基因製劑的製作方法
2023-07-09 06:18:46 1
專利名稱：基因製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及藥物領域，特別是基因治療領域。更具體地講，本發明涉及一種含有基因的製劑。在施用於活體以後，該製劑可穩定地保持基因載體或基因，將其逐漸釋出並在長時期內維持治療效果。該製劑可以在有利時間內中止治療。
背景技術：
基因治療是一個活躍的研究領域，而且對成功治療方法的期望極高。在基因本身作為藥品的基因療法中，對疾病的治療是通過將選定的酶、細胞因子之類的基因轉移到患者的細胞內而進行的。然後所導入的基因在患者體內產生特定物質。這種基因療法可分成兩類。第一類的用意是通過將特定基因整合到患者的基因組內而對該基因進行半永久性表達。另一類的用意是瞬時表達一種基因而不期望該基因整合到基因組中。在後一種類型的基因療法中，通常將利用腺病毒之類的方法，來將編碼能增強抗癌細胞的抗癌免疫力的細胞因子之類的基因轉移到患者體內(Cardiovascular Research，28,445(1994)；Science，256，808(1992)；Gastroenterology，106，1076(1994)；TIBTECH，11，182(1993)；J.Biol.Chem.，266，3361(1991)；Nature Medicine，1，583(1995)；並將其收作參考文獻)。
在利用病毒載體的情況下，儘管基因轉移的效率通常很高，但由於免疫反應而使反覆施藥變得很困難(J.Biol.Chem，269，13695(1994)，Am.J.Respir.Cell Mol.，10,369(1994))。
在J.Controlled Release 33.,307-315(1995)等文獻中披露了一種用膠原來逐步釋放含有有機化合物或蛋白製劑的藥物之製劑。不過，當所披露的和常見的藥物(例如，蛋白類藥物、化學合成的藥物等)保持在膠原凝膠等物質中時，它會在大約1-2天內溶解。
在一種目前被用於基因治療的方法中，包括施用一種基因載體(插入了基因的載體)或直接用基因，該基因載體或基因在施用後馬上接觸細胞，並在基因轉移開始和結束後馬上開始。另外，轉導到細胞中的基因隨著細胞分裂而被稀釋(即其拷貝數減少)，或是通過在細胞中降解而減少。因此，轉移基因的表達僅能維持幾周時間，這段時間對於實施充分治療來說太短了，這是該方法的缺陷之一。因此，必需反覆施用一種基因載體或基因。因而本發明的一個目的是克服上述缺陷，並提供一種能逐步釋放一種基因載體或基因，並可以將治療效果維持很長時間的製劑。
另外，希望一種能夠反覆施用的方法，因為這類方法在利用病毒載體之類的基因治療中是難於實施的。因此，本發明的第二個目的是提供一種能夠在利用病毒載體之類的基因治療中反覆施用的基因製劑。
另外，希望基因在體內的表達能被隨時中止，以確保安全，因為基因能表達幾周時間這長於蛋白製劑的有效期。因此，本發明的第三個目的是提供一種基因製劑，當希望中止治療時，該製劑能夠迅速中止基因轉移。
發明概述本發明人且已檢驗了各種製劑逐步釋放基因載體或基因的能力，並且已發現，當這樣一種製劑-其中，一種基因或插入了基因的載體被混入一種由生物相容性材料製成的載體中-被用於活體內時，該基因出乎預料的可表達很多個月的時間。本發明人還發現，該製劑可以反覆用於活體內，並由此完成了本發明。
因此，本發明具有以下特徵。
(1)一種含有基因的基因製劑，其中，將所述基因或插入了該基因的載體混入一種由生物相容性材料製成的載體中。
(2)如(1)所述的基因製劑，其中，所述生物相容性材料選自膠原、明膠、血纖蛋白、白蛋白、透明質酸、肝素、硫酸軟骨素、殼多糖、乙醯殼多糖、藻酸、果膠、瓊脂糖、羥基磷灰石、聚丙烯、聚乙烯、聚二甲基矽氧烷，乙醇酸、乳酸或胺基酸的聚合物或共聚物，上述生物相容性材料中至少兩種的混合物。
