聚丙烯酸球刷的活性聚合製備方法及其應用的製作方法

2023-07-04 20:35:01

專利名稱：聚丙烯酸球刷的活性聚合製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及聚丙烯酸球刷的活性聚合製備方法及其應用，尤其涉及一種通過活性聚合合成路線製備聚丙烯酸球刷及其在蛋白高密度固定化中的應用，屬於生物材料技術領域。
背景技術：
活性自由基聚合是上個世紀末在傳統自由基聚合基礎上逐步發展起來的一種聚合技術。目前獲得較好發展的代表性方法有氮氧穩定自由基聚合法(NMP)、原子轉移自由基聚合法(ATRP)和斷裂-加成鏈轉移自由基聚合法(RAFT)。通過活性自由基聚合法得到的聚合物具有可控的分子量和分子量分布，以及活性的端基，因此使得活性自由基聚合法成為合成具有新型結構材料以及實現材料的結構控制的有力手段。球刷是將聚合物鏈的一端連接到球形固相載體表面所形成的複合結構。其中，聚丙烯酸球刷由於具有簡單規整的結構、豐富的羧基功能基團、良好的分散穩定性以及環境響應特性而得到了廣泛的研究與應用。早期主要使用常規自由基聚合法合成聚丙烯酸球刷。近幾年隨著活性自由基聚合技術的發展，活性自由基聚合法逐漸成為合成聚丙烯酸球刷的主要方法。藉助活性聚合技術可以實現對聚丙烯酸毛刷長度的裁製與調控，從而獲得結構更為規整可控的球刷。對現有技術的文獻檢索發現，Rutnakornpituk等在《高分子》第52期987-995頁發表的「用於葉酸偶聯的聚丙烯酸接枝的磁性納米顆粒」(Poly (acrylic acid)-graftedmagnetic nanoparticle for conjugation with folic acid, Polymer,52, (2011),987-995)中報導了利用ATRP法製備了聚丙烯酸球刷並實現了對葉酸的偶聯。由於ATRP法並不適用於包括丙烯酸在內的帶有羧基單體的聚合，因此該文獻採用先聚合丙烯酸叔丁酯，然後在強酸性環境中脫除叔丁基的方法來獲得聚丙烯酸球刷。這種方法雖然能夠獲得聚丙烯酸球刷，但顯然增加了合成步驟，且由於需要在強酸性條件下進行脫保護，因此存在容易弓I起球刷結構破壞、顆粒團聚等問題。RAFT聚合法作為另一種代表性的活性自由基聚合方法，能夠直接聚合丙烯酸，因而更加適合用於製備聚丙烯酸球刷。進一步的文獻檢索發現，Hong等在《材料化學雜誌》第19期5155-5160頁發表的「含有介孔球核與pH響應性殼層的智能納米載體的製備及其在藥物可控攜載和釋放中的應用」(Fabrication of smart nanocontainers with amesoporous core and a pH—responsive shell for controlled uptake and release,J. Mater. Chem.，2009，19，5155-5160)中報導了用RAFT聚合法合成聚丙烯酸球刷。這一工作首先是在介孔氧化矽的外層進行環氧修飾，並通過開環與偶聯反應固定RAFT鏈轉移試劑，然後藉助RAFT聚合成功地在介孔氧化矽外表面形成聚丙烯酸球刷結構。但在這一工作中，RAFT鏈轉移試劑的固定化共涉及三步表面化學反應，其合成路線仍較為繁瑣。因此，本領域的技術人員致力於開發一種採用簡便、高效而通用的活性聚合合成路線來合成聚丙烯酸球刷。

發明內容
有鑑於現有技術的上述缺陷，本發明所要解決的技術問題是提供一種藉助RAFT聚合法合成聚丙烯酸球刷的簡便、高效而通用的新合成路線。 為實現上述目的，本發明提供了一種聚丙烯酸球刷的活性聚合製備方法以及將該聚丙烯酸球刷材料實現在蛋白高密度固定化中的應用及其方法。具體地，本發明首先將RAFT鏈轉移試劑通過一步反應固定到球形固相載體表面；然後，通過RAFT聚合方法在接枝有RAFT鏈轉移試劑的載體表面形成聚丙烯酸毛刷結構，最終得到聚丙烯酸球刷。本發明是通過以下具體技術方案實現的一方面，本發明合成了一種新型結構的RAFT鏈轉移試劑。本發明的RAFT鏈轉移試劑為矽烷化RAFT鏈轉移試劑，由於該RAFT鏈轉移試劑帶有矽烷結構，即RAFT試劑的離去基團帶有矽烷功能基團，因此該矽烷化RAFT鏈轉移試劑可以通過一步反應簡便地固定到球形固相載體表面。本發明的矽烷化RAFT鏈轉移試劑用下述通式(I)表示
