彩，嚴重製約了形態鑑定的可行性.(2) 同工酶法主要是通過聚丙烯醯胺凝膠或澱粉凝膠電泳進行，如李思發(1990)對長江四大家魚原種的10種同工酶電泳分析表明，其同工酶譜可作為四大家魚種質鑑定標準，但同工酶表達與組織發育時期有關，限制了其在仔稚魚鑑定中的應用，(3)分子標記法在分子標記方面，RAPD常用於物種鑑定中，如薛國雄等對長江、珠江、黑龍江3大水系的草魚的RAPD 分析表明，每一水系的草魚特徵性基因圖譜可作為種群鑑定的依據，但RAPD標記重複性和穩定性較差，鑑於此，微衛星標記則為最佳的分子標記之一，目前，也有好多學者將其應用於品種鑑定領域，如公開號為CN1370834A的專利申請「適於豬品種分類的微衛星DNA標記」以及扇貝微衛星標記的篩選及其在物種鑑定中的應用等，關於草魚也有許多微衛星標記的研究，但其目的用於分析草魚的遺傳多樣性而不是用於物種鑑定，所以，利用微衛星引物資源共享，設計和探究一種微衛星技術鑑定草魚的方法顯得尤為重要。
發明內容
本發明的目的在於根據現有技術中存在的不足，提供一種準確的鑑定草魚的微衛星標記方法，可用於草魚早期資源鑑定。
本發明上述目的通過以下技術方案予以實現
本發明參考已發表的文獻中的79對鯉科魚類微衛星引物，從中篩選出一組(2對引物)能鑑定草魚的特異性微衛星引物。通過二種微衛星的識別，可將其它觀種魚類與草魚區別 (見附錄)。本發明的草魚微衛星DNA標記主要用於魚類早期資源鑑定中區分草魚、早期資源魚類群落結構分析、江河生態評價等，重複性好，是一種可靠有效的分子標記。
本發明的具體步驟如下
1)傳統的酚-氯仿法提取草魚及其它魚類基因組DNA(表1)；
2)引物設計與優化，從NCBIdbEST中搜索草魚的ESTs序列，用軟體SSRHutterl. 3進行SSR的查找，然後用I^rimer Premier5. 0進行引物設計，獲得草魚EST-SSR引物84對，並對這些引物使用溫度梯度PCR儀進行退火溫度的優化；
3)PCR擴增
用上述引物以草魚基因組DNA為模板進行PCR擴增反應，PCR反應體系為20ul 0. 5umol/L 的引物，0. 2 mmol/L 的 dNTP，2 mmol/L 的Mg2+，1 XPCR 反應緩衝液，IU 的 iTaq DNA 聚合酶；用這些引物時設置的PCR程序參數為94°C預變性:3min，30個循環94°C變性30s， Ta下退火30s，72°C延伸45s，最後72°C延伸7min ；
4)PCR產物檢測
PCR擴增產物經10%非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，220V穩壓電泳3小時，然後用0. 1% 的AgNO3染色lmin，銀染後用的Na0H、0. 2%無水Na2C03、0. 4%甲醛顯色2min，直至條帶清晰為止；
5)草魚單態性引物的篩選，在84對微衛星引物中共篩選到草魚單態性引物59對，佔到所用引物的70%。
6)草魚特異性引物的篩選，用步驟5獲得的59對單態性引物分別對草魚和其它觀種魚類按上述條件進行PCR擴增、電泳，用以篩選草魚的特異性微衛星位點，結果顯示這些引物在這些魚類中要麼擴增出與草魚大小相同或相近的片段，要麼擴增不出任何產物， 最後選擇在這觀種魚類中均無任何擴增產物的2個微衛星位點作為草魚的鑑定用位點，最終將草魚與其他魚類相分開。獲得的引物序列如SEQ ID Ν0:Γ4所示。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
本發明從84對微衛星引物中篩選出2對用於鑑定草魚的特異性微衛星標記，帶型清晰、重複性好、可靠性強，可作為草魚的特徵性引物。
鑑於草魚在種苗發育階段不易通過形態特徵進行識別，通過本發明的應用，可以將其快速、準確地鑑別出來，同時，本發明具有不受環境條件及發育時期的影響，統計簡便等優點。
圖1為引物C3210在草魚不同群體個體內的擴增圖譜(1-10為桂平樣品，11-20為河源樣品，21-30為西牛樣品)；
圖2為引物C41^6在草魚不同群體個體內的擴增圖譜(1-10為桂平樣品，11-20為河源樣品，21-30為西牛樣品)；
圖3為引物Q3210在其他觀種魚類基因組DNA中的擴增圖譜(序號相對應的種類見附錄)。
具體實施方式
以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。
實施例
(1)提取草魚及其它魚類基因組DNA:
剪取經乙醇固定的魚類鰭條約20mg，用濾紙吸乾表面的無水乙醇，加入500ml STE裂解液(IOOmM NaCL; ImM EDTA (PH=8. 0) ； 10 mM Tris-CL (PH=8. 0)),剪碎，再加入 60ml SDS(10%),以及IOul的蛋白酶K(20mg/ml)，56°C水浴直至溶液澄清為止；加入等體積酚 氯仿異戊醇(25: : 1)抽提兩次；12000r離心lOmin，取上清；加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)抽提一次，12000r離心lOmin，取上清；加入等體積冰冷的無水乙醇，12000r離心IOmin,棄上清；加入600ml 70%的乙醇洗滌沉澱，8000r離心IOmin,倒掉乙醇，待乙醇揮發乾淨時加入80ul無菌蒸餾水，4°C保存直至DNA完全溶解，然後用紫外分光光度計測其 OD值並稀釋至40ng/ml備用。