(3)一種含有基因的基因製劑，其中，所述基因或插入了該基因的載體被混入由含有膠原的生物相容性材料製成的載體中。
(4)一種含有基因的基因製劑，其中，所述基因或插入了該基因的載體被混入由膠原製成的載體中。
(5)如上述(1)的基因製劑，其中，當用於活體內時，所述基因製劑中生物相容性材料的含量為0.01-30w/w％。
(6)如上述(1)的基因製劑，其為溶液、懸浮液、含水凝膠、薄膜、海綿狀物、棒狀或球狀形式。
(7)如上述(1)的基因製劑，其中，所述載體選自病毒載體、脂質體載體和融合脂質體載體，該融合脂質體載體融合了一種病毒和一種脂質體。
(8)如上述(1)的基因製劑，其中，所述載體是病毒載體。
(9)如上述(1)的基因製劑，其中，所述載體是一種腺病毒載體。
(10)一種含有基因的基因製劑，其中，將所述基因或插入了該基因的載體混入由生物相容性材料製成的載體中，此載體材料裝在容器中，所述基因載體或基因可透過該容器。
附圖簡介
圖1表示試驗例1和比較例1中血小板數的時程曲線。
圖2表示試驗例1和比較例1的外周血中的HST-1時程曲線。
圖3表示試驗例4和比較例1中血小板數的時程曲線。
圖4是試驗例5中血小板數的時程曲線。
圖5表示試驗例6中膠原對外周血中HST-1數的劑量依賴性。
圖6表示試驗例7和比較例2中血小板數的時程曲線。
發明詳述下面將對本發明做更詳細地說明。
「用於基因插入的載體」可以是任何可將基因轉移到細胞中的任何載體，例如，可包括病毒載體、脂質體載體、融合脂質體等，該融合脂質體中融合了一種病毒和脂質體(Cardiovascular Research，28，445(1994)；Science，256，808(1992)；Gastroenterology，106，1076(1994)；TIBTECH，11，182(1993)；J.Biol Chem.，266，3361(1991)；Nature Medicine，1，583(1995)；這些文獻被收作本文參考資料)。
病毒載體可以是任何能在基因治療中作為普通載體使用的載體，例如，包括腺病毒、腺共生病毒、牛痘病毒、逆轉錄病毒、HIV病毒或皰疹病毒等。可以用常規方法，例如，披露於上述參考文獻中的方法，直接將用於轉移的基因插入病毒載體中而獲得所述基因載體。
脂質體載體可以是任何能在基因治療中作為普通脂質體載體使用的載體，例如，包括通過混合DOTMA、DOPE、DOGS等而獲得的脂質體載體。當採用陽離子型脂質體載體時，向細胞中轉移的效率很高。其中融合了病毒和脂質體的融合脂質體載體的例子，包括融合了仙臺病毒(HVJ日本血凝病毒)和脂質體的融合脂質體病毒等。可以用常規方法，例如，披露於上述文獻中的方法，將用於轉移的基因包裝於脂質體載體或融合脂質體中而獲得基因載體。被包裝的基因可以是任何能在活體內表達該基因的形式，優選在活體內穩定的形式，如質粒等。
可將基因本身保持在本發明的基因製劑中，而不必插入能將基因轉入細胞的「用於基因插入的載體」中。在這種情況下，基因的形式可以是能在活體內表達該基因的任何形式。例如，可將基因插入被稱作表達載體之類的物質中。基因的形式優選在活體內穩定的形式，如質粒等。
用於轉移的「基因」可以是能用於基因治療的任何基因，例如，包括腺苷脫氨酶基因、GM-CSF基因、胸苷激酶基因等。
