瘤細胞侵潤特性測試裝置的製作方法
2023-08-02 19:55:01
專利名稱：瘤細胞侵潤特性測試裝置的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種體外檢測生物細胞侵潤能力的裝置，尤其是能夠檢測瘤細胞侵潤組織和轉移的能力。
背景技術：
惡性腫瘤轉移危及癌患者生命。腫瘤轉移過程包括瘤細胞自瘤組織脫離，在循環系統存活及轉移至其他組織器官生長。在腫瘤轉移過程中，瘤細胞侵潤基底膜是關鍵步驟並在病理學中作為惡性腫瘤的標誌。基底膜是細胞外基質，位於上皮細胞基底部。正常情況下，基底膜作為屏障阻止細胞和大分子通過。而惡性腫瘤細胞可分泌酶降解基底膜，從而穿過基底膜屏障進入鄰近組織。
現有幾種體外檢測瘤細胞侵潤能力的方法。例如厚膠培養法，直接將細胞外基質置於培養皿中形成膠狀物，將瘤細胞置於膠狀細胞外基質表面。瘤細胞可降解細胞外基質並逐漸向培養皿底部移動。該法實驗周期長且僅限於作定性分析。
目前最常用的是玻而登(Boyden)小室方法。該法需預先在一微孔濾膜表面覆蓋一層細胞外基質，然後將下部小室充滿培養液及化學趨向因子，再將微孔濾膜置於下部小室上方，裝配上部小室，然後將上部小室內加入瘤細胞懸液。瘤細胞可降解細胞外基質並穿過濾膜微孔進入下部小室。該法不僅操作步驟繁雜，費時，而且在操作過程中極易丟失侵潤的瘤細胞從而導致定量分析不準確。
改良的多孔細胞培養板插入帶膜小室方法雖然簡化了一些操作步驟，但是仍未解決上述定量分析不準確等缺陷。
實用新型內容本實用新型的目的是提供一種簡單裝置來檢測瘤細胞侵潤能力。使用本裝置操作步驟簡單，瘤細胞培養，分離，染色，計數及分析均在同一載物片上進行，不僅簡化了操作步驟，而且避免了細胞損失，所得結果適用於定量分析。
用於瘤細胞侵潤性測量的該裝置，包括一透明載物片，該載物片包括一個或一個以上測試區，每個測試區包括(1)一片透明微孔濾膜；(2)一層細胞外基質置於濾膜與載物片之間；(3)一層細胞外基質覆蓋於濾膜表面；(4)膠粘物將濾膜周緣與載物片粘連密封；膠粘物在測試區周緣形成一條脊狀突起。
本實用新型解決其技術問題所採取的技術方案是提供一種簡單裝置，該裝置主要包括一透明載物片，上有一個或多個測試區。每個測試區上有一片微孔濾膜，微孔濾膜與載物片之間充含一層細胞外基質，微孔濾膜表面覆蓋一層細胞外基質，微孔濾膜周緣用膠粘物粘在載物片上。由於微孔濾膜上下二層細胞外基質，一般細胞不能從微孔濾膜表面穿過微孔進入到微孔濾膜下面。瘤細胞必須(1)消化吸收微孔濾膜表面細胞外基質，(2)穿過濾膜微孔，(3)消化吸收微孔濾膜下面細胞外基質，(4)移入微孔濾膜與載物片之間細胞外基質層內。此步驟類似體內惡性腫瘤轉移中瘤細胞侵潤基底膜的過程。
本實驗裝置與其他現有定量檢測裝置不同，本裝置中瘤細胞在沒有化學趨向因子存在的條件下穿過微孔進入微孔濾膜與載物片之間的細胞外基質層。未侵入微孔濾膜下方的瘤細胞在實驗過程中被除去。
應用本裝置進行瘤細胞檢測的形式有多種。其一是將分散的瘤細胞與半固體的培養液形成「腫瘤塊」放置於載物片上測試區，其二是將臨床切除的腫瘤碎塊放置於測試區檢測其細胞侵潤能力，還可將單細胞懸液置於載物片上測試區進行檢測。
應用本裝置檢測瘤細胞侵潤能力時，實驗操作均在同一載物片上進行，實驗過程中侵入微孔濾膜下方的瘤細胞均局限於濾膜於載物片之間的細胞外基質層內，其優點為(1)在細胞固定，染色等操作過程中侵入濾膜下方的瘤細胞不會丟失；(2)瘤細胞計數及定量分析更為準確；(3)侵入微孔濾膜下方的瘤細胞均局限於微孔濾膜於載物片之間的平面，利於實驗進行中顯微鏡下觀察細胞侵潤過程；(4)操作步驟簡單，容易掌握。
以下結合附圖和實施例對本實用新型進一步說明。
圖1是本裝置基本結構的透視圖，在載物片上有多個測試區。
圖2是圖1中一個測試區放大的斷面圖。
圖3是本裝置一個測試區包括附加結構---指環狀圓筒的斷面圖。
具體實施方式
圖1中載物片(10)為普通顯微鏡用載玻片，其一側磨砂區(24)用於寫標記。每一測試區(20)包括一圓形微孔濾膜(12)，微孔濾膜周緣以膠粘物(14)粘於載物片(10)上。圖2中載物片(10)與微孔濾膜(12)之間有一層細胞外基質(30)，微孔濾膜(12)表面覆蓋一層細胞外基質(16)。膠粘物(14)在測試區周緣形成一條脊狀突起，其表面塗有一層斥水性物質(18)。圖3中的測試區其中載物片(10)，圓形微孔濾膜(12)，二層細胞外基質(16)，(30)與圖2中相同。其區別在於圖3中膠粘物(14)所形成脊狀突起表面粘著一指環狀圓筒(24)，但是未塗斥水性物質。
本裝置中載物片可用光學玻璃或透明塑料製作，或用普通顯微鏡用載玻片。要求透明，以便於實驗過程中顯微鏡下觀察細胞移動及細胞侵潤現象。微孔濾膜要求表面光滑，與常用細胞染料無著色，不影響生物細胞生長和移動。微孔的孔徑根據細胞大小選擇5-12微米之間。濾膜材料可用聚碳類，纖維素，聚脂類。一般用帶有8微米孔徑的聚碳膜。膠粘物為斥水性物質，可用樹脂。膠粘物所形成的脊狀突起高度在50-500微米之間。圖2中膠粘物表面斥水性物質可用蠟，其目的在於防止測試區的液體外溢。圖3中指環狀圓筒下緣應光滑平整，與測試區邊緣水密性粘和，以便置入細胞培養液。指環狀圓筒下緣與測試區邊緣的粘合力應小於微孔濾膜周緣與載物片之間的粘合力，以便必要時可將指環狀圓筒與測試區分離，而不影響微孔濾膜與載物片的粘合。指環狀圓筒可用塑料，矽橡膠等對細胞無毒性的材料製作，其筒壁高度5-10毫米。
本裝置中微孔濾膜與載物片之間的距離應根據所研究的瘤細胞決定，一般不超過一個細胞的直徑，為5-50微米。即相當於水化後的細胞外基質膜層的厚度。為使微孔濾膜與載物片之間距離均勻一致，可實施下述技術方法。其一是先在載物片上測試區置入均勻厚度的細胞外基質層，然後再將微孔濾膜周緣與載物片粘合。其二是在微孔濾膜周緣與載物片之間放置一個相應厚度的薄墊圈後進行粘合。其三是將每個測試區機械切削出相應厚度的凹陷再將微孔濾膜周緣與載物片粘合。也可直接製作各測試區具有相應厚度的凹陷的載物片。
細胞外基質可用提取的黏膜下基質，或自EHS肉瘤鼠提取的細胞外基質(Matrigel)。由於細胞外基質在4℃時呈液體狀，在37℃時凝結成膠狀，所以在使用細胞外基質充填載物片和微孔濾膜之間及覆蓋微孔濾膜時應在4℃下進行。將細胞外基質用蒸餾水稀釋至一定濃度，然後置入微孔濾膜周緣與載物片之間，形成細胞外基質層。將已稀釋的細胞外基質直接塗在微孔濾膜表面，所形成的細胞外基質層水化後的厚度一般為5-50微米。涉及細胞外基質的操作應在無菌條件下進行。在操作後可於無菌操作臺內自然風乾乾燥。在使用前須預先將細胞外基質層水化。
