利用奇異變形桿菌製備生物絮凝劑的方法

2023-07-21 12:41:01

專利名稱：利用奇異變形桿菌製備生物絮凝劑的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物絮凝劑的製備方法，具體涉及一種利用奇異變形桿菌製備生物絮凝劑的方法。
背景技術：
絮凝劑是一類可使液體中不易沉降的懸浮顆粒凝聚沉澱的物質，廣泛應用於工業水處理、生活汙水處理以及食品生產和發酵工業等。絮凝劑一般可分為三類①無機絮凝劑，如硫酸鋁、聚合氯化鋁、硫酸亞鐵和明礬等；②人工合成有機高分子絮凝劑，如聚氧化乙烯、聚苯乙烯磺酸鹽、聚丙烯醯胺衍生物和聚乙烯亞胺等；③天然有機高分子絮凝劑，如纖維素、澱粉、聚氨基葡萄糖、藻蛋白酸鈉和生物絮凝劑等。許多無機絮凝劑由於其良好的絮凝效果和較低成本而被廣泛應用，然而人們已經發現它們在使用過程中存在著較大的不安全性和潛在的二次汙染問題。人工合成有機高分子絮凝劑中使用較多的聚丙烯醯胺，因其單體具有強烈的神經毒性和致癌性，所以使用受到了限制。此外，大部分天然有機高分子絮凝劑存在絮凝活性較弱和使用成本較高等缺點。
生物絮凝劑是由微生物產生的可使液體中不易沉降的固體懸浮顆粒、菌體細胞及膠體顆粒等凝聚沉澱的特殊高分子物質。生物絮凝劑是通過微生物發酵、分離提取而得到的新型、高效、可生物降解的水處理劑，它能夠滿足絮凝劑使用安全、絮凝活性高、無二次汙染的要求，對改進絮凝沉澱法工藝和絮凝劑產品的生產，保護人類健康和環境都具有很重要的意義。是一種綠色水處理劑，具有廣闊的開發與應用前景。
目前已有一些關於生物絮凝劑產生菌的報導，涉及到細菌、真菌和藻類等。1984年，Fattom A.等利用從排水渠內獲得的絲狀藻青菌(Phormidium J-1)研製出對斑脫土有良好絮凝效果的高分子生物絮凝劑。1986年，Kurane R.等人研究活性汙泥法處理酞酚酯廢水時發現紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)，用特定的培養基和培養條件研製出了微生物絮凝劑NOC-1，該產品可用於畜產廢水處理、膨脹汙泥的沉降、瓦廠廢水及紙漿廢水處理。後來，Nakamura J.等又用醬油麴黴(Aspergillus sojae)製備出了生物絮凝劑AJ7002；Takagi H.利用擬青黴屬微生物(Paecilomyces sp.I-1)研製出了生物絮凝劑PF101。近幾年國內研究者也發現了一些能產生絮凝劑的菌株陸茂林從土壤和汙泥中篩選出兩株絮凝活性較高的諾卡氏菌，並對其適宜培養基、培養時間和培養液pH變化與絮凝活性之間的關係進行了研究；宮小燕從汙水處理廠活性汙泥中分離篩選到1株具有穩定絮凝性狀的菌株，經初步鑑定為假單胞菌屬(Paseudomonas sp.GX4-1)，對影響該菌所產MBF的絮凝活性條件進行了初步研究；何寧等研究了穀氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)產生新型蛋白聚糖類生物絮凝劑REA-11的途徑。但是，迄今為止，在國內外尚未見有關奇異變形桿菌製備生物絮凝劑的報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種利用奇異變形桿菌製備生物絮凝劑的方法。該方法工藝簡單，易於控制，周期短，無汙染，所產生絮凝效具有高效、無二次汙染等優點，可廣泛應用於水處理和汙泥濃縮。