「生物相容性材料」優選具有高生物相容性並可將基因或基因載體穩定保持在活體內的材料。生物相容性材料的例子包括膠原、明膠、血纖蛋白、白蛋白、透明質酸、肝素、硫酸軟骨素、殼多糖、乙醯殼多糖、藻酸、果膠、瓊脂糖、羥基磷灰石、聚丙烯、聚乙烯、聚二甲基矽氧烷，乙醇酸、乳酸或胺基酸的聚合物或共聚物，兩種或兩種以上上述材料的混合物等。特別優選的生物相容性材料是膠原。也優選將膠原與上述其它生物相容性材料混合。膠原可以是任何膠原，例如，包括可溶於酸的膠原、可由酶溶解的膠原[如發育不全膠原(atelocollagen)等]、可由鹼溶解的膠原、具有修飾的胺基酸側鏈的膠原、橋連膠原、通過遺傳工程產生的膠原等。而具有修飾的胺基酸側鏈的膠原例如包括，丁二醯基或甲基膠原等。橋連膠原例如包括用戊二醛、1，6-己二異氰酸酯或聚環氧化合物等處理過的膠原(Fragrance J.，1989-12，104-109，日本專利(審查過的公開號No.7(1995)-59522))。
可視需要將「添加劑」加入本發明的製劑中，以穩定基因載體等，加速基因向細胞或細胞核中的轉移或調節基因載體等的釋出。添加劑可以是能實現上述目的的任何添加劑，例如，包括蔗糖、甘氨酸、硫酸軟骨素、明膠、白蛋白、細胞因子、高遷移率族蛋白HMG-1和HMG-2的混合物(High Mobility Group-1，-2 Mixture；ExperimentalMedicine，12，184(1994)，BIOTHERAPY，8，1265(1994))、氯喹、聚賴氨酸(Hepatology，22,847(1995))、Transfectam(商標，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)等。
在膠原與其它生物相容性材料或添加劑混合的情況下，膠原含量可以至少為10w/w％，優選至少30w/w％、至少約50w/w％更好，至少70w/w％最好。
所述基因製劑中生物相容性材料的含量因基因載體或基因的大小和種類等，以及生物相容性材料的種類等而異。
在基因製劑被用於活體的條件下，該基因製劑中生物相容性材料的優選含量為0.01-30w/w％，0.05-10w/w％更好，0.05-5w/w％最好。
另外，基因製劑中生物相容性材料的含量因具體製劑而異。例如，在膠原被用作生物相容性材料的條件下，其優選含量範圍將在下文介紹。
當該製劑為凝膠形式時，膠原的優選含量為0.01-25w/w％，0 05-10w/w％更好，0.05-5w/w％最好。不過，當膠原含量為2％或更高時，優選以佔膠原5-900w/w％的量加入添加劑。
當該製劑為薄膜形式時，膠原的優選含量為0.2-30w/w％(為乾燥之前的含量)、0.3-5w/w％更好，0.4-2w/w％最好。不過，當膠原含量為1％或更高時，優選以佔膠原5-900w/w％的量加入添加劑。
當該製劑為固體棒條形式時，膠原的含量優選為10-30w/w％，而且，最好以佔膠原5-100w/w％的量加入添加劑。
本發明的基因製劑並不局限於特定形式。該製劑可以為溶液、懸浮液、含水凝膠、薄膜或海綿狀物。固體形式可以成形為棒條、球形等。不過，優選形式一般為溶液、懸浮液或含水凝膠，儘管該製劑的形式因用於基因插入的載體的種類、大小等而異。
基因製劑是通過將上述基因製劑中生物相容性材料的含量，在該基因製劑被用於活體的條件下，在該基因製劑中維持於上述優選範圍內而獲得。
生產溶液、懸浮液或含水凝膠形式的基因製劑的方法的例子包括(1)將基因載體或基因(以下稱基因載體等)的粉狀物、溶液、懸浮液或凝膠與溶液或凝膠形式的載體混合，視需要向該載體中加入添加劑的方法，(2)使基因載體等的溶液、懸浮液或凝膠，滲入粉末狀的載體中，視需要向該載體中加入添加劑的方法，或(3)使基因載體等的溶液、懸浮液或凝膠滲入海綿狀物的載體中，視需要向其中添加添加劑，並將其捏和在一起的方法。但用於製備本發明基因製劑的方法並不局限於上述方法。