(2)引物設計與優化
選取重複次數在5次以上的雙鹼基重複序列和重複次數在4次以上的三鹼基或四鹼基重複序列，使用引物設計軟體I^imer Premier5. O進行引物設計，獲得EST-SSR引物84對， 然後以不同群體中個別草魚的基因組DNA混合物為模板，進行引物的優化，起始所有引物均以Tm值為50°C進行擴增，然後根據擴增結果進行適當的增減，範圍為45°C _65°C。
(3) PCR 擴增
用上述優化的引物對草魚不同群體內個體的基因組DNA進行PCR擴增，反應體系為 20ul :40ng 草魚基因組 DNA, 0. 2mmol/L 的引物，200mmol/L 的 dNTP，200mmol/L 的 Mg2+，10XPCR反應緩衝液，IU的Taq DNA聚合酶；用這些引物時設置的PCR程序參數為 94°C預變性:3min，30個循環94°C變性30s，Ta下退火30s，72°C延伸45s，最後72°C延伸 7min ；
(4)擴增產物的檢測
PCR擴增產物經10%非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，220V穩壓電泳3小時，然後用0. 1% 的AgN03染色lmin，銀染後用m的Na0H、0.洲無水Na2C03、0. 4%甲醛混合液顯色，直至條帶清晰時為止，並拍照保存。
(5)單態性引物的篩選
對草魚不同群體內共96個個體基因組DNA進行PCR擴增、電泳，在84對引物中共篩選到草魚單態性引物59對，佔到所用引物的70% (6)草魚特異性引物的篩選
用上述(5)獲得的59對單態性引物分別對草魚和其它28種魚類按上述條件進行PCR 擴增、電泳用以篩選草魚的特異性微衛星位點，結果顯示這些引物在這些魚類中要麼擴增出與草魚大小相同或相近的片段，要麼擴增不出任何產物，最後選擇在這觀種魚類中均無任何擴增產物的微衛星位點作為草魚的鑑定用位點，最終將草魚與其他魚類相分開。
綜上所述，本發明具有以下特點
本發明從84對草魚EST-SSR引物中篩選出2對能識別草魚的特異性微衛星標記，帶型清晰、重複性好、可靠性強，可作為草魚的特徵性引物，鑑於草魚在種苗發育階段不易通過形態特徵進行識別，通過本發明的應用，可以快速、準確地鑑別出來，從而將其應用於仔稚魚的鑑定中，以期分析珠江中下遊群體結構及草魚資源變化狀況。表 1
權利要求
1. 一種利用微衛星技術鑑定草魚的方法，其特徵在於所述方法包括如下步驟(1)提取魚類DNA(包括草魚及其它28種魚類鰭條基因組DNA)，測定其OD值，於_20°C 儲存備用；搜索NCBI dbEST中草魚的ESTs序列，用軟體SSRHutterl. 3進行SSR的查找， 然後用I^rimer Premier5. 0進行引物設計並對其進行優化，在四種魚類DNA樣本中進行篩選，篩選到識別草魚的2對特異性微衛星引物；用這些引物在96個不同來源的草魚DNA樣本中進行驗證，微衛星帶譜穩定；(2)分別將所提的草魚及其它魚類基因組DNA稀釋為40ng/ml；(3)優化引物的退火溫度，並用這些引物對草魚不同群體內個體的基因組DNA進行 PCR 擴增，PCR 反應體系為 20ul :0. 5umol/L 的引物，0. 2 mmol/L 的 dNTP，2 mmol/L 的 Mg2+， IXPCR反應緩衝液，IU的Taq DNA聚合酶；使用這些引物時設置的PCR程序參數為94°C預變性3min, 30個循環94°C變性30s, Ta下退火30s，72°C延伸45s，最後72°C延伸7min ；(4)PCR擴增產物經10%非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，220V穩壓電泳3小時，然後用 0. 1%的AgN03染色lmin，銀染後用21的Na0H、0. 2%無水Na2C03、0. 4%甲醛顯色2min，直至條帶清晰為止，並拍照保存；(5)在84對微衛星引物中篩選到草魚單態性引物59對，佔到所用引物的70%；(6 )用上述單態性弓I物分別對草魚和其它28種魚類按上述條件進行PCR擴增、電泳，篩選出在這些魚類中沒有任何擴增產物的引物，最終將草魚與其他魚類相分開；所述2對特異性引物序列如SEQ ID NO: Γ4所示。
專利摘要
本發明公開了一種利用微衛星技術鑑定草魚的方法。本發明所述用於鑑定草魚的微衛星引物序列如SEQIDNO:1~4所示。本發明從84對鯉科魚類微衛星引物中篩選出2對用於鑑定草魚的特異性微衛星標記，帶型清晰，重複性好，可靠性強，可作為鑑定草魚的特異性引物。本發明方法可以快速準確的將草魚鑑別出來，不受環境條件和發育時期的影響，具有統計簡便等優點。
文檔編號C12Q1/68GKCN102251048SQ201110223437
公開日2011年11月23日 申請日期2011年8月5日
發明者吳瑞全, 吳茜, 李捷, 李新輝, 李躍飛, 楊計平, 王超, 譚細暢, 賴子尼 申請人:中國水產科學研究院珠江水產研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan