玉米根部淹水高效表達Zmzf基因的啟動子的製作方法
2023-10-05 18:31:54
專利名稱：玉米根部淹水高效表達Zmzf基因的啟動子的製作方法
技術領域：
本發明涉及玉米根部淹水高效表達Zmzf基因的啟動子，屬植物基因工程技術領 域。
背景技術：
我國南方春玉米和北方夏玉米在正常的栽培季節中，經常遭受洪澇和漬害，玉米 根系長期處於低氧狀態，導致玉米減產10% -40%。創製耐漬玉米新種質的途徑一般有兩 條，一是發掘和利用現有玉米種質或其近緣物種中的有利基因，通過雜交、回交等育種手段 或分子標記輔助選擇等生物技術手段，將耐漬相關基因導入現有優良玉米育種材料中。然 而，玉米及其近緣種耐漬資源的缺乏，至今未培育出耐漬性較強的新種質。二是利用基因工 程技術對玉米進行耐漬性遺傳改良。由於植物耐漬分子機理的複雜性，儘管已經克隆出了 一些與耐漬相關的基因、順式元件及轉錄因子，但仍然不能解決生產中遇到的實際問題。玉米Zea mays bZip factor基因，筒稱為Zmzf■基因(下同)。Zmzf■基因的啟動 子含有厭氧反應相關的ARE和GC-motif順式元件，是典型的厭氧響應啟動子。Zmzf基因啟 動子的克隆，目前尚未見有報導。
發明內容
本發明的目的是從玉米自交系Mol7中克隆玉米根部淹水高效表達Zmzf基因的啟 動子，並利用該啟動子對旱生植物的耐漬性進行遺傳改良。本發明的技術方案是1.玉米自交系Mo 17葉片總DNA的提取取玉米葉片5. 0g於液氮中研磨，轉入50ml離心管中。加預熱至95°C的CTAB 緩衝液(1.17M NaCL、0.0016M EDTA-8. 0,0. 835M Tris-7. 5,1. 6 % CTAB, 1 % 疏基乙 醇)10ml，混勻。在65°C水浴鍋內反應90分鐘，不時輕搖離心管。取出離心管，待冷至室溫 後，加入等體積氯仿異醇(24 1)，小心搖動試管10分鐘。SOOOrpm離心10分鐘，將上 清轉至另一 50ml離心管中。加2/3體積異丙醇，小心混勻，將棉絮狀DNA轉入盛10ml 70% 乙醇的50ml離心管中，浸泡12小時。倒掉70%乙醇，將DNA晾乾，加入1ml TE溶液溶解。 待DNA完全溶解後，轉入2. 0ml離心管中，加入10 yl 10mg/ml RNaseA，混勻；在37°C下， 溫育2小時。再用1ml苯酚氯仿異戊醇(25 24 1)抽提一次，8000rpm離心10分 鍾。將上清液轉入2. 0ml離心管中，加入1/10體積的3M NaAC(pH5. 2)，2/3體積異丙醇沉 澱DNA。將棉絮狀DNA轉入2. 0ml離心管中，用70%乙醇洗滌一次，短暫離心，使DNA貼壁， 倒去70%乙醇，晾乾DNA。待DNA晾乾後，加入0. 5ml TE溶液，完全溶解DNA，於_20°C長期 保存。2. Zmzf基因啟動子的克隆根據Zmzf基因第一個外顯子，設計、合成3個特異性右引物(Bf l、Bf2、Bf3)，分別 與4個簡併引物(AD1、AD2、AD3、AD4)進行TAIL-PCR擴增。回收第三輪的擴增產物，並連接到pGEM-T easy載體上，進行DNA測序。根據測序所得的DNA序列再設計、合成3個特異性 右引物，重複上述實驗，不斷進行TAIL-PCR擴增。當所得序列向前延伸近2Kb左右，將DNA 序列拼接起來，進行生物信息學分析。TAIL-PCR 第一輪擴增2. 5u 1 10XPCR 緩衝液，2 u 1 10mM dNTPs, 1 u 1 lOmM 特 異引物Bfl，liU lOmM簡併引物(AD)，1單位Taq酶，40ng模板DNA，總體積25iU。TAIL-PCR 擴增程序為92°C 3分鐘，95°C 1分鐘；94°C 30秒，65 °C 1分鐘，72°C 2分鐘，循環5次； 94°C 30 秒，25 °C 2 分鐘，Rampingto 72 °C 2 分鐘，72 °C 2 分鐘；94°C 30 秒，65°C 1 分鐘，72 °C 2 分鐘，94°C 30秒，65°C 1分鐘，72 °C 2分鐘，94°C 30秒，44°C 1分鐘，72 °C 2分鐘，循環15次; 72 °C 5分鐘。TAIL-PCR第二輪擴增取第一輪的PCR產物1 ill，再加入39 ill ddH20，稀釋40 倍。2.5iil 10XPCR 緩衝液，2ii 1 10mM dNTPs, 1 u 1 lOmM特異引物 Bf2，1 ii 1 lOmM 簡併引 物(AD)，1單位Taq酶，1 yl稀釋40倍的第一輪TAIL-PCR產物，總體積25 yl。TAIL-PCR 擴增程序為94°C 30秒，65°C 1分鐘，72°C 2分鐘，94°C 30秒，65°C 1分鐘，72°C 2分鐘， 94°C 30秒，45°C 1分鐘，72°C 2分鐘，循環12次；72°C 5分鐘。TAIL-PCR第三輪擴增取第二輪的PCR產物1 iil，再加入9 ill ddH20，稀釋10倍。 2. 5u 1 10XPCR 緩衝液，2ii 1 10mM dNTPs, 1 u 1 lOmM 特異引物 Bf3，1 ii 1 lOmM 簡併引物 (AD)，1單位Taq酶，1 yl稀釋10倍的第二輪TAIL-PCR產物，總體積25 yl。TAIL-PCR擴 增程序為:94°C 40秒，45°C 1分鐘，72°C 2分鐘，循環20次；72°C 1分鐘。3.轉化載體的構建使用帶酶切位點的引物，以玉米自交系Mol7的DNA為模板進行PCR擴增。將PCR 產物與pGEM-T easy載體連接，轉化Escherichia coli DH5 a，生長在含氨苄青黴素、X_Gal 和IPTG的LB固體平板上的白色菌株被分離出來。經PCR檢測，選擇陽性克隆進行DNA測 序，提取所克隆Zmzf基因啟動子序列正確的質粒DNA。使用限制性內切酶酶切質粒，瓊 脂糖凝膠電泳，回收Zmzf啟動子片段。使用相對應的內切酶酶切PBI121載體，將Zmzf基 因啟動子構建到PBI121載體中，構建成pBI121-Zmzf-GUS載體，轉化到農桿菌GV3101菌株
中。
對所克隆的Zmzf基因的啟動子進行DNA測序，其核苷酸序列如下
序列表SEQ ID NO 1
長江大學
玉米淹水誘導高效表達Zmzf基因的啟動子
1
PatentIn version 3. 3
1
2008
DNA
Zea mays
promoter
4
⑴ (2008)
1
gttttgaggtcgattggagttacggattttagttagcaacatttttactaacataacatc60
aatctgtccagtattataaaactgcaatgttttggttttgtgatgattaggagaaggcga120
tttaagcttccacaatcattcattccctctgattgtctactttagcatca180
tacaatcctaaatattatatatcacaagaaaattcataggttctttacacatcagttgtt240
ttagctataaattttagctataaattttagttctatcacatcagttgtttgaatactagt300
tagaactattaaatatagtctaactataaaactaattatatgtataagaactatacggca360
agacaagtcttaagcttaattgatctataataatttgctaatcatagattaattaggctt420
aataattttgactcgtcgtttagtctttatatatgtaattagttttatacttagactata480
tttaatattatgaatttaaatatcccatgagacatgaactaatcttgagtcacgtcaaat540
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actgctagctaatattttgaactaaactttagctagctaaagcttagatatgatgaaact660
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tctattttaaaaaaatgttc3.3.3. C 3.3.3.3.3.3.aaagttatacatagtccttccaccaacgta780
taaaccctattgtagtctgaattataaagggcatgtttggttcagttttttctgaccagc840
ttttctaagaacatgtctgtaaagaaattttggttgtagaaagaatctaaatattatggg900
gattacgtgcggaggaagatgaaatggttcaaaggatccaggacctagaaagcgatggat960
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cttataaaagtactgaaaagctgtggtgtttgatgacagtctatatcatc1080
gtttggtgacgagaagctaaaaaaggtccaaacaaacgtgaccaaaacagcttggccata1140
aagtgcctttttttaccatgattctggtaacctaacgttcttttaacgttcttttacaag1200
cagcttctattgttctcgatgtatcggttaaaaccagatcacaagtaagagaccgtttgt1260
agcaaaaggattggaaggattgaagaggctaaaacctctttattattaaaggggattaag1320
gctaaaatctttctgctatttaaaattaaacatctagggaattttagctcgtttaatccc1380
