一種在恆溫熱源下進行聚合酶鏈式反應的方法及裝置的製作方法

2023-07-04 23:12:31

專利名稱：一種在恆溫熱源下進行聚合酶鏈式反應的方法及裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種聚合酶鏈反應方法及裝置。更具體地，本發明涉及基於熱對流建立液體自下而上的溫度梯度的原理，在液體受熱自發進行對流，並在流經不同溫度區域時發生相應PCR擴增的方法，以及相應的裝置。
背景技術：
:聚合酶鏈反應技術(以下簡稱PCR技術)，是一種體外快速擴增DNA的技術，每個循環包括變性、退火和延伸三個過程，每經過一個循環，目的核酸分子的數目擴增一倍，經過30-40個循環，目的核酸分子數目擴增到原來的近IO9倍，PCR是體外大量獲得目的DNA片段的方法，便於對核酸分子做進一步的分析和檢驗。目前，PCR技術已廣泛地應用於基礎研究和應用研究。PCR作為一個「無細胞基因擴增系統」，在基礎研究中可用於克隆基因，並在此基礎上對基因組DNA進 行直接序列分析，檢測突變位點，分析染色體重組等。在應用研究中，則可以用於傳染病的診斷、遺傳疾病的檢測及產前診斷、法醫研究等。美國專利4，683，202 ;4，683，159 ;4，800，159 ;4，965，188 號對 PCR 技術做出了描述。DNA的擴增在體內是由細胞內有關因子的參與下，雙螺旋的DNA分子被解鏈成2條單鏈，在引物酶的作用下合成DNA引物，引物與單鏈DNA鹼基互補配對，形成引物單鏈DNA複合物；在DNA聚合酶作用下，沿著5』 -3』方向，按鹼基互補配對原則，在引物3』端開始，逐一將互補的三磷酸脫氧核苷酸接上，最終形成一條新的雙鏈DNA分子。而DNA分子在體外的PCR擴增模擬了體內的三個步驟:首先，在大約95 °C的高溫下加熱雙鏈DNA樣品，雙鏈間的氫鍵會斷裂，使得DNA熱分解成兩條互補的單鏈DNA分子，這一過程稱為高溫解鏈反應；然後，溫度迅速降到大約50-65°C的範圍內，在這個溫度下單鏈DNA與引物按鹼基互補配對原則結合，這一過程稱為低溫退火反應；退火反應結束後，溫度要迅速升高到72°C左右進行延伸反應，在DNA聚合酶以及適當鎂離子濃度的條件下，從引物的3』端開始結合單核苷酸，從而形成一條新的DNA。經過一個這樣的過程，原來的一個DNA雙鏈分子就形成了兩個DNA分子，增加了一倍。反覆進行高溫解鏈-低溫退火-中溫延伸三個過程， 就可以獲得數量更多的複製雙鏈，並且這些新形成的雙鏈又可以作為下次循環的模板。目前，主流的PCR擴增技術的反應裝置一般以溫控金屬塊加熱塑料製成的PCR反應管，通過金屬塊的加熱、冷卻，達到平衡溫度後將熱通過反應管傳遞至PCR反應液。這種裝置的缺陷是:反應體積較大，即系統通常具有較大的體積和熱容，常規PCR完成30個循環一般需要2-3小時，其中大部分時間消耗於加熱和冷卻過程，即將金屬塊達到平衡溫度並將熱通過反應管傳遞至PCR反應液，因此，PCR難以實現高效和高通量。而為了加快升降溫的速度，也使得PCR儀器製造的困難加大，儀器成本大幅度提高。在此基礎上，20世紀九十年代，研究者們開始將微流控晶片技術應用於PCR擴增。微流控晶片技術是近十年來迅速發展起來的一種新的微型分析系統，它採用微加工技術在釐米尺寸的玻璃、塑料及矽橡膠材料上蝕刻出微米尺寸的反應管道及分析組件，由於各種分析過程可在微米尺寸的結構中完成，一方面可使珍貴的生物試樣與試劑消耗降低到微升生至納升級，另一方面使分析速度成十倍、百倍的提高，實現高通量的檢測。PCR裝置的微型化不僅降低了 PCR樣品的消耗量，而且較低的熱容量顯著提高了系統的熱傳導效率，使PCR反應速度大大加快。目前，PCR微流控晶片系統主要有兩種形式:微室靜態型PCR晶片和連續流動型PCR晶片。前者是傳統PCR的微型化，即將反應混合物固定在反應池中，依賴於溫度控制裝置的溫度循環變化進行熱循環擴增，由於是傳統PCR的微型化，體積和熱容減少，因此反應時間大大減少，能量消耗也大幅度的降低；而後者通過微加工形成逶迤形流路，在一定推動力的作用下，使PCR反應液連續流經三個不同的溫區，完成變性、退火和延伸過程，其優點是其反應溫度無需來回反覆地快速升降。雖然這兩種PCR微流控晶片系統能夠快速、高效擴增目的DNA片段，並已成功的實現了與毛細管電泳分離，實時螢光檢測以及數組晶片雜交等過程的集成化。但前者其實只是傳統PCR的微型化，仍沒有突破依靠加熱、冷卻模塊來反覆升降溫的模式，沒有徹底解決升降溫的耗時長問題；而後者雖然解決了反覆升降溫的耗時問題，卻帶來新的問題，即系統通常包含複雜的液體驅動系統，一方面增加了儀器及反應容器製作的複雜性和成本，另一方面操作比較複雜，限制了其廣泛應用。21世紀初，出現了一種新型的PCR擴增方法，利用自然對流即雷諾-本納德對流原理進行PCR擴增的方法。該技術是將PCR反應液置於一個封閉的柱形反應腔內，反應腔的上下表面分別進行恆溫控制，通常上端溫度為60°C，下端溫度為97°C，通過上下表面的溫差驅動液體經過不同的溫區，實現PCR擴增。這種方法不需要改變器件的溫度，也不需要外加驅動來實現樣品的流動，只需要一個反應腔，並控制控制其上下兩端的溫度為恆溫，就可以實現PCR擴增。但該方法依然存在缺陷:首先，試劑需填滿整個反應腔，需密封，存在潛在的洩漏問題；其次，試劑直接注入反應腔內，導致加熱器與試劑直接接觸，存在潛在的汙染問題。因此，現有技術中迫切需要一種新的聚合酶鏈反應擴增方法以及相應的裝置，以解決其中存在的易汙染、反應不穩定的問題。

發明內容

本發明一方面提供了一種通過聚合酶鏈反應擴增核酸的方法，其中包括:(I)提供一端開口的反應容器，在其中加入核酸擴增反應物；(2)在該開口容器內部或外部提供一個或多個可控制溫度的恆溫裝置，所述恆溫裝置被構造成用於提供高於變性的溫度，和供給或移走熱量控制退火與延伸的溫度，並且通過接觸在反應容器的不同部位，建立管壁和管內空間的上下溫度梯度分布以使管內液體產生穩定的對流；(3)利用管內液體對流進行聚合酶鏈式反應，擴增核酸。在一個實施方案中，所述方法還包括對擴增產物進行檢測，例如進行實時監測。優選地，所述聚合酶鏈反應產物中包含螢光染料或探針，從而能夠進行實時監測。本發明在另一方面提供了一種核酸擴增反應裝置，其中包含:(a)擴增反應容器，其中含有核酸擴增試劑；(b) —個或多個可控制溫度的恆溫裝置；和(c)擴增反應容器間的隔熱裝置；其中通過不同的恆溫熱源接觸在擴增反應容器的上下部位，建立管壁和管內垂直空間的溫度梯度分布。任選地，本發明的裝置還包含:(d)實時檢測裝置，例如螢光檢測
>J-U ρ α裝直。
本發明的出現，解決了現有技術中各種方法的缺陷，它反應速度快；儀器與反應容器製作工藝簡單、成本低廉；操作方便，無須密封，不與加熱器直接接觸，沒有潛在的洩露與汙染問題。在本發明的方法和裝置內，依據熱對流原理，管內的PCR試劑會建立穩定的自下而上的溫度梯度，進而自發驅動試劑產生對流運動，試劑在流動過程中會經過不同的溫度區域，從而達到PCR擴增的目的。在一個優選的實施方案中，在擴增的同時，本發明的特殊裝置可以採集擴增時及擴增後的螢光信號，可取代瓊脂糖凝膠電泳的鑑定步驟，達到實時監測的目的。首先，因不需反覆升降溫，本發明最終將提供一種在機構設計上更為簡單，硬體裝置上更為便宜的方法與裝置，無需傳統PCR儀的諸多複雜機構和電控，如精密溫控的電路板、通過消耗電能來改變溫度的裝置等。因此，基於本發明，我們可提供一種相比現有擴增技術，更容易將核酸擴增與檢測相整合的方法及裝置，本方法架構簡單，易於微型化並且整合為更多功能的複合微型化設備，如晶片上的全系統分析。其次，因不需反覆升降溫，應用本發明裝置進行核酸擴增，相較傳統PCR，本發明不僅省時，且能耗大大降低。第三，不僅可以進行DNA的擴增，本發明也可對核糖核酸(RNA)進行反轉錄。當上下溫控設置相同溫度時，管內試劑因熱傳遞而達設定的均溫，此時反轉錄酶對樣本進行反轉錄；轉錄結束後，重新設置上下溫控，使試管內形成溫度梯度，即可發生熱對流，進行PCR擴增步驟。因此，僅需一次溫度的變化，即可使RNA在一管內發生反轉錄和擴增兩個過程。這個方法的重要之處在於可實現以RNA為遺傳物質的病原體的檢測，先前熱對流核酸擴增技術尚無此類描述。綜上所述，本發明提供了一種比現有技術更加省時且更高效的核酸擴增與檢測技術，克服現有方法因反覆變溫而導致的高耗時高耗能的缺點。本發明可解決的問題及本發明的優點，將在下文和附圖中詳細闡述。
具體實施例方式本發明提供一種通過聚合酶鏈反應擴增核酸的方法，其中包括:(I)提供一端開口的反應容器，在其中加入核酸擴增反應物，任選地所述聚合酶鏈反應產物中包含螢光染料或探針；(2)在該開口容器內部或外部提供一個或多個可控制溫度的恆溫裝置，所述恆溫裝置被構造成用於提供高於變性的溫度，和供給或移走熱量控制退火與延伸的溫度，並且通過接觸在反應容器的不同部位，建立管壁和管內空間的上下溫度梯度分布以使管內液體產生穩定的對流；(3)利用管內液體對流進行聚合酶鏈式反應；以及；(4)任選地對熱對流聚合酶鏈式反應產物進行檢測，例如實時監測。在聚合酶鏈反應管內含有:待檢 樣本核酸、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、反應緩衝液、二價鎂離子、非主要成分的PCR添加劑(如:NP-40，tween-20, DMSO等)和至少兩條與待檢核酸序列特異互補的寡核苷酸引物，以及任選地與雙鏈DNA結合的螢光染料或特異性螢光探針等。其後，用低密度的不易揮發物質(如石蠟油或是各種低熔點的蠟)或採用高透明度的塑料蓋，覆蓋於試劑表面以防止蒸發並使光源穿透。在擴增反應時，在試劑與待測樣本中建立並維持穩定的空間溫度分布，這是通過下述實現的:使不同熱源與反應管緊密接觸進行熱交換，對特定的區域供給熱量或是移走熱量，低溫度的區域在垂直高度上低於高溫度的區域；在反應試管中特定空間溫度分布包含不同的特定空間區域，每個特定空間區域各自發生不同的PCR反應的步驟，所述的特定空間區域具有一定的溫度範圍，其溫度條件適合於:1.變性反應，其中雙鏈DNA解旋成為單鏈DNA;2.退火反應，引物與單鏈DNA的互補區域配對，形成引物-單鏈DNA複合物；3.延伸反應，聚合酶從引物-單鏈DNA配對區域開始逐個將三磷酸脫氧核糖核苷酸摻入，最終形成雙鏈產物。因反應管內建立穩定的溫度梯度分布會導致持續性的熱對流，反應試劑因此反覆循環流動進行變性退火及延伸步驟，30分鐘內即可完成擴增反應。優選地，在本發明的方法中還包括與反應同步的螢光監測步驟。對聚合酶擴增反應進行實時監測是本領域技術人員熟知的技術。理論上PCR擴增的每一個循環可使新生成的雙 鏈DNA拷貝數增加一倍，經過20-30個循環可產生數目很大的雙鏈DNA。然而，PCR擴增反應受引物、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)的消耗以及酶活性等條件影響，細微的條件變化都會影響其擴增產量，反應到一定程度會進入平臺期。用終點法從擴增產物的量來推算PCR反應體系中範本的初始量很難得到可靠的結果。因此，最好的途徑是PCR實時定量，從擴增曲線上升的斜率以及臨界循環數來估計範本的初始量。上世紀90年代初首先出現了 5』核酸酶PCR技術(即TaqMan技術)來實時定量檢測特異性PCR擴增產物；之後，又出現了用溴化乙錠染料實時測定雙鏈DNA的生成量。同時，研究人員開發了螢光探針或TaqMan探針來改善檢測特異性擴增產物的實時定量方法。上世紀末，出現了在晶片上對PCR產物進行實時定量的、均相的、特異性序列檢測。實時定量PCR是在普通PCR基礎上發展起來的，採用針對擴增DNA的螢光染料，使擴增的DNA數量與檢測到的螢光強度呈線性關係，大致得到DNA的擴增曲線。目前基於DNA和螢光染料的實時定量PCR通常有3種方法:TaqMan探針、SYBR Green I/EtBr染料檢測雙鏈DNA的生成量以及分子信標。TaqMan探針是以一段與擴增範本中部序列完全互補的探針的兩端，5』端與產螢光基團(螢光染料)相連，而3』端與螢光猝滅基團(猝滅劑)相連。由於螢光能量轉移，螢光染料的螢光受猝滅劑的影響被猝滅。在PCR過程中，由於DNA聚合酶的5』 -3』外切酶作用，使探針5』端的螢光染料被切斷而脫落至溶液中，螢光染料與猝滅劑之間的距離增大，擺脫了猝滅劑的作用而產生螢光。隨著PCR擴增反應的進行，越來越多的5』端螢光染料被切下，螢光也隨之增強。此方法適用:1、具有高適應性和可靠性，實驗結果穩定重複性好，特異性更高；2、適用於擴增序列專一的體系的檢測；3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測；
4、靶基因的特異序列較短，無論怎樣優化引物設計條件都不能解決；5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現非特異性擴增，對特異性要求較高的定量；6、廣泛用於人類傳染病的診斷和病原定量，在動物病原體基因的檢測，畜禽產品的檢驗檢疫，生物製品的鑑定。SYBR Green I/Etfc染料則可用於檢測雙鏈DNA的生成量。Etfc是實時定量PCR中較常用的螢光染料，它含有一個可嵌入DNA堆積鹼基之間的一個三環平面基團，與DNA的結合幾乎沒有鹼基序列特異性。當染料分子插入後，其平面基團與螺旋的軸線垂直並通過範德華力與上下鹼基相互作用。這個基團的固定位置及其與鹼基的密切接近，導致與DNA結合的染料呈現螢光，其螢光產率比游離溶液中染料有所增加。SYBR Green I染料與DNA結合後螢光增強千倍，超過EtBr50倍，是目前最靈敏的雙鏈DNA螢光染料，它對光穩定性好，不易發生光漂白(即螢光基團在激發態受到光的不可逆破壞)，激發波長494nm，發射波長530nm附近。由於PCR反應不斷產生新的雙鏈DNA，故可用SYBR Green I螢光的增強來實時定量檢測雙鏈DNA的生成量。此方法適用:1、靈敏度高:使用SYBR可使螢光效果增強到1000倍以上；2、通用性好，不需要設計探針，方法簡便，省時，價格低廉；3、通用型方法，在國內外科研中普遍使用；4、高通量大規模的定量PCR檢測；5、專一性要求不高的定量PCR檢測。分子信標實質上是一個首尾序列互補且分別標記螢光基團與猝滅基團的環狀探針。在PCR擴增過程，每個循環的退火階段檢測到PCR反應體系中的螢光信號。在退火階段，PCR擴增產物與分子信標結合產生螢光，而沒有結合的分子信標仍然保持閉合環狀態不發生螢光。隨著PCR循環數目的增加，螢光信號不斷增強，螢光信號的強度與PCR擴增產物的濃度成正比關係。而螢光信號的激發與採集裝置是由光開關數組、自聚焦透鏡和尾纖準直器及變增益微光0/E裝置組成的有機整體，在以16位單片機為核心的電控裝置管理下，能在毫秒級時間內完成多個標本快速均衡掃描檢測，避免了機械掃描方式或CCD掃描方式引起的時間滯後或漸暈誤差。實現標準樣本的高通量實時螢光激發和定量檢測。在本發明中，通過特別設計的聚合酶鏈反應擴增方法和裝置，可以實現PCR擴增和實時監測的效果。在聚合酶鏈反應過程中，當反應管內建立穩定的溫度梯度分布時，試劑會因熱對流物理現象產生持續性與自發性 的循環流動，進行變性退火及延伸步驟。而試劑中的螢光染料含有一個可嵌入DNA堆積鹼基之間的三環平面基團，當染料分子插入後，其平面基團與螺旋的軸線垂直並通過範德華力與上下鹼基相互作用，這種行為幾乎沒有鹼基序列特異性，會隨擴增的進行而不斷嵌入新生成的雙鏈DNA分子中。嵌入基團的固定位置及其與鹼基的密切接近，導致與DNA結合的染料呈現螢光，其螢光產率比游離溶液中染料有所增加，因此通過對螢光信號的採集即可反應擴增狀態。除螢光插入染料，本發明也可借螢光探針來實現螢光檢測的目的，螢光探針是一段與待檢序列完全互補的寡核苷酸，首尾分別標記螢光基團與猝滅基團，受引物的限制，螢光信號被猝滅基團阻擋，因此檢測不到螢光信號。在熱對流循環過程中，試劑會持續性與自發性地進行變性退火及延伸步驟，探針會黏合在序列上後被DNA聚合酶水解，探針斷裂後螢光基團不再受猝滅基團阻擋，發出螢光信號，此時採集器可以接受到螢光訊號，實現實時檢測。隨著試劑熱對流循環數增加，探針不斷被水解，螢光信號不斷增強，螢光信號的強度與PCR擴增產物的濃度成正比關係。優選地，本發明的方法還可以應用於擴增單鏈核糖核酸(RNA)。眾所周知，許多病原體其遺傳物質為RNA (如HIV、HCV、流感等)，利用常規聚合酶鏈反應無法實現一步法快速對其進行擴增。本發明由於特殊設計的程序和設備，可以實現RNA模板的聯合逆轉錄和擴增，解決非DNA樣本的問題，而先前熱對流核酸擴增技術皆無此類描述。該步驟包括:將RT-PCR —步法試劑與待測樣本注入反應試管，反應管內含有:樣本RNA、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、無RNA酶的緩衝液、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、二價鎂離子、非主要成分的PCR添加劑(如:NP-40, tween-20, DMSO等)和至少兩條與標本核酸序列特異性互補的寡核苷酸引物，以及任選地與雙鏈DNA結合的螢光染料或特異性螢光探針。最後用低密度的不易揮發物質(如石蠟油或是各種低熔點的蠟)或採用高透明度的塑料蓋，覆蓋試劑表面以防止蒸發並使光源穿透。以上的試劑注入反應管後，插入本發明的裝置的空洞中，第一步先進行反轉錄反應，設置上下溫控器使其具有相同溫度(35 70°C )，因熱傳遞整管試劑內溫度均一，此條件下可發生反轉錄過程；反轉錄結束後，調節下方的溫度，使其增加至變性溫度(90 99°C )，並因此而形成溫度梯度，發生持續性的熱對流，試劑內的反轉錄酶流經底部會因高溫變性而不再具有轉錄活性，而DNA聚合酶在自發循環流動將以反轉錄出來的DNA作為模板，進行變性退火及延伸的PCR步驟。為實踐上述擴增方法，本發明提供一種應用於熱對流PCR的核酸序列擴增裝置，該裝置提供:不同溫度的熱源，可針對反應管內不同特定區域供給熱量或移走熱量。其中加熱裝置可以保持試管內樣品的穩定溫度分布，而低溫度的區域在垂直高度上低於高溫度的區域；反應試管中空間溫度分布包含不同的特定區域，每個特定空間區域各自執行不同的PCR反應，所述的特定空間區域具有一定的溫度範圍，其溫度條件適合於:
1.變性反應，其中雙鏈DNA解旋成為單鏈DNA ;2.退火反應，引物與單鏈DNA的互補區域配對，形成引物-單鏈DNA 複合物；3.延伸反應，聚合酶從引物-單鏈DNA配對區域開始逐個將三磷酸脫氧核糖核苷酸摻入，最終形成雙鏈產物。因反應管內建立穩定的溫度梯度分布會導致持續性的熱對流，反應試劑因此反覆循環流動進行變性退火及延伸步驟，30分鐘內即可完成擴增反應。在本發明技術中，反應容器內的樣品試劑進行循環流動進行變性退火及延伸步驟，此過程序自動化且自發重複發生，與複雜電子和程控溫度、時間的循環PCR機臺比較，本發明在設計上和成本上有明顯的優勢。本發明還提供一種溫控熱對流聚合酶鏈反應裝置，其中包含:(a)擴增反應容器，例如反應試管，其中可以容納核酸擴增試劑；(b) —個或多個可控制溫度的恆溫裝置，其形狀優選為環狀的，套在反應容器的外面並與之接觸；(C)位於擴增反應容器間的隔熱裝置；以及(d)任選地，實時螢光檢測裝置；通過不同的恆溫熱源接觸在擴增反應容器的上下部位，建立管壁和管內垂直空間的溫度梯度分布。1.擴增反應容器先前熱對流PCR反應腔有兩大主流，一個是將細管(I 0.5mm)兩端接起後形成液體對流腔，另一個是在兩端開口的圓柱體中的空間進行反應。它們的缺點在於細管銜接困難且在試劑裝載時容易產生氣泡，進而影響試劑的正常對流；而兩端開口的圓柱體，為了不讓試劑外漏，其加熱片必須緊貼於開口處，與試劑直接接觸，容易造成汙染問題。本發明的反應容器為一端開口另一端閉口的管狀或柱狀容器，便於試劑加入與吸出，且容易製造，生產成本低可達拋棄式的目的。本發明的容器可以是反應試管的形式，並且可以用任何適當的材料製造，如玻璃(glass)、聚丙烯(PE)、聚醚碸(PES)、丙烯(PP)、聚丙酸酯(PC)、聚碸(PSF)等。2.環狀加熱裝置:先前熱對流PCR皆使用加熱塊平貼在試管上做單面的加熱，即有可能造成受熱不均勻的問題。在本發明則採用環狀加熱的方式，即在一定厚度的加熱片上鑽孔，將反應管套入使其緊密接觸，加熱片熱量通過接觸面傳導至內部試劑，從而達到均勻的溫度。本發明中有兩個環狀加熱裝置，下方環狀裝置提供較高的溫度加熱於試管底部周圍，試劑受熱上浮，同時發生PCR反應中的變性步驟；上浮至上液面時，部分熱量通過上方的環狀加熱片導出，並維持一定的溫度，在該溫度下發生PCR中的退火與延伸的步驟；此時試劑因冷卻而再次下沉，到達底部後重新受熱再次上浮，開始PCR反應的下一個循環。傳統PCR反應時間通常需要2 3小時，為了縮短時間，PCR儀採用熱傳導率高的鍍金/銀塊和致冷晶片，雖達到了目的，但大大增加了儀器成本。本發明使得PCR步驟無須反覆升溫、冷卻，省卻了升降溫步驟的耗時，從而達到快速擴增的目的。針對於具有不同退火溫度的引物，可調整上方環狀加熱裝置的溫度控制熱對流PCR的最佳反應條件。3.隔熱裝置:本發明採用環狀加熱的方式，在一定厚度的加熱片上鑽孔，將反應管分別套入試管上方與底部，使其緊密接觸。本發明中採用絕熱材料將兩塊加熱片中間填滿，其優點為:
a.室溫的變化會影響管內液體對流的流場與速度，本發明的隔熱裝置可以降低外界環境溫度變化對管內流場的影響，維持管內試劑在不同外界條件下一致的反應；b.上下兩個加熱片本身的溫度不同，也會因空氣對流與熱傳導而相互影響，從而導致溫控上的波動，本發明的隔熱裝置可以降低兩塊加熱片間的溫度幹擾，從而維持管內試劑一致的反應；c.試管在加熱過程中也會散發熱量，進而影響相鄰管的溫度分布，本發明隔熱裝置可以阻隔相鄰管間的熱傳導，降低互相的溫度影響，維持管內試劑一致的反應。本發明的隔熱裝置可以使用任何熱傳導係數低的材料，如:玻璃纖維棉、木頭、耐熱泡棉、雲母片、耐熱塑料等等。4.螢光檢測裝置利用螢光染料或探針，PCR擴增產物的量可通過螢光強度進行監測，隨PCR產物增力口，螢光強度增加，以此達到實時與終點檢測的目的。以往PCR為了讓試管完全加熱,用整塊金屬將試管周圍完全包裹，因而螢光的光路配置只能採用上打光與上收光的方式，故大部分的實時定量PCR系統只能把光學系統架於試管上方，限制了硬體的設計。本發明則採用底部環狀加熱的方式，除了可控制接觸試管表面與內部試劑均勻溫度外，激發光源也因此可以安置於試管下方。因此激發光束可以從試管底部中間垂直穿透試劑，當試劑擴增時，激發光與發射光在經過光路中的窄頻濾光碟時，激發光會被屏蔽，從而使上方光學接收受器接收到專一的產物螢光信號；窄頻濾光碟可放置多種濾光片，以便進行多重產物的檢測。本發明的螢光檢測裝置的優點為:以往實時PCR螢光信號採集裝置和激發光發射裝置必須設計在一起，因此需要使用複雜且昂貴的分光濾鏡組將不同的螢光訊號分開。本發明中螢光信號採集裝置和激發光發射裝置可以分開，一方面使得光學路徑上可採用多重方式，如:上打光下收光、下打光上收光、下打光試管側面收光與上打光試管側面收光等，另一方面無需昂貴的分光濾鏡組。
配合本方法的螢光檢測裝置，可以配合擴增設備在擴增過程中實時監測核酸量的變化。通過擴增和檢測設備，可以從含有DNA和/或RNA的待檢測標本中高效擴增靶序列並實現實時螢光檢測。上述方法、目的、優勢和特點將在下面附圖做詳細的闡述，在描述本發明時，當相關的現有技術不會造成本技術要點含混不清時，將不再對相關現有技術進行進一步說明與解釋。


圖1:基於熱對流的核酸序列擴增方法的原理示意圖。圖2:本發明一個實施方案的核酸擴增裝置與螢光檢測裝置橫截面圖。圖3:實施例2的溫度量測，無絕熱裝置時的管內油水接口(Ti)。圖4:實施例2的溫度量測，有絕熱裝置時的管內油水接口(Ti)。圖5:單一溫控(A)，雙溫控⑶與具絕熱方式的雙溫控(C)的管內油水界面(Ti)溫度量測。圖6:電泳結果照片，說明實施例2擴增的結果(與傳統PCR儀比較)。圖7:電泳結果照片，說明不同試劑體積和擴增長度的結果。圖8:電泳結果照片，說明上方不同溫度時的RNA擴增結果。