為達到上述目的，我們從多個汙水處理廠的混合活性汙泥中篩選出一株具有產生生物絮凝劑功能的奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)。該菌種產絮凝劑的製備請參閱發表在「中國給水排水」2007年第9期第24-27頁「高效微生物絮凝劑用於汙泥脫水及其動力學研究」。採用種子液接種的方法，使奇異變形桿菌能夠迅速在生產培養基中開始生長代謝，縮短啟動時間。該菌能在我們特製的廉價生產培養基中良好生長，並產生絮凝效率在90％以上的高效生物絮凝劑。其培養溫度為25～30℃的常溫；搖床轉速為120～140r/min，比大部分文獻報導的要慢，節省動力費用；培養時間為1～2天，比大部分文獻報導的要少近1天的時間。用該菌種製備得到的生物絮凝劑主要成分為酸性多糖和蛋白質，可生物降解。該生物絮凝劑對染料廢水脫色率在90％以上，對剩餘汙泥脫水率達82％，在同等劑量下均優於聚合氯化鋁(PAC)和聚丙烯醯胺(PAM)的處理效果。
本發明的具體工藝如下。A、菌種的斜面保藏及轉種，保藏菌種的斜面培養基的組成(g/L)牛肉膏3～5，瓊脂15-20，蛋白腖8～12，NaCl4～6，pH7.0～7.2，滅菌(115～121℃，20～30min)。在無菌操作環境中，將菌種接到斜面培養基上，在恆溫培養箱中25～30℃下培養1～2天後，在冰箱內2～6℃下保藏。以後每過1個月左右將菌種轉移至新鮮的斜面培養基上。B、種子液的製備，將菌種轉移至新鮮的斜面培養基上，在恆溫培養箱中25～30℃下培養1～2天後，在冰箱內2～6℃下保藏1～2天。在無菌操作環境中，將斜面上的菌種轉移至種子培養基(通用發酵培養基)中。種子培養基的組成(g/L)葡萄糖18～22，尿素0.4～0.6，酵母膏0.4～0.6，K2HPO44～6，KH2PO41～3，NaCl 0.05～0.2，(NH4)2SO40.1～0.3，MgSO4·7H2O 0.1～0.3，pH 6.8～7.2，滅菌(115～121℃，20～30min)。將接種後的種子培養基放入搖床培養箱中培養，溫度為25～30℃，搖床轉速為150～170r/min，時間為2～3天。將種子液保藏在冰箱內2～6℃下1～2天，備用。C、液態生物絮凝劑的製備及絮凝率的測定，在無菌操作環境中，將種子液按1～20‰的比例接種至生產培養基中。將接種後的生產培養基在搖床培養箱中培養，溫度為25～30℃，搖床轉速為120～140r/min，時間為1～2天。菌種的生產培養基中發酵，通過離心機離心分離(4000～6000r/min，20～40min)，除去沉澱，上清液即為液態生物絮凝劑，在冰箱內2～6℃下保藏。生物絮凝劑絮凝率E檢測方法向100ml比色管中加入0.4g高嶺土，3ml的1％CaCl2溶液和2ml離心上清液，然後加蒸餾水至100ml，蓋上磨口塞，將比色管作10個上下的自然翻轉，轉速以每次翻轉時氣泡上升完畢為準，翻轉結束後，靜置5min。取比色管中50ml處的處理液，用島津UV-1700型紫外可見分光光度計在550nm的波長下測定吸光度(A)。同時以2ml新鮮通用發酵培養基代替離心上清液，其它操作條件完全與離心上清液相同的實驗作為對照，測其吸光密度(B)。絮凝率E計算式如下E=B-AB100]]>式中E-絮凝率(％)；A-加離心上清液處理後的高嶺土懸液吸光度(A)；B-對照實驗測得的吸光度(B)。
D、生物絮凝劑的提取純化，向液態生物絮凝劑中加入2～3倍體積的無水乙醇，在冰箱內2～6℃下靜置過夜，再用離心機離心分離(1000～4000r/min，20～40min)；傾去上清液，往沉澱中加入再加入2～3倍體積的無水乙醇，重複上面步驟1～3次。將沉澱物重新溶解於去離子水中，加入濃度約為2％十六烷基三甲基溴化銨(CPC)直至無沉澱產生，再經離心分離得沉澱物備用；將沉澱重新溶解於2～3％的NaCl溶液中，加入2～3倍體積的無水乙醇，混合均勻，在冰箱內2～6℃下靜置過夜，離心得沉澱物，把沉澱物真空冷凍乾燥得生物絮凝劑純品。
本發明與現有的技術相比，具有以下優點和效果1、由於本發明採用多個汙水處理廠的混合活性汙泥中篩選出一株具有產生生物絮凝劑功能的奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)，並採用種子液接種的方法，使奇異變形桿菌能夠迅速在生產培養基中開始生長代謝，因此與以往直接從斜面將菌接種至產絮凝劑培養基中相比，縮短啟動時間。
2、由於本發明的生產培養基中的碳源和氮源分別為葡萄糖和蛋白腖，葡萄糖用量僅為通用發酵培養基中的一半，蛋白腖的市價至少比通用發酵培養基中牛肉膏和酵母膏便宜一半，培養基成本低廉，因此本發明的製備成本低廉。
3、本發明的奇異變形桿菌培養溫度為25～30℃的常溫；培養時間為1～2天，比大部分文獻報導的要少近1天的時間，因此，製備生物絮凝劑發酵周期短。
4、本發明的奇異變形桿菌製備生物絮凝劑的搖床轉速為120～140r/min，比大部分文獻報導的要慢，因此，節省了動力費用，降低了成本。
5、本發明的絮凝率E測定時，不依據蒸餾水而以新鮮生產培養基作空白，排除了培養基本身絮凝作用對絮凝活性的影響，更準確地反映了生物絮凝劑的絮凝能力。
6、本發明的奇異變形桿菌能在我們研製的廉價生產培養基中良好生長，並產生絮凝效率在90％以上的高效生物絮凝劑。
7、本發明的奇異變形桿菌所產的生物絮凝劑主要成分為酸性多糖和蛋白質，可生物降解，使用後無二次汙染。
8、本發明的奇異變形桿菌所產生物絮凝劑對印染廢水脫色率在90％以上，對剩餘汙泥脫水率達82％，在同等劑量下均優於聚合氯化鋁(PAC)和聚丙烯醯胺(PAM)的處理效果，具有良好的推廣使用價值。


圖1為奇異變形桿菌所產的生物絮凝劑提取純化後的掃描電鏡圖。
具體實施例方式
實施例1本實施方式按照下面步驟進行A、菌種的斜面保藏及轉種保藏菌種的斜面培養基的組成(g/L)是牛肉膏5，瓊脂20，蛋白腖12，NaCl 6，pH7.2，滅菌(121℃，30min)。在無菌操作環境中，將奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)菌種接到斜面培養基上，在恆溫培養箱中30℃下培養2天後，在冰箱內6℃下保藏，1天之內用掉。
B、種子液的製備在無菌操作環境中，將斜面培養基上菌種轉移至種子培養基(通用發酵培養基)中。種子培養基的組成(g/L)葡萄糖22，尿素0.6，酵母膏0.6，K2HPO46，KH2PO43，NaCl 0.2，(NH4)2SO40.3，MgSO4·7H2O 0.3，pH7.2，滅菌(121℃，30min)。將接種後的種子培養基放入搖床培養箱中培養，溫度為30℃，搖床轉速為170r/min，時間為3天，保藏在冰箱內6℃下，1天之內用掉。
C、液態生物絮凝劑的製備在無菌操作環境中，將種子液按2‰的比例接種至生產培養基中。生產培養基組成(g/L)葡萄糖12，蛋白腖1.2，MgSO40.3，K2HPO46，KH2PO43，pH7.0，滅菌(121℃，40min)。將接種後的生產培養基放入搖床培養箱中培養，溫度為30℃，搖床轉速為140rpm，時間為2天。用離心機將發酵液離心分離(6000r/min，40min)，除去沉澱，上清液即為液態生物絮凝劑。
生物絮凝劑絮凝率E檢測方法向100ml比色管中加入0.4g高嶺土，3ml的1％CaCl2溶液和2ml離心上清液，然後加蒸餾水至100ml，蓋上磨口塞，將比色管作10個上下的自然翻轉，轉速以每次翻轉時氣泡上升完畢為準，翻轉結束後，靜置5min。取比色管中50ml處的處理液，用島津UV-1700型紫外可見分光光度計在550nm的波長下測定吸光度(A)。同時以2ml新鮮通用發酵培養基代替離心上清液，其它操作條件完全相同的實驗作為對照，測其吸光密度(B)。絮凝率E計算式如下E=B-AB100]]>式中 E-絮凝率(％)；
A-加離心上清液處理後的高嶺土懸液吸光度(A)；B-對照實驗測得的吸光度(B)。
測得液態生物絮凝劑的絮凝率為93.13％。
D、生物絮凝劑的提取純化向液態生物絮凝劑中加入3倍體積的無水乙醇，冰箱內4℃靜置過夜，再用離心機離心分離(4000r/min，40min)；傾去上清液，往沉澱中加入3倍體積的無水乙醇，重複上面步驟3次。將沉澱物重新溶解於去離子水中，加入濃度為2％十六烷基三甲基溴化銨(CPC)直至無沉澱產生，再經離心分離得沉澱物；將沉澱重新溶解於3％的NaCl溶液中，加入2倍體積的無水乙醇，混合均勻，在冰箱內4℃靜置過夜，離心得沉澱物，把沉澱物真空冷凍乾燥得生物絮凝劑純品。經電鏡掃描，見圖1，本發明的生物絮凝劑主要形態為杆狀的，相互之間空隙小，有利於水中懸浮顆粒的沉降，因此絮凝效率高達93.13％。
實施例2A、菌種的斜面保藏及轉種保藏菌種的斜面培養基的組成(g/L)牛肉膏3，瓊脂15，蛋白腖8，NaCl 4，pH7.0，滅菌(115℃，20min)。在無菌操作環境中，將奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)菌種接到斜面培養基上，在恆溫培養箱中25℃下培養1天後，在冰箱內2℃下保藏，1天之內用掉。
B、種子液的製備在無菌操作環境中，將斜面培養基上菌種轉移至種子培養基(通用發酵培養基)中。種子培養基的組成(g/L)葡萄糖18，尿素0.4，酵母膏0.4，K2HPO44，KH2PO41，NaCl 0.05，(NH4)2SO40.1，MgSO4·7H2O 0.1，pH 6.8，滅菌(115℃，20min)。將接種後的種子培養基放入搖床培養箱中培養，溫度為20℃，搖床轉速為150r/min，時間為2天，保藏在冰箱內2℃下，1天之內用掉。
C、液態生物絮凝劑的製備在無菌操作環境中，將種子液按1‰的比例接種至生產培養基中。生產培養基組成(g/L)葡萄糖8，蛋白腖0.8，MgSO40.2，K2HPO44，KH2PO41，pH6.8，滅菌(115℃，20min)。將接種後的生產培養基放入搖床培養箱中培養，溫度為20℃，搖床轉速為150rpm，時間為2天。用離心機將發酵液離心分離(4000r/min，20min)，除去沉澱，上清液即為液態生物絮凝劑。生物絮凝劑絮凝率E檢測方法同實施例1相同，測得液態生物絮凝劑的絮凝率為92.88％。
D、生物絮凝劑的提取純化向液態生物絮凝劑中加入2倍體積的無水乙醇，冰箱內2℃靜置過夜，再用離心機離心分離(1000r/min，20min)；傾去上清液，往沉澱中加入2倍體積的無水乙醇，重複上面步驟1次。將沉澱物重新溶解於去離子水中，加入濃度為2％十六烷基三甲基溴化銨(CPC)直至無沉澱產生，再經離心分離得沉澱物；將沉澱重新溶解於2％的NaCl溶液中，加入2倍體積的無水乙醇，混合均勻，在冰箱內2℃靜置過夜，離心得沉澱物，把沉澱物真空冷凍乾燥得生物絮凝劑純品。經電鏡掃描，見圖1，本發明的生物絮凝劑主要形態為杆狀的，相互之間空隙小，有利於水中懸浮顆粒的沉降，因此絮凝效率高達92.88％。
權利要求
1.利用奇異變形桿菌製備生物絮凝劑的方法，其特徵在於A、菌種的斜面保藏及轉種先配置保藏菌種用的斜面培養基，其組分和含量g/L為牛肉膏3～5，瓊脂15-20，蛋白腖8～12，NaCl4～6；將pH調整為7.0～7.2，並在115～121℃下滅菌20～30min；然後在無菌操作環境中，將奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)接到斜面培養基上，在恆溫培養箱中25～30℃下培養1～2天後，在冰箱內2～6℃下保藏；以後每過1個月將菌種轉移至新鮮配置的斜面培養基上；B、種子液的製備從冰箱中取出A步得到的新鮮配置的斜面培養基和轉移在培養基上的菌種，移到恆溫培養箱中25～30℃下培養1～2天後，再回冰箱內2～6℃下保藏，1～2天內取出，在無菌操作環境中，將斜面上的菌種轉移至種子培養基中，種子培養基的組分和含量(g/L)為葡萄糖18～22，尿素0.4～0.6，酵母膏0.4～0.6，K2HPO44～6，KH2PO41～3，NaCl 0.05～0.2，(NH4)2SO40.1～0.3，MgSO4·7H2O0.1～0.3，pH 6.8～7.2；115～121℃下滅菌20～30min；將接種了菌種後的種子培養基放入搖床培養箱中培養，溫度為25～30℃，搖床轉速為150～170r/min，時間為2～3天，然後將其保藏在冰箱內，2～6℃下1～2天，備用；C、液態生物絮凝劑的製備及絮凝率的測定在無菌操作環境中，將種子液按1～2‰的比例接種至生產培養基中；生產培養基的組分和含量(g/L)為葡萄糖8～12，蛋白腖0.8～1.2，MgSO40.2～0.3，K2HPO44～6，KH2PO41～3，其pH為6.8～7.2，並在115～121℃下滅菌20～40min；然後將接種後的生產培養基放入搖床培養箱中發酵，溫度為25～30℃，搖床轉速為120～140r/min，時間為1～2天得到菌種的生產培養基發酵液，該發酵液通過4000～6000r/min離心機離心分離20～40min，除去沉澱，上清液即為液態生物絮凝劑，測定其絮凝率後將其保藏在冰箱內2～6℃下，備用；D、生物絮凝劑的提取純化向液態生物絮凝劑中加入2～3倍體積的無水乙醇，在冰箱內2～6℃靜置過夜，再用1000～4000r/min離心機分離20～40min；傾去上清液，往沉澱中加入2～3倍體積的無水乙醇，重複上面步驟1～3次；將沉澱物重新溶解於去離子水中，加入濃度為2％的十六烷基三甲基溴化銨，直至無沉澱產生，再經離心分離得沉澱物備用；將沉澱重新溶解於2～3％的NaCl溶液中，加入2～3倍體積的無水乙醇，混合均勻，在冰箱內2～6℃靜置過夜，離心得沉澱物，把沉澱物真空冷凍乾燥得純化的生物絮凝劑。
2.根據權利要求1所述的利用奇異變形桿菌製備生物絮凝劑的方法，其特徵在於所述的測定絮凝率是，向100ml比色管中加入0.4g高嶺土，3ml的1％CaCl2溶液和2ml離心上清液，然後加蒸餾水至100ml，蓋上磨口塞，將比色管作10個上下的自然翻轉，轉速以每次翻轉時氣泡上升完畢為準，翻轉結束後，靜置5min，取比色管中50m1處的加入離心上清液處理後的高嶺土懸液，用島津UV-1700型紫外可見分光光度計在550nm的波長下測定吸光度A，同時以2ml新鮮的生產培養基代替離心上清液，進行與上述完全相同的操作，測其吸光密度B，實驗作為對照，最後按常規的絮凝率E計算公式計算得到本發明的生物絮凝劑的絮凝率E(％)。
全文摘要
利用奇異變形桿菌製備生物絮凝劑的方法，涉及一種生物絮凝劑的製備方法，其工藝如下A.將奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)轉種到斜面培養基上，並保藏在冰箱2～6℃中；B.將保藏的菌種接種到種子培養基中，然後在搖床培養箱中25～30℃培養製備種子液；C.將所得種子液按1～2‰的比例接種到廉價的生產培養基中，然後放入搖床內，25～30℃，120～140r/min，1～2天得到菌種的生產培養基發酵液，將該發酵液通過4000～6000r/min離心機離心分離20～40min，除去沉澱，上清液即為液態生物絮凝劑，測定絮凝率；D.液態生物絮凝劑提取純化得生物絮凝劑純品。本發明培養成本低、生產周期短、經測定絮凝效率高達92.88～93.13％、使用後無二次汙染、能適應大規模生產及工業化應用，具有很好的推廣應用價值。
文檔編號C12N1/20GK101070203SQ20071004219
公開日2007年11月14日 申請日期2007年6月18日 優先權日2007年6月18日
發明者夏四清, 王學江, 張志強, 楊阿明 申請人:同濟大學