tcaaatgtttacgatgaaattaatttaacgatacctatttttgtgtcacg1440
tatccggtatcccaaagagaagtccaatacgtagggaaaaaatttggtgcagcactgctg1500
taaaccagagtgtttgcagcccctcacaaaaaagaggatagaccccacccgcagcaacaa1560
aaatgttatctggtggacctgcaggtgaggtctatcctcctttttgtgagaggctgcaaa1620
ccactctggtttgcagcagtgctgcaccaaatttttttccaatacgtatgctgcgaaaac1680
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aaagagagagaaaaaaaggtagtaggcggcaatccaacggcggggacctccgcccgcctc1800
cggcatggaaaaatcgccgcgggggccggcgaggggggcagcttcgtcatttccggcgcc1860
ctcctcctttcctttatctctctccccacgcccccacgtttcgccccccatttcgaagcc1920
caccgaattccctgcgattcctctcccctcgcctcctcgtctccccctagggttagcacc1980
tcgctgcctccgattcaatcataatatg2008
4.轉Zmzf基因啟動子擬南芥植株的獲得
將含pBI121-Zmzf-GUS載體的GV3101農桿菌接種於LB液體培養基，加入利福平
和卡那黴素至終濃度為100mg/L，28°C振蕩培養。離心收集菌體，用ddH20稀釋至0D = 0. 8，每IOOml菌液加入5. Og蔗糖和50 μ 1 Silwet L-77。使用f Ioraldip方法對擬南芥進行侵 染，成熟後收穫種子，將種子播在含100mg/L卡那黴素的MS固體篩選培養基上。從篩選培 養基中長出的抗性植株，經PCR檢測後確定為轉Zmzf基因啟動子陽性植株。5. Zmzf基因啟動子活性的檢測 在擬南芥苗期進行淹水處理，將正常生長和淹水處理的轉基因擬南芥幼苗進行 GUS染色。結果發現，在正常生長條件下，轉Zmzf啟動子擬南芥植株的根和葉片，未出現GUS 染色的藍色；而淹水條件下，轉Zmzf基因啟動子擬南芥的根呈現較強的GUS藍色，葉片未見 ⑶S藍色。研究表明Zmzf基因啟動子既是一個在根中表達的組織特異型啟動子，同時也是 一個淹水誘導表達的誘導型啟動子。利用本發明所提供的Zmzf基因的啟動子，與抗蟲、抗病、抗逆等目的基因連接，並 用於旱生植物的遺傳轉化，在淹水、澇漬條件下，可提高轉基因植株根部的抗蟲、抗病、抗逆 境等能力；同時該啟動子只在根部表達，不涉及食用轉基因植物地面以上部分的食品安全 問題；Zmzf基因啟動子在旱生植物的耐漬遺傳改良中，具有很好的應用前景。
具體實施例方式把Zmzf基因的啟動子克隆到轉化載體上，其後連接一個Tnos終止子，構建成一個 轉化載體。將所轉化的目的基因以正確的方向，克隆到Zmzf基因啟動子與Tnos終止子之 間，構建好轉化載體。然後通過基因槍轟擊法或農桿菌介導法將目的基因轉化到受體細胞 中，通過組織培養等技術手段獲得轉基因植株。在澇漬、淹水條件下，Zmzf基因啟動子可以 啟動促進下遊目的基因在植株根部的高效表達。
權利要求
玉米根部淹水高效表達Zmzf基因的啟動子，其特徵在於啟動子的核苷酸序列如SEQID NO1所示。
2.根據權利要求1所述的玉米根部淹水高效表達Zmzf基因的啟動子，其特徵在於所述 的啟動子是從玉米自交系Mol7中克隆獲得的。
3.根據權利要求2所述的玉米根部淹水高效表達Zmzf基因的啟動子，其特徵在於在澇 漬、淹水等厭氧條件下，所述的啟動子可以啟動促進下遊目的基因的高效表達。
全文摘要
本發明屬植物基因工程技術領域，其特徵是從玉米自交系Mo17中克隆獲得一種玉米根部淹水高效表達Zmzf基因的啟動子，該啟動子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示；利用本發明所提供的Zmzf基因的啟動子，與抗蟲、抗病、抗逆等目的基因連接，並應用於旱生植物的遺傳轉化，在澇漬、淹水等厭氧條件下，可以促進下遊目的基因的高效表達，提高轉基因植株根部的抗蟲、抗病、抗逆境等能力；同時該啟動子只在根部表達，不涉及食用轉基因植物地面以上部分的食品安全問題；因此，本發明在旱生植物的耐漬遺傳改良中具有很好的應用前景。
文檔編號C12N15/11GK101864416SQ20091008203
公開日2010年10月20日 申請日期2009年4月17日 優先權日2009年4月17日
發明者張祖新, 杜何為, 許先鳳, 黃敏 申請人:長江大學