\S
O Z廠V、人^R
/ O ' 1
(I)其中=RSC2-C12的直鏈烷基(_CnH2n+1，n = 2-12)、或苄基(-C7H7);例如乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、異戍基、新戍基、正己基、2_甲基羊基、正癸基、或正十_■燒基等。另一方面，本發明提供了一種聚丙烯酸球刷及其合成路線。本發明所述的聚丙烯酸球刷，包括作為聚丙烯酸球刷的球核結構的球形固相載體，該聚丙烯酸球刷為在固相載體的表面接枝聚丙烯酸的毛刷結構。其中，所述球形固相載體的表面帶有羥基功能基團，且能與矽烷化試劑發生偶聯反應。在本發明中，球形固相載體為本領域常用的微球，優選採用《膠體與界面科學雜誌》1968年第26期62-69頁報導的方法製備得到的單分散氧化娃微球。在本發明中，合成聚丙烯酸球刷的路線使用如上所述的矽烷化RAFT鏈轉移試劑，該合成路線包括以下步驟步驟一，製備矽烷化RAFT鏈轉移試劑；步驟二，通過一步法在微球表面接枝步驟一製備得到的矽烷化RAFT鏈轉移試劑；步驟三，通過RAFT聚合方法在接枝有RAFT鏈轉移試劑的載體表面形成聚丙烯酸毛刷結構，最終得到聚丙烯酸球刷。在本發明的具體實施方式
中，步驟一中製備矽烷化RAFT鏈轉移試劑的具體過程如下首先，將R-SH與鹼溶於有機溶劑中，於10_60°C下反應10_60分鐘；然後將二硫化碳逐滴加入該體系中，加完於10-60°C下繼續反應10-60分鐘，溶液變為淡黃色或黃色；再向體系中加入對氯4-苯基三甲氧基矽烷，於10-60°C下繼續反應2-24小時，溶液變為黃色或深黃色，有大量固體析出；濃縮有機相，加入非極性有機溶劑，過濾，將得到的黃色或深黃色液體濃縮後通過柱層析純化，得到矽烷化RAFT鏈轉移試劑。其中，所述鹼與R-SH的摩爾比優選為I : 1-4 ;R_SH與二硫化碳的摩爾比優選為I : 1_4 ;R-SH與對氣4-苯基二甲氧基娃燒的摩爾比優選為I : 1-4。在本發明中，所述鹼優選為氫氧化鈉、碳酸鈉、磷酸鉀或氫氧化鉀等無機鹼。有機溶劑優選為四氫呋喃、乙醇、甲苯、二氯甲烷或丙酮等；非極性有機溶劑優選為二氯甲烷、丙酮或甲苯等。在本發明的較佳實施方式中，步驟一中，濃縮液進行柱層析時淋洗劑為乙酸乙酯(EA)-石油醚(PA)、乙酸乙酯-正己烷、或二氯甲烷-石油醚體系；淋洗劑的配比優選為I 1-100。在本發明的較佳實施方式中，步驟二中通過一步法在微球表面接枝步驟一製備得到的矽烷化RAFT鏈轉移試劑的具體過程如下將微球與矽烷化RAFT鏈轉移試劑分散在乙醇中，通過油浴加熱的方式使體系回流反應24小時，產物經乙醇洗滌後穩定分散在乙醇中，得到表面由矽烷化RAFT鏈轉移試劑修飾的微球。在本發明的另一較佳實施方式中，步驟三中製備聚丙烯酸球刷的具體過程如下
將製備得到的表面由矽烷化RAFT鏈轉移試劑修飾的微球重新分散在N，N- 二甲基甲醯胺(DMF)中，加入丙烯酸、自由的RAFT鏈轉移試劑、偶氮二異丁腈，通過油浴加熱的方式使體系在70°C下發生聚合反應3小時，產物經乙醇洗滌後穩定分散在乙醇中，得到聚丙烯酸球刷。在本發明中，所述自由的RAFT鏈轉移試劑是指與上述矽烷化RAFT鏈轉移試劑結構類似，但不含矽烷功能基團的RAFT鏈轉移試劑。其結構可以是例如C6H5CH2SCS2C2H5'C6H5CH2SCS2C3H7,C6H5CH2SCS2C4H9,C6H5CH2SCS2C12H25 或 C6H5CH2SCS2CH2C6H5,但並不限於上述結構中的一種。另一方面，本發明還提供了一種根據如上所述合成路線所製備得到的聚丙烯酸球刷的應用，尤其提供了該聚丙烯酸球刷材料在蛋白高密度固定化中的應用。本發明的聚丙烯酸球刷材料在實現蛋白高密度固定化中的應用方法，包括以下步驟步驟一，對聚丙烯酸球刷進行活化；步驟二，將蛋白固定在活化後的聚丙烯酸球刷上；步驟三，對步驟二形成的球刷與蛋白的複合物進行洗滌、封閉與保存。在本發明的優選實施方式中，聚丙烯酸球刷材料在實現蛋白高密度固定化中的具體應用方法如下步驟一，將聚丙烯酸球刷重新分散到緩衝液中，加入I-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和琥珀醯亞胺(NHS)，該體系在室溫下混合15分鐘，得到活化後的聚丙烯酸球刷，用該緩衝液洗滌三次；步驟二，將活化後的聚丙烯酸球刷與蛋白在緩衝液中混合，在37°C下恆溫反應2小時，得到球刷與蛋白的複合物；步驟三，首先，用含有對氨基基團具有淬滅作用的封閉液洗滌複合物三次；然後將複合物分散在封閉液中並在4°C下混合過夜；最後，用保存液洗滌複合物三次，最終將複合物分散在該保存液中。在本發明的較佳實施方式中，步驟一中，反應物的用量優選為聚丙烯酸球刷I 2mg/mL, EDC 25mg/mL, NHS 25mg/mL ;步驟二中，可根據球刷羧基的含量加入不同濃度的蛋白以獲得球刷的飽和蛋白結合量，在達到蛋白飽和結合量之前，加入的蛋白均能以共價鍵結合的方式固定到球刷表面。優選地以每100個羧基結合2個蛋白為基準投料量，以該基準反應比附近來估算飽和結合量。在本發明的具體實施方式
中，所述緩衝液是指但不限於10mM的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩衝液，該緩衝液的pH為7. 2 7. 6，含有或不含有O. 05wt. %的吐溫 -20。所述封閉液是指但不限於含有O. lwt. % BSA(牛血清白蛋白)、0· 2wt. % BSA或
O.5wt. %甘氨酸的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩衝液，該封閉液的pH為7. 2 7. 6。所述保存液是指但不限於含有O. lwt. % BSA和O. 05wt. %吐溫-20的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩衝溶液，該保存液的pH為7. 2 7. 6。本發明採用新型的合成方法合成了聚丙烯酸球刷。與傳統合成路線相比，該合成路線大大縮短了合成的步驟與時間，提高了反應效率，並且使得所得到的聚丙烯酸球刷具有較高的接枝密度和羧基含量，為蛋白固定化提供了更多的位點。當將採用本發明方法製備得到的聚丙烯酸球刷用於蛋白的固定化應用時，可實現大幅度提高蛋白固定化能力。經檢測採用本發明合成的聚丙烯酸球刷對鏈黴親和素蛋白(SA)的結合量高達1950 μ g/mg球刷，與已有文獻報導的非球刷結構的聚丙烯酸改性氧化矽微球對SA的固定化能力相比，其對SA蛋白的固定化能力提高了 45倍。以下將結合附圖對本發明的構思、具體結構及產生的技術效果作進一步說明，以充分地了解本發明的目的、特徵和效果。


圖I是本發明的實施例2的RAFT鏈轉移試劑修飾的氧化矽微球的紫外-可見分光光度光譜圖。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。在實施例中，所採用的試劑除另有說明外均為市售商品。其中，微球為採用《膠體與界面科學雜誌》1968年第26期62-69頁報導的方法製備得到的單分散氧化矽微球。實施例I合成矽烷化RAFT鏈轉移試劑
權利要求
1.一種聚丙烯酸球刷的活性聚合製備方法，其特徵在於，包括如下步驟步驟一、合成矽烷化RAFT鏈轉移試劑；步驟二、將所述矽烷化RAFT鏈轉移試劑通過一步反應接枝固定到球形固相載體表面； 步驟三、通過RAFT聚合方法在所述接枝有RAFT鏈轉移試劑的載體表面形成聚丙烯酸 毛刷結構，最終得到聚丙烯酸球刷；其中，所述球形固相載體為表面帶有羥基基團的微球；所述矽烷化RAFT鏈轉移試劑的分子結構如下
2.如權利要求1所述的製備方法，其中，步驟一的具體過程如下將R-SH與無機鹼溶於有機溶劑中，於10-60°C下反應10-60分鐘；然後將二硫化碳逐 滴加入該體系中，加完於10-60°C下繼續反應10-60分鐘；再向體系中加入對氯4-苯基三 甲氧基矽烷，於10-60°C下繼續反應2-24小時；濃縮有機相，加入非極性有機溶劑，過濾，將 得到的液體濃縮後通過柱層析純化，得到矽烷化RAFT鏈轉移試劑；其中，所述無機鹼與R-SH的摩爾比為1 : 1-4 ;R-SH與二硫化碳的摩爾比為1 : 1-4; R-SH與對氯4-苯基三甲氧基矽烷的摩爾比為1 : 1-4。
3.如權利要求2所述的製備方法，其中，所述無機鹼為氫氧化鈉、碳酸鈉、磷酸鉀或氫 氧化鉀；所述有機溶劑為四氫呋喃、乙醇、甲苯、二氯甲烷或丙酮；所述非極性有機溶劑為 二氯甲烷、丙酮或甲苯。
4.如權利要求2或3所述的製備方法，其中，所述濃縮液進行柱層析時淋洗劑為乙酸乙 酯-石油醚、乙酸乙酯-正己烷、或二氯甲烷-石油醚體系，淋洗劑的配比為1 : 1-100。
5.如權利要求1所述的製備方法，其中，步驟二的具體過程如下將所述球形固相載體與矽烷化RAFT鏈轉移試劑分散在乙醇中，加熱回流24小時，產物 經乙醇洗滌後分散在乙醇中，得到表面由矽烷化RAFT鏈轉移試劑修飾的球形固相載體。
6.如權利要求1所述的製備方法，其中，步驟三的具體過程如下將表面由矽烷化RAFT鏈轉移試劑修飾的球形固相載體分散在N，N- 二甲基甲醯胺中， 加入丙烯酸、自由的RAFT鏈轉移試劑、偶氮二異丁腈，在70°C反應3小時，產物經乙醇洗漆 後分散在乙醇中，得到聚丙烯酸球刷；其中，所述自由的 RAFT 鏈轉移試劑為 C6H5CH2SCS2C2H5、C6H5CH2SCS2C3H7、C6H5CH2SCS2C4H9、c6h5ch2scs2c12h25 或 c6h5ch2scs2ch2c6h5。
7.如權利要求1-6任一項所述的方法製備得到的聚丙烯酸球刷。
8.如權利要求7所述的聚丙烯酸球刷在蛋白高密度固定化中的應用。
9.一種如權利要求7所述的聚丙烯酸球刷在蛋白高密度固定化中的應用方法，其特徵 在於，包括如下步驟步驟一，對聚丙烯酸球刷進行活化；步驟二，將蛋白固定在活化後的聚丙烯酸球刷上；步驟三，對步驟二形成的球刷與蛋白的複合物進行洗滌、封閉與保存。
10.如權利要求9所述的應用方法，其特徵在於，具體應用過程如下步驟一，對聚丙烯酸球刷分散在緩衝液中，加入EDC和NHS，室溫下混合後得到活化後的聚丙烯酸球刷，用所述緩衝液洗滌三次；步驟二，將所述活化後的聚丙烯酸球刷與蛋白在所述緩衝液中混合，並在37°C下反應2小時，得到球刷與蛋白的複合物；步驟三，用封閉液洗滌所述複合物；將複合物分散在所述封閉液中並在4°C下混合過夜；然後用保存液洗滌複合物，最終將複合物分散在所述保存液中；其中，所述緩衝液為IOmM的含有或不含有O. 05wt. %的吐溫-20的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩衝液，所述緩衝液的pH為7. 2 7. 6 ;所述封閉液為含有O. lwt. % BSA、0. 2wt. % BSA或O. 5wt. %甘氨酸的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩衝液；所述保存液為含有O. lwt. % BSA和O. 05wt. %吐溫-20的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩衝溶液。
全文摘要
本發明公開了一種聚丙烯酸球刷的活性聚合製備方法及其應用，尤其公開了一種通過活性聚合法製備聚丙烯酸球刷及其在蛋白高密度固定化中的應用。本發明首先合成一種新的矽烷化RAFT聚合鏈轉移試劑，將該RAFT鏈轉移試劑通過一步反應固定到球形固相載體表面後，再通過RAFT聚合法在接枝有該RAFT鏈轉移試劑的載體表面形成聚丙烯酸毛刷結構，得到聚丙烯酸球刷。本發明的聚丙烯酸球刷材料經過活化後，進行蛋白固定得到球刷與蛋白的複合物，從而實現了在蛋白高密度固定化中的應用。本發明的方法大大縮短了聚丙烯酸球刷的合成步驟與時間，提高了反應效率；並使得聚丙烯酸球刷具有較高的接枝密度和羧基含量，為蛋白固定化提供了更多的位點。
文檔編號C07K17/08GK102936321SQ201210438840
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月6日 優先權日2012年11月6日
發明者徐宏, 古宏晨, 瞿振元, 胡鳳麟 申請人:上海交通大學