用於製備固體形式的基因製劑的方法的例子包括(1)將基因載體等的粉狀物、溶液、懸浮液或凝膠與溶液或凝膠形式的載體混合，視需要向其中加入一種添加劑並乾燥該混合物的方法，(2)將基因載體等的粉狀物、溶液、懸浮液或凝膠與粉末狀的載體混合，視需要向其中加入一種添加劑並乾燥該混合物的方法，(3)使基因載體等的溶液、懸浮液或凝膠滲入海綿狀形式的載體中，視需要向其中加入添加劑並乾燥該海綿狀物的方法，(4)使基因載體等的懸浮液或凝膠滲入海綿狀物的載體中，視需要向其中加入添加劑，並在靜止或捏和條件下乾燥該海綿狀物，以及視需要加水等之後乾燥該海綿狀物的方法，(5)壓碎並加壓模製用(1)至(4)的方法獲得的固體產品的方法，或(6)將基因載體等的粉狀與粉狀載體混合，視需要向其中加入添加劑，並加壓模製該混合物的方法。但本發明並不限於上述方法。乾燥方法；乾燥溫度和溼度；混合方法；混合溫度和溼度；加壓模製方法；加壓模製時的溼度和壓力；載體溶液和基因載體溶液的溶解速度；以及載體和基因載體溶液混合物的溶解速度；以及pH值可與常規方法相同。
可以根據接受治療的疾病、靶器官等用各種方法施用本發明的基因製劑。例如，可以通過皮下或靜脈內注射施用本發明的基因製劑，或者直接用於病變的靶位點，如腎、肝、肺、腦等。直接用於病變位點能夠進行器官選擇性治療。
根據本發明，當把可生物降解的材料用作生物相容性材料時，無需在施用後將該生物相容性材料從體內取出。另外，還可以反覆給藥。
另一方面，當根據疾病種類或症狀需要進行不連續基因轉移時，可按照實際情況將基因製劑取出，可以中止基因轉移。例如，當基因製劑是固體時，可通過手術等將其取出。當基因治療使用將基因載體等保持在有孔的容器之類中(病毒可以順利通過該孔)，的基因製劑進行時可在治療結束後將所述容器等取出。例如，可以用披露於日本專利申請號3(1991)-120115(國際公開號WO92/20400)中的容器(試管)進行基因治療。
本發明的基因製劑可以逐步釋放基因載體等，同時能在持續釋放期間將插入了基因的載體穩定保持在活體內。因此，通過延遲細胞與載體之間接觸的方式控制基因轉入細胞的時間，從而延遲長一次給藥後的有效基因表達時間。
本發明的基因製劑還能夠反覆施用病毒載體之類的基因載體，否則，由於患者體內中和抗體的出現，而使反覆給藥變得難於進行。
另外，本發明的基因製劑能夠調節基因表達，因為當希望中止治療時可以將該基因製劑取出。
實施例例1將0.9ml含有109pfu(噬斑形成單位)插入了編碼成纖維細胞生長因子HST-1(FGF4)的基因(按照披露於Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，2980-2984(1987)中的方法製備)的腺病毒(Adexl HST-1；Proe.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.91，12368(1994))的培養基與0.1ml發育不全膠原的中性溶液(由KOKEN製備的發育不全膠原植入物2％發育不全膠原溶液)混合製備一種基因製劑。上述腺病毒(Adex1 HST-1)可以按照披露於J.Virol.，54，711-719(1985)或Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，1320(1996)和Cell，13，181-188(1978)中的方法，通過缺失5型腺病毒(ATCC目錄號VR-5)的EIA、EIB和E3部份，將成纖維細胞生長因子HST-1基因插入非增殖型腺病毒基因中而獲得。例2將0.1ml 2％發育不全膠原中性溶液與0.9ml含有109pfu Adex1 HST-1的培養基混合，製備一種凝膠型基因製劑，然後將該混合物保持在37℃。例3通過以下方法製成一種基因製劑冷凍乾燥發育不全膠原中性溶液，獲得海綿狀物；將該海綿狀物切成約5mm的方塊；將該切割過的海綿狀物加入到1ml含109pfu Adex1 HST-1的培養基中，該海綿狀物靜止過夜。