實施例一此實施例可用於檢測生物活性因子對瘤細胞侵潤性質的影響。其操作過程如下在無菌條件下，預先在圖2所示本裝置的測試區上加蒸餾水使細胞外基質層水化。先將培養的瘤細胞製備成單細胞懸液，再加入一定濃度瓊脂。將此瘤細胞懸液加到測試區。瓊脂逐漸冷卻形成半固體的「瘤細胞塊」。由此造成利於瘤細胞的生長環境。分別將不同濃度的生物活性因子添加到各個測試區。將本裝置放入37℃孵箱進行細胞培養12小時以上。從37℃孵箱取出本裝置，以福馬林液固定細胞，磷酸緩衝液清洗後進行細胞染色。然後用棉籤仔細拭去微孔濾膜表面細胞及瓊脂，殘留在微孔濾膜與載物片之間的細胞即為已侵潤的瘤細胞。可用普通顯微鏡進行計數及分析。
實施例二此實施例可用於檢測抗腫瘤藥物對腫瘤細胞侵潤性質的影響。其操作過程如下在無菌條件下，預先在圖2所示本裝置的測試區上加蒸餾水使細胞外基質層水化。將外科手術切除的腫瘤剪碎成為小碎塊，將數個腫瘤小碎塊加到測試區，再將一定濃度瓊脂覆蓋於測試區，瓊脂逐漸冷卻形成半固體狀。分別將不同的抗腫瘤藥物添加到各個測試區瓊脂表面。將本裝置放入37℃孵箱進行細胞培養12小時以上。從37℃孵箱取出本裝置，以福馬林液固定細胞，磷酸緩衝液清洗後進行細胞染色。然後用棉籤仔細拭去微孔濾膜表面細胞及瓊脂，殘留在微孔濾膜與載物片之間的細胞即為已侵潤的瘤細胞。可用普通顯微鏡進行計數及分析。
實施例三此實施例可用於檢測生物活性因子或抗腫瘤藥物對腫瘤細胞侵潤性質的影響。其操作過程如下在無菌條件下，預先在圖3所示本裝置的測試區上加蒸餾水使細胞外基質層水化。將培養的瘤細胞製備成單細胞懸液，將此瘤細胞懸液加到測試區，並加入適量細胞培養液。將本裝置放入37℃孵箱進行細胞培養6小時以上。從37℃孵箱取出本裝置，吸去細胞培養液，以福馬林液固定細胞，磷酸緩衝液清洗後進行細胞染色。然後將指環狀圓筒自測試區分離。用棉籤仔細拭去微孔濾膜表面細胞及瓊脂，殘留在微孔濾膜與載物片之間的細胞即為已侵潤的瘤細胞。可用普通顯微鏡進行計數及分析。
權利要求1.用於瘤細胞侵潤性測量的裝置，其特徵是該裝置包括一透明載物片，該載物片包括一個或一個以上測試區，每個測試區包括(1)一片透明微孔濾膜；(2)一層細胞外基質置於濾膜與載物片之間；(3)一層細胞外基質覆蓋於濾膜表面；(4)膠粘物將濾膜周緣與載物片粘連密封；膠粘物在測試區周緣形成一條脊狀突起。
2.根據權利要求1所述的用於瘤細胞侵潤性測量的裝置，其特徵是所述透明載物片採用顯微鏡載物片。
3.根據權利要求1所述的用於瘤細胞侵潤性測量的裝置，其特徵是所述微孔濾膜具親水性，可用聚碳膜製作。
4.根據權利要求1所述的用於瘤細胞侵潤性測量的裝置，其特徵是所述微孔濾膜的孔徑在2-12微米之間。
5.根據權利要求1所述的用於瘤細胞侵潤性測量的裝置，其特徵是所述微孔濾膜的孔徑為8微米。
6.根據權利要求1所述的用於瘤細胞侵潤性測量的裝置，其特徵是所述的膠粘物具疏水性，可採用樹脂。
7.根據權利要求1所述的用於瘤細胞侵潤性測量的裝置，其特徵是膠粘物表面塗有一層斥水性物質。
8.根據權利要求1所述的用於瘤細胞侵潤性測量的裝置，其特徵是在膠粘物所形成的脊狀突起的表面粘著一指環狀圓筒，其筒壁高度為5-10毫米。
專利摘要一個測試腫瘤細胞侵潤特性的裝置。該裝置系一載物片上有一個或多個測試區。每個測試區包括一微孔濾膜，微孔濾膜與載物片之間有一層細胞外基質，微孔濾膜表面有一層細胞外基質。在該裝置上可直接作瘤細胞培養，染色並進行瘤細胞侵潤性分析。
文檔編號G01N21/84GK2731444SQ20042007794
公開日2005年10月5日 申請日期2004年7月20日 優先權日2004年7月20日
發明者韓可都, 韓可漢 申請人:韓可都, 韓可漢