圖9:電泳結果照片，說明底部不同溫度時的DNA擴增結果。圖10:電泳結果照片，說明實施例2在不同反應時間的結果。圖11:實時螢光紀錄圖，說明實施例2在不同濃度下的螢光擴增曲線圖。(請詳細說明圖11中幾條曲線表示的含義)對圖中重要部分的數字的解釋101:反應管102:片狀加熱器103:上方環狀加熱裝置104:溫度傳感器105:支架106:棒狀加熱器107:激發光源108:底部環狀加熱裝置109:絕熱材料I110:絕熱材料2111:濾光玻璃片112:感光檢測器以下參考附圖詳細說明本發明的一些優選實施方案:圖1顯示基於熱對流物理現象所發明的核酸序列擴增方法的操作示意圖。所描述的實施方案驗證了整個原理的運行，一端開口和一端封閉的反應容器g加入試劑後，插進加熱裝置內，短暫時間內產生環流C，進而形成兩個特定的溫度區域a與b，在圖一的實施方案中，試管與兩個加熱裝置f與d緊密接觸，通過試管壁向樣品特定區域a與b提供或是帶走熱量，此時因試管內建立起了溫度梯度而驅動試劑的流動；絕熱材質e的包埋避免了外界環境溫度和氣流的幹擾，也阻止了管與管之間通過空氣進行熱傳遞而相互影響的問題，提供了一個穩定的熱條件幫助試劑形成穩定且持續的環流，從而執行不同的PCR反應步驟，上述的特定空間區域(a，b)具有一定的溫度範圍，其溫度條件適合於:1.變性反應，其中雙鏈DNA解旋成為單鏈DNA ；2.退火反應，引物與單鏈DNA的互補區域配對，形成引物-單鏈DNA複合物；3.延伸反應，聚合酶從引物-單鏈DNA配對區域開始逐個將三磷酸脫氧核糖核苷酸摻入，最終形成雙鏈產物。因反應管內建立穩定的溫度梯度分布會導致持續性的熱對流，反應試劑因此反覆循環流動進行變性退火及延伸步驟。下面舉例以說明更詳盡的操作。例如，在合適的管狀或柱狀反應容器中注入反應試劑，包括待測標本、DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸、特異性引物、螢光染料、特異性螢光探針、二價鎂離子和其他PCR添加劑。實驗前先設定本裝置的兩個環狀加熱塊的溫度，底部加熱塊溫度設定90 99°C ;上方加熱塊溫度設定45 65°C，此溫度可依照不同退火溫度的引物調整，短暫時間內即可達到設定的穩定溫度。整根試管插入本發明的加熱設備(見圖2)，下方環狀裝置提供較高的溫度加熱於試管底部周圍，試劑受熱上浮，同時發生PCR反應中的變性步驟；上浮至上液面時，部分熱量通過上方的環狀加熱片導出，並維持一定的溫度，在該溫度下發生PCR中的退火與延伸的步驟；此時試劑因冷卻而再次下沉，到達底部後重新受熱再次上浮，開始PCR反應的下一個循環。試劑在一分鐘內即可達到穩定循環，25 30分鐘後即可反應完全。
圖2顯示的是本發明的一個應用熱對流物理現象的PCR核酸序列擴增與檢測裝置，其橫截面圖所示為反應試管、環狀加熱裝置、隔熱裝置、螢光檢測裝置四大構件的相關位置和功用，圖二所示的裝置含有維持不同溫度的熱源裝置，此裝置在絕熱材質的包埋下，避免外界環境溫度和氣流的幹擾，也阻止了管與管之間通過空氣進行熱傳遞而相互影響的問題，提供了一個穩定的熱條件幫助試劑形成穩定且持續的環流，在本具體實施方案，加熱棒106將環狀加熱片108加溫至DNA變性溫度，109為隔熱材料，阻隔熱量的上傳，製冷晶片102可加熱或是冷卻上方環狀加熱片103，利用熱電偶104的溫度回饋，可以讓上方溫度調整以滿足RNA或是不同引物的擴增溫度條件。在加熱過程中，為避免受環境溫度和氣流影響，用絕熱材料(本實施例採用壓克力)將兩塊加熱片中間填滿，降低外界環境溫度變化對管內流場的影響，維持管內試劑在不同外界條件下一致的反應；也降低兩塊加熱片間的溫度幹擾，從而維持管內試劑一致的反應；並阻隔相鄰管間的熱傳導，降低互相的溫度影響，維持管內試劑一致的反應。架子105支撐整個結構，熱對流反應過程中，特異性探針被DNA聚合酶水解或螢光插入染料嵌入雙鏈而發出螢光，通過螢光強度信號的採集來對擴增過程進行實時檢測。本裝置採用底部環狀加熱的方式，激發光束從試管底部中間垂直穿透試劑，當試劑擴增時，激發光與發射光在經過光路中的窄頻濾光碟時，激發光會被屏蔽(111)，從而使上方光學接收受器(112)接收到專一的產物螢光信號；窄頻濾光碟可放置多種濾光片，以便進行多重產物的檢測。本發明的螢光檢測裝置的優點為:以往real-timePCR螢光信號採集裝置和激發光發射裝置必須設計在一起，因此需要使用複雜且昂貴的分光濾鏡組將不同的螢光訊號分開。本發明中螢光信號採集裝置和激發光發射裝置可以分開，一方面使得光學路徑上可採用多重方式，如:上打光下收光、下打光上收光、下打光試管側面收光與上打光試管側面收光等，另一方面無需昂貴的分光濾鏡組。
本發明不局限於圖1與圖2所描述的核酸序列擴增與檢測裝置，加熱方式的改變與容器形狀的改變皆屬於本發明的範疇。圖3是實施例2的溫度量測；在無絕熱裝置時的管內油水接口(Ti)的溫度記錄，在試管中試劑最低溫度位於最高的上液面處，即礦物油和試劑接口的位置，這裡的溫度提供設計引物時退火溫度的一個指針。本發明將T-type的熱電偶極插入此接口上,計算機紀錄 15 分鐘的溫度變化(PC-Based Data Acquisition Unit MX100, Yokogawa, Japan)。當室溫24°C，無隔熱裝置，反應管曝露在空氣中時，其結果顯示該接口平均溫度65.2V，最大溫差2.7°C。圖4是實施例2的溫度量測；在有絕熱裝置時的管內油水接口(Ti)的溫度記錄，在試管中試劑最低溫度位於最高的上液面處，即礦物油和試劑接口的位置，這裡的溫度提供設計引物時退火溫度時的一個指針。本發明將T-type的熱電偶極插入此接口上，用計算機紀錄 15 分鐘的溫度變化(PC-Based Data Acquisition Unit MX100, Yokogawa, Japan)。