例4將例2中製備的凝膠形式的基因進行冷凍乾燥製備一種基因製劑。例5同樣將例3中獲得的基因製劑進行冷凍乾燥，並將該凍幹的海綿狀物壓製成棒狀，再製備出丸狀(即棒狀物的壓製品)基因製劑。例6將一種質粒載體與一種脂質體(DMRIE-C(由GIBCO-BRL生產))混合，然後再將含有該脂質體的溶液與相同體積的發育不全膠原的中性溶液混合，製備一種基因製劑。所述質粒載體是將成纖維細胞生長因子HST-1(FGF4)插入具有巨細胞病毒(CMV)啟動子的表達載體(pRc/CMV)中而獲得的。例7以如下方式製備一種顆粒形式的基因製劑將1ml含有109pfu的Adex1 HST-1的培養基與1ml1％藻酸溶液混合；通過一個噴頭，將所述含有載體的藻酸溶液滴加到0.5％的GaCl2溶液中，以獲得直徑為1mm的顆粒；並通過離心收集上述顆粒。例8以如下方式製備一種顆粒形式的基因製劑將1ml含有109pfu的Adex1 HST-1的培養基與1ml被加熱至45℃的5％瓊脂糖凝膠混合；通過一個噴頭將該混合液滴加到溫度為10℃的磷酸鹽緩衝液中；離心收集所述顆粒。例9將例1中所得到的基因製劑封裝在聚酯製成的袋(由合成血管制成，商標為Micron，由INTERVASCULAR生產)中而製備一種基因製劑。例10與例1相同，將含有109pfu Adex1 HST-1的培養基與發育不全膠原中性溶液混合製成1ml基因製劑，使之在發育不全膠原的終濃度中佔0.1、0.2、0.4、1.0或2.0w/w％。例11用以下方法製備一種凝膠形式的基因製劑將5ml含有濃度為73.25μg/ml的質粒pOG44(購自Stratagene)的水溶液與5g發育不全膠原酸性溶液(含有2％發育不全膠原，PH3.5)混合；將該混合物進行冷凍乾燥，得到海綿狀物；該海綿狀物中加入蒸餾水，使之在發育不全膠原的濃度中佔0.4、2、5、10或20w/w％。例12用以下方法製備一種凝膠形式的基因製劑將5ml含有濃度為73.25μg/ml的質粒pOG44的水溶液與5g或2.5g發育不全膠原酸性溶液混合；將260μl或640μl人血清白蛋白水溶液(80mg/ml)加入該混合物中並混合；將該混合物進行冷凍乾燥，以得到海綿狀物；向該海綿狀物中加入蒸餾水，使之在發育不全膠原和人血清白蛋白的總濃度中佔10w/w％。例13將例11中得到的凝膠狀基因製劑展布在玻璃上並使之逐步乾燥，製成一種薄膜形式的基因製劑。例14將例11或12中獲得的凝膠形式的基因製劑擠壓模製和逐步乾燥以製備一種棒狀形式的基因製劑。比較例1通過腹膜內給藥給小鼠施用1ml含有109pfu Adex HST-1的培養基。然後，大約在用藥後第12天，其血小板數增加約兩倍，而且，這種效果持續到第20-30天。另外，在用藥後第20天，外周血液中HST-1的濃度達到最大值，為50ng/ml。不過，與下面例1的製劑不同，HST-1的濃度不能保持在一個固定水平上，而且在用藥後第60天，血液中檢測不到HST-1。上述結果如圖1和2所示。試驗例1通過腹膜內給藥給小鼠施用1ml例1中製成的基因製劑。在用藥後大約12天時，血小板數增加大約2倍，而且，這一效果持續到第50天以後。另外，在用藥80天以後外周血液中HST-1的濃度仍維持在20ng/ml。上述結果如圖1和2所示。試驗例2通過腹膜內給藥給小鼠施用1.0ml例2中製備的基因製劑。在用藥後大約第12天，其血小板數約增加2倍，而且，這一效果持續到用藥後第60天以後。試驗例3通過腹膜內給藥給小鼠施用一種例3中製成的基因製劑。在用藥後約第12天，其血小板數約增加2倍，而且，這一效果持續到用藥後第60大以後。試驗例4通過腹膜內給藥給小鼠施用例1中製備的基因製劑，並在用藥後第3天將該基因製劑取出。結果，在用藥後約第12天，其血小板數達雙倍，然後，在用藥後約第25天，其血小板數減少，並恢復到正常水平。上述結果如圖3所示。試驗例5通過腹膜內給藥給小鼠施用例1製備的基因製劑，然後在用藥後第3天將該基因製劑取出。在用藥後第20天，再次施用例1中製備的基因製劑。結果，在用藥後大約第12天，其血小板數約達雙倍，在用藥後約第20天，其血小板數減少並恢復到正常水平。在二次給藥後其血小板數馬上又增加約2倍，而且，這一效果能持續到第一次用藥後第40天之後。上述結果如圖4所示。試驗例6通過腹膜內給藥給小鼠施用例10中製備的各5基因製劑，或1ml含有109pfu Adex HST-1但完全不含膠原的培養基。在用藥後第5天，測外周血液中HST-1蛋白的濃度。上述結果如圖5所示。上述數據表明，HST-1蛋白的血清濃度隨著所述製劑中膠原濃度的增加而減少。試驗例7通過腹膜內給藥給小鼠施用1ml含有109pfu Adex HST-1的培養基，結果在用藥後第12天，其血小板數達約2倍，然後，在用藥後第35天左右，其血小板數減少並恢復到正常水平。在第一次用藥後第37天，再次施用1ml例1中製備的含有發育不全膠原的基因製劑。此後，其血小板數馬上增加約2倍，而且，在該實驗的隨後階段一直保持這一效果。上述結果如圖6所示。比較例2通過腹膜內給藥給小鼠施用1ml含有109pfu Adex HST-1的培養基，並在首次給藥後第37天再次給藥。結果，在首次給藥後約第12天，其血小板數約達2倍，然後在用藥後第35天，血小板數降低並恢復到正常水平。在第二次施用Adex HST-1後，其血小板數不再增加。上述結果如圖6所示。
試驗例7和比較例2的結果表明，可以反覆使用例1中製備的基因製劑，這一結果與反覆使用不按本發明方法配製的腺病毒載體時所取得的結果不同，不按本發明配製之物不能反覆服用的原因是由於中和抗體的出現。
權利要求
1.一種含有所需基因的基因製劑，其中將所述基因或插入了所述基因的載體混合進由生物相容性材料製成的載體中。
2.如權利要求1的基因製劑，其中所述生物相容性材料選自膠原、明膠、血纖蛋白、白蛋白、透明質酸、肝素、硫酸軟骨素、殼多糖、脫乙醯殼多糖、藻酸、果膠、瓊脂糖、羥基磷灰石、聚丙烯、聚乙烯、聚二甲基矽氧烷、乙醇酸、乳酸或胺基酸的聚合物或共聚物，以及至少兩種上述生物相容性材料的混合物。
3.一種含所需基因的基因製劑，其中將所述基因或插入了該基因的載體混入由含有膠原的生物相容性材料製成的載體中。
4.一種含有所需基因的基因製劑，其中將所述基因或插入了該基因的載體混入由膠原製成的載體中。
5.如權利要求1的基因製劑，其中當所述基因製劑被用於活體內時，所述生物相容性材料在該基因製劑中的含量為0.01-25w/W％。
6.如權利要求1的基因製劑，其為溶液、懸浮液、含水凝膠、薄膜，海綿狀物、棒狀物或球形形式。
7.如權利要求1的基因製劑，其中所述載體選自病毒載體、脂質體載體、融合脂質體載體，所述融合載體中融合了病毒和脂質體。
8.如權利要求1的基因製劑，其中所述載體是病毒載體。
9.如權利要求1的基因製劑，其中所述載體是腺病毒載體。
10.一種含有所需基因的基因製劑，其中將所述基因或插入了該基因的載體混入由生物相容性材料製成的載體中，該生物相容性載體被盛在所述基因載體或基因可通過的容器中。
11.一種用基因治療活體的方法，包括施用含有所需基因的基因製劑之步驟，其中，將所述基因或插入了所述基因的載體混入由生物相容性材料製成的載體中。
全文摘要
基因製劑,包含所需基因或含整合於其上的所需基因的載體,並含支撐該基因的載體。
文檔編號A61K48/00GK1193916SQ96196463
公開日1998年9月23日 申請日期1996年7月2日 優先權日1995年7月3日
發明者寺田雅昭, 落谷孝廣, 宮田暉夫, 伊藤博 申請人:株式會社高研, 住友製藥株式會社