當反應管處於室溫24°C的環境，有隔熱裝置(本實施例採用壓克力)時，測定結果顯示其平均溫度為64.3°C，最大溫差0.6°C，相比無絕熱裝置的Ti溫差(2.7V )穩定。圖5是實施例2的溫度量測；A組採用單一溫控，只有一環狀加熱片(95°C ) 口熱試管底部組分別有上下兩組環狀加熱片(95°C /65°C )，但兩加熱片中間沒有隔熱裝置；C組有上下兩組環狀加熱片(95°C/65°C )，加熱的同時以隔熱材質將試管包覆。將T-type的熱電偶極插入此接口上，用計算機紀錄15分鐘的溫度變化(PC-Based Data AcquisitionUnit MX100, Yokogawa, Japan)。其結果顯示a.當室溫24°C,只有單一溫控，Ti無法達到65°C且溫差波動大(5.3°C ) ；b.採用上下兩個溫控(95°C /65°C )，當室溫24°C，無隔熱設置時，其結果顯示平均溫度65.2°C，溫差2.7°C ；c.採用上下兩個溫控(95°C/65°C)，當室溫24°C，且有隔熱裝置(本實施例採用壓克力)時，其結果顯示平均溫度64.3°C，溫差0.6°C。經比較，本發明的雙溫控及隔熱裝置可以達到最理想的擴增條件。圖6說明實施例2擴增的結果，實驗前設定兩個環狀加熱裝置的溫度，底部溫度設定95°C ;上方溫度設定65°C。試管內形成相對的高溫區、低溫區與對流區，試劑受熱上浮，同時發生PCR反應中的變性步驟；上浮至上液面時，部分熱量通過上方的環狀加熱片導出，並維持一定的溫度，在該溫度下發生PCR中的退火與延伸的步驟；此時試劑因冷卻而再次下沉，到達底部後重新受熱再次上浮，開始PCR反應的下一個循環。本實例將陽性實驗組和陰性對照組(樣品用水替代)的試劑分別注入反應管內，以少量石蠟油覆蓋試劑表面。將反應管垂直插入加熱裝置的孔洞中，靜置30分鐘。而傳統機臺設定參數如下:95°C 10分鐘；95°C 20秒，65°C 20秒和72°C 30秒，循環35次；最後72°C 7分鐘。總耗時I小時50分鐘。最後分別從管內取2μ I產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。從電泳圖可以看出，本發明裝置與傳統PCR儀擴增片段(169bps)的亮度(P2)相當(Pl);陰性對照組兩種方法(N1、N2)的結果均為陰性，但本發明的引物二聚體弱於傳統PCR儀。在反應時間上本發明比起傳統PCR機臺節省近四倍的時間。圖7說明不同試劑體積與可擴增長度之間的相關性結果，本發明原理是在一反應試管內建立熱對流，即由 溫度梯度差導致液體的密度變化進而引起流體的運動，稱為「自然對流」，這種自發性對流的現象和由驅動設備強制推動的流動是完全不同的。當流場穩定後試劑會形成相似的流動路徑，當路徑越長時，代表反應時間會越長，相當於增加PCR每一步驟(變性、退火、延伸)的反應時間。在本圖中採用2 5mm之間的長度當作反應試管的直徑，當試劑體積為75微升時,試劑完成一個循環需約18 25秒；當試劑體積增加致100微升時，試劑一個循環時間增加至28 33秒。瓊脂糖凝膠電泳圖的結果顯示，當試劑體積只有75微升(1，2)時，產物並不明顯；增加試劑體積到100微升後(3，4)，可以保證長度為300個鹼基對的產物擴增成功。圖8說明實施例2的擴增結果，應用本發明不僅可以對不同長度的DNA擴增，也可對不同長度的RNA擴增。實驗前設定兩個環狀加熱裝置的溫度，底部溫度設定48°C ;上方溫度也設定48°C，此溫度可依不同的需要而調整(42°C 55°C)，五分鐘後即可達到設定的穩定溫度。將陽性實驗組和陰性對照組(樣本用水替代)的試劑分別注射入反應管內，以少量石蠟油覆蓋試劑表面。將反應管垂直插入加熱裝置的孔洞中，靜置20分鐘即完成反轉錄步驟。之後底部溫度調整至95°C，上方溫度調至65°C，開始進行熱對流PCR反應，20分鐘後完成核酸擴增反應。圖中所示3個片段分別為對3個長度的RNA進行擴增的結果，三個片段長度分別為858bp，371bp，175bp。圖9說明底部不同溫度時DNA擴增結果。本實驗設定裝置的兩個環狀加熱塊的溫度，底部分別為90、95與99°C ;上方固定設定65°C，短暫時間內達到設定的穩定溫度後，將整根試管插入本發明的加熱設備，下方環狀裝置提供較高的溫度加熱於試管底部周圍，試劑受熱上浮，同時發生PCR反應中的變性步驟；上浮至上液面時，部分熱量通過上方的環狀加熱片導出，並維持一定的溫度，在該溫度下發生PCR中的退火與延伸的步驟；此時試劑因冷卻而再次下沉，到達底部後重新受熱再次上浮，開始PCR反應的下一個循環。試劑在一分鐘內達到穩定循環，25 30分鐘後反應完全。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，本發明在底部溫度設定90(2)、95(3)與99°C⑷時，皆可以擴增成功，其亮度與傳統機臺相當(I)。圖10說明實施例2在不同反應時間的結果，本實驗標本使用B肝病毒質粒(pHBV-48，GenBank編號NC003977)，濃度為每管10000拷貝，相同試劑和質粒濃度條件下，配置13管。將這13管同時插入本發明的裝置加熱，每隔一定時間點將管子取出插入冰中以停止循環反應，時間點分別為10分鐘(I)、11分鐘⑵、12分鐘(3)、13分鐘(4)、14分鐘
(5),15 分鐘(6),16 分鐘(7),17 分鐘(8),18 分鐘(9),19 分鐘(10)、20 分鐘(11)、25 分鐘
(12)、30分鐘(13)。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，本裝置在反應後第12分鐘即可檢測到明顯的擴增條帶，14分鐘後每個時間點差異性不大，說明20分鐘內即可完成反應，與傳統PCR相t匕，耗時明顯減少。圖11說明實施例3對DNA進行C-PCR擴增並同時進行實施螢光檢測的結果。實驗前設定兩個環狀加熱裝置的溫度，底部溫度設定95°C;上方溫度設定65 °C，此溫度可依不同的引物而調整，五分鐘後即可達到設定的穩定溫度。將陽性實驗組和陰性對照組(範本用水替代)的試劑分別注射入反應管內，以少量石蠟油覆蓋試劑表面。將反應管垂直插入加熱裝置的孔洞中，靜置30分鐘。每隔五分鐘激發光源(480nm LED)打開並持續三秒，收光裝置(cool (XD)鏡頭前裝有530nm濾光玻璃片阻擋藍光通過，以曝光時間200毫秒的參數擷取圖片。30分鐘後反應結束。結果顯示本發明裝置可用於DNA的擴增並進行實時檢測，數據分析顯示本發明裝置用於核酸的定量檢測有很好的線性。
實施例
實施例1:1.材料與方法1.1反應試管一端開口一端封閉的硼玻璃管，直徑範圍在2 5mm,整體長度在10 45mm,夕卜徑在3 6mm,經清洗滅菌後使用。1.2 樣本PCR試劑包含以下成分:2.1pg的HBV DNA樣品、2pmol的169F引物(5，-GCA CGGGAC CAT GCA GAA CCT GCA CGA T-3』，SEQ ID N0:l)、3pmol 特異性探針(FAM5'-TGCTGTACMAACCTTCGGACGGAMCTGCACT-'3BHQ，SEQ ID NO:2)、2pmol 的 169R引物(5』_GCA AGC CAGGAG AMCGG ACT GAG GCC CAC T_3』，SEQ ID NO:3),8 μ I 的 PCR 聚合酶混合液 LightCyclerFastStart DNA Master Hybridization Mixture (Roche, Germany)、4mM 二價續離子，總體積為55 μ 11.3 裝置本發明中熱對流聚合酶鏈反應的擴增與螢光檢測裝置由下列組件構成:數個一端開口一端封口的反應試管、環狀加熱裝置、隔熱裝置、螢光檢測裝置及支撐架，如圖2所示。1.4 流程實驗前設定兩個環狀加熱裝置的溫度，底部溫度設定95°C;上方溫度設定65°C，此溫度可依不同的引物而調整，五分鐘後即可達到設定的穩定溫度。將陽性實驗組和陰性對照組(範本用水替代)的試劑分別注射入反應管內，以少量石蠟油覆蓋試劑表面。將反應管垂直插入加熱裝置的孔洞中，靜置30分鐘。2.結果2.1溫度測量與比較為了驗證兩個環狀加熱裝置和絕熱裝置對管內溫度穩定度的影響，我們採用電偶極的方法來測量管內試劑液面頂端的溫度(Tl)，此溫度的穩定可確保引物的退火與延伸步驟順利進行。當底部溫度設定95°c時，分別在三種不同條件下量測Tl溫度30分鐘:(i)單一溫控，只有底部環狀加熱；(ii)雙溫控，上方環狀加熱(65°C )雙溫控，上方環狀加熱(65°C)，管間用絕熱材料(壓克力)填滿。結果發現只有單一溫控溫度差異達5.3°C，而加入上方環狀溫控後溫度穩定度提高(溫度差異2.7°C )，而加入隔熱裝置的實驗，30分鐘內溫度變化只有0.60C，證明本發明的有效性。2.2擴增結果在電泳條件(1.5%瓊脂糖、150伏特、40分鐘)下，分析熱對流PCR和傳統PCR的擴增產物，結果如圖6。圖上標示P為陽性實驗組，N為陰性對照組；1為傳統PCR儀擴增結果,2為本發明裝置擴增結果。傳統機臺(T3gradient, Biometra, Germany)溫度設定條件為:95°C十分鐘；95°C 20秒，65°C 20秒與72°C 30秒(45循環);72°C 7分鐘；總耗時2小時15分鐘。本發明裝置無需溫度變化，總耗時只需30分鐘。結果顯示本發明裝置與傳統PCR儀擴增片段(169bps)的亮度(P2)相當(Pl);陰性對照組兩種方法(N1、N2)的結果均為陰性，但本發明的引物二聚體弱於傳統PCR儀。

實施例2
1.方法
1.材料與方法1.1 試劑RT-PCR 一步法試劑包括以下成分:RNA樣品5ul，上遊引物IOpmol，下遊引物IOpmol, AccessQuick Master Mix(promega)40ul, AMV Reverse Transcriptase 8u, DEPC水，其他非必要的PCR反應添加劑，總體積80ul。本實施例中擴增了 3套不同產物長度片段(858bp，371bp，175bp)的引物為:CA16-VP1F2:TCCCATTGCAGATATGATT(SEQ ID NO:4)；CA16-VP1R2:GTTGTTATCTTGTCTCTACTAGTG(SEQ IDNO:5)；153Fa:CAAGCACTTCTGTTTCCC(SEQ ID NO:6)；541R:CCCAAAGTAGTCGGTTCC(SEQ ID NO:7)；CAF3:TGTGTTGAACCAYCACTCC(SEQ ID NO:8)；CAR3b:TAGGTAAACAACTCGCATTT(SEQ ID NO:9)。1.2 裝置本發明中熱對流聚合酶鏈反應的擴增裝置由下列組件構成:數個一端開口一端封口的反應試管、環狀加熱裝置、隔熱裝置、支撐架。1.3 流程實驗前設定兩個環狀加熱裝置的溫度，底部溫度設定48°C;上方溫度也設定48°C，此溫度可依不同的需要而調整(42°C 55°C )，五分鐘後即可達到設定的穩定溫度。將陽性實驗組和陰性對照組(樣本用水替代)的試劑分別注射入反應管內，以少量石蠟油覆蓋試劑表面。將反應管垂直插入加熱裝置的孔洞中，靜置20分鐘即完成反轉錄步驟。之後底部溫度調整置95°C，上方溫度調至65°C，開始進行熱對流PCR反應，20分鐘後完成核酸擴增反應，總反應共70分鐘，反應結束後從管內取2 μ I產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。電泳條件:1.5%瓊脂糖、150伏特、40分鐘。2.結果結果如圖8。圖上標示P為陽性實驗組，N為陰性對照組；結果顯示本發明裝置可用於不同產物長度的RNA擴增，陰性對照結果為陰性。實施例31.材料與方法1.1 試劑PCR試劑包含以下成分:以10倍梯度稀釋的HBV全長質粒、2pmol的169F引物(5，-GCA CGG GAC CAT GCA GAA CCT GCACGA T-3，，SEQ ID NO:1)、2pmol 的 169R 引物(5，-GCA AGC CAGGAG AAA CGG ACT GAG GCC CAC T_3，，SEQ ID NO:3)、8μ I 的 PCR 聚合酶混合液 LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Mixture (Roche, Germany) >4mM 二價鎂離子，8ul的Sybr-Gold螢光染料，總體積為80 μ I。1.2 裝置本發明中熱對流聚合酶鏈反應的擴增與螢光檢測裝置由下列組件構成:數個一端開口一端封口的反應試管、環狀加熱裝置、隔熱裝置、螢光檢測裝置及支撐架。1.3 流程實驗前設定兩個環狀加熱裝置的溫度，底部溫度設定95°C;上方溫度設定65°C，此溫度可依不同的引物而調整，五分鐘後即可達到設定的穩定溫度。將陽性實驗組和陰性對照組(範本用水替代)的試劑分別注射入反應管內，以少量石蠟油覆蓋試劑表面。將反應管垂直插入加熱裝置的孔洞中，靜置30分鐘。每隔五分鐘激發光源(480nm LED)打開並持續三秒，收光裝置(cool (XD)鏡頭前裝有530nm濾光玻璃片阻擋藍光通過，以曝光時間200暈秒的參數掘取圖片。30分鐘後反應結束。2.結果結果如圖11。結果顯示本發明裝置可用於DNA的擴增並進行實時檢測，數據分析顯示本發明裝置用於核酸的定量檢測有很好的線性。以上實施例1、2和3中的結果證實:第一、依據本發明的熱對流核酸擴增與檢測裝置可以成功的完成PCR反應。第二、針對RNA的樣本，本發明也可成功的擴增和檢測，並且轉錄與擴增可在同一管內的進行，便與整體的操作，增加實用性，此法重要之處在於許多病原體是以RNA為遺傳物質的，採用本發明可以解決非DNA樣本的問題。對於本領域的研究和操作人員，本發明並不被限制在所述實施案例和附圖，凡圍繞本發明的中心技術思想，可作出多種替代和變化，因此少數的附圖和實施例僅用於舉例說明，不成為限制本發明的依 據。
權利要求
1.一種通過熱對流進行聚合酶鏈式反應的方法，該方法包括: (1)提供一端開口的反應容器，在其中加入核酸擴增反應物，任選地所述聚合酶鏈反應產物中包含螢光染料或探針； (2)在該開口容器內部或外部提供一個或多個可控制溫度的恆溫裝置，所述恆溫裝置被構造成用於提供高於變性的溫度，和供給或移走熱量控制退火與延伸的溫度，並且通過接觸在反應容器的不同部位，建立管壁和管內空間的上下溫度梯度分布以使管內液體產生穩定的對流； (3)利用管內液體對流進行聚合酶鏈式反應；以及； (4)任選地對熱對流聚合酶鏈式反應產物進行檢測，例如實時監測。
2.權利要求1的方法，其中所述恆溫裝置是一個或多個。
3.權利要求1的方法，其中在反應容器內，位於擴增反應物上方加入低密度的不易揮發物質，防止試劑蒸發並使光源穿透。
4.權利要求1的方法，其中所述反應管具有高透明度的密閉蓋，用於防止試劑蒸發並使光源穿透。
5.權利要求1的方法，其中所述擴增反應物內包含有利建立熱對流且不影響反應的化學物質。
6.權利要求1的方法，其中增加擴增反應物體積以增加縱向的試劑反應空間。
7.權利要求1的方法，其中溫度控制方法利用固體、液體、氣體、光線或是微波加熱或冷卻反應混合物。
8.權利要求1的方法，其中還包括進行RNA反轉錄反應。
9.權利要求1的方法，其中反應物在熱對流循環中會有螢光物質插入到的雙鏈DNA中用於監測。
10.權利要求1的方法，其中在熱對流循環中，特異的螢光探針被水解而產生螢光用於監測。
11.權利要求1的方法，其中在熱對流循環中，特異的螢光探針雜交於靶序列上，可用於監測。
12.—種溫控熱對流聚合酶鏈反應裝置，其中包含: (a)擴增反應容器，其中可以容納核酸擴增試劑； (b)一個或多個可控制溫度的恆溫裝置； (c)擴增反應容器間的隔熱裝置；以及 (d)任選地，實時螢光檢測裝置；其中 通過不同的恆溫熱 源接觸在擴增反應容器的上下部位，能夠建立管壁和管內垂直空間的溫度梯度分布。
13.權利要求12的核酸擴增裝置，擴增反應容器為管狀或柱狀，一端開口，另一端封口，優選所述反應容器由選自玻璃、聚丙烯(PE)、聚醚碸(PES)、丙烯(PP)、聚丙酸酯(PC)和聚碸(PSF)等的材料製成。
14.權利要求12的核酸擴增裝置，其中所述隔熱裝置是絕熱材料，優選為任何熱傳導係數低的材料，更優選選自玻璃纖維棉、木頭、耐熱泡棉、雲母片、耐熱塑料等或其組合。
15.權利要求12的核酸擴增裝置，其適用於由反應管下方射入激發光束，在反應管上方由檢測器收光。
16.權利要求12的核酸擴增裝置，其適用於由反應管上方射入激發光束，在反應管下方由檢測器收光。
17.權利要求12的核酸擴增裝置，其適用於由反應管上方射入激發光束，在反應管側面由檢測器收光。
18.權利要求12的核酸擴增裝置，其適用於由反應管下方射入激發光束，在反應管側面由檢測器收光。
19.權利要求12的核酸擴增裝置，其適用於由反應管上方射入激發光束，在反應管上方由檢測器收光。
20.權利要求12的核酸擴增裝置，其適用於由反應管下方射入激發光束，在反應管下方由檢測器收光。
21.權利要求12的核酸擴增裝置，其適用於由反應管側面射入激發光束，在反應管側面由檢測器 收光。
全文摘要
本發明提供一種在恆溫熱源下進行聚合酶鏈式反應的方法及裝置。更具體地，首先，本發明涉及基於Rayleigh-Benard(雷諾本納德)原理，對反應試管特定區域提供或移走熱量，以建立反應管內試劑自下而上的溫度梯度，在反應試劑不均勻受熱下自發進行對流，並在流經不同溫度區域時發生相應PCR擴增的方法。本發明提供一種實現上述方法的反應及實時螢光檢測裝置。
文檔編號C12M1/00GK103173434SQ20111045681
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年12月23日
發明者葛勝祥, 周文彬, 張師音, 陳清瑞, 夏寧邵 申請人:廈門萬泰滄海生物技術有限公司, 廈門大學