一種新型高強度羊毛的製作方法

2023-05-27 03:05:26

一種新型高強度羊毛的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種新型高強度羊毛，屬於生物工程【技術領域】。本發明利用轉基因技術和胚胎移植的方法，製備了以毛囊特異表達載體表達擬蜘蛛牽絲蛋白基因的克隆羊。將蜘蛛絲與羊毛的優點相結合，得到了平均拉伸度增加1.6倍的蛛絲毛羊。利用此種細毛羊生產的羊毛紡紗，會有效減少損失，生產出的紡織產品也具有輕便、耐磨，不易變形等特點，產品舒適度和美觀度將大大增加，對於紡織行業的發展有重要的促進意義。
【專利說明】一種新型高強度羊毛
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種新型高強度羊毛，屬於生物工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]羊毛是一種重要的紡織原料，在紡織行業中應用廣泛，中國是畜牧業大國，細毛綿羊毛紡出的絲線支數高，製備的成品輕便、細膩，深受百姓的喜愛。但毛直徑小，利用此種羊毛加工毛紗斷裂帶來的損失大大增加了紡織成本，紡織品的耐磨性也較差。目前國內市場改良物種的手段是引入優質公羊，通過體外受精和胚胎移植的手段提高畜產品的優良性狀，但毛的強度性狀由基因決定，要想有效改善此問題，提高毛的利用率和紡織性能，就需要利用生物工程手段來解決，傳統的育種方法達不到此目的。
[0003]細度是確定毛纖維品質和使用價值的重要工藝特性，用纖維的直徑微米或品質支數表示。細度越小，支數越高，紡出的毛紗越細。但毛越細斷裂強度越小，由於強度差毛紡企業在梳毛過程中由於斷裂的問題損失率為5-10%，使得紡織成本大大增加。新疆美利奴細毛羊毛的平均直徑為21.5-25.0 μ m，是目前中國市場細度最佳的品種，要想增強其紡織性能，提高強伸度是有力手段。自誕生了首例轉生長激素基因「超級小鼠」以來，世界各國科學家均將轉基因技術應用於動物生產，目前做的較多的有利用其提高動物生長速度、生產性能、改善動物產品品質、抗病育種等幾個方面。1994年，Powell等克隆了 IGF-1 cDNA並克隆超高硫角蛋白啟動子並構建了毛囊特異表達載體，待受精卵體外發育到原核期後利用顯微注射的方法把連有目的基因的載體注入受精卵的原核中，通過胚胎移植的手段生產轉基因羊，發現轉基因羊的羊毛含脂率得到明顯提高，光澤度增強。
[0004]蜘蛛絲主要由蛋白質構成，是目前自然界發現的最為堅韌的天然纖維材料，其中以牽絲最優，是很好的纖維材料，用於軍事、醫療和國防等各個領域。但人工飼養蜘蛛困難，蛛絲蛋白的重複序列特性被破解後，世界各國科學家均採用轉基因手段利用工程菌、動物生物反應器和植物生產人工蛛絲蛋白。但人們獲得蜘蛛絲蛋白基因的表達產物後都存在一個非常重要的問題，就是如何將蛛絲蛋白紡織成絲纖維進而得到有效利用。就又開始從紡織技術提高入手，來提高蛛絲纖維的紡織水平，但由於蜘蛛紡錘腺的特殊性，還沒有摸索出適宜的蛛絲紡織方式，使人工絲蛋白合成纖維具有天然絲纖維的特徵，所以進展緩慢。
[0005]本發明是將蜘蛛牽絲的優良性能用於改善毛羊的毛品質，生產新型的紡織材料。克服了用異源宿主生產蛛絲蛋白產量低、產物不均一問題及紡織技術對其開發應用的限制。

【發明內容】

[0006]本發明要解決的第一個技術問題是提供一種擬蜘蛛牽絲蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，片段長度為560bp，編碼的蛋白序列可以形成兩種二級結構結構，一種是β摺疊，決定纖維的強度，另一種是β螺旋，決定纖維的彈性。將該基因在實驗室加倍成4聚體，4聚體的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。[0007]本發明要解決的第二個技術問題是提供一種新型高強度羊毛，是表達了擬蜘蛛牽絲蛋白基因的羊毛。羊毛的強度和彈性得到增強。
[0008]所述羊毛優選表達了 SEQ ID N0.2所示擬蜘蛛牽絲蛋白基因四聚體的羊毛。更進一步地，優選以SEQ ID N0.3所示載體表達SEQ ID N0.2所示擬蜘蛛牽絲蛋白基因四聚體的羊毛。
[0009]本發明要解決的第三個技術問題是提供一種製備所述新型高強度羊毛的方法，是通過構建攜帶擬蜘蛛牽絲蛋白基因的毛囊特異性表達載體以及體細胞核移植，製備表達擬蜘蛛牽絲蛋白基因的克隆羊，以獲得的克隆羊生產高強度羊毛。
[0010]所述製備方法，優選以下步驟:
[0011](1)克隆角蛋白結合蛋白Kap6.1啟動子，置換載體PEGFP-Nl上的原始啟動子CMV，構建了表達載體pKap-EGFP，載體pKap-EGFP的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；
[0012](2)人工合成擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體並加倍成四聚體，核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示；
[0013](3)在pKap-EGFP載體的多克隆位點引入目的基因擬蜘蛛牽絲蛋白四聚體(4S)，構建了毛囊特異表達載體pKap-E4S，核苷酸序列見SEQ ID N0.4 ；
[0014](4)培養新疆美利奴細毛羊胎兒皮膚成纖維細胞，利用脂質體的方法進行了基因轉染，經G418篩選、DNA和RNA水平鑑定後獲得陽性轉基因細胞；
[0015](5)以體外成熟卵母細胞做受體，轉基因陽性細胞做供體，利用核移植的方法製備了克隆重組胚胎，通過胚胎移植的方法生產轉基因克隆羊產高強度羊毛。
[0016]本發明要解決的第四個技術問題是提供一種產所述高強度羊毛的羊的製備方法，是通過轉基因技術製備表達擬蜘蛛牽絲蛋白基因的轉基因羊。
[0017]本發明首次利用擬蜘蛛牽絲蛋白基因通過製備被毛轉擬蜘蛛牽絲蛋白基因毛羊來提高羊毛的強度，通過對基因進行優化結合轉基因技術，製造出了毛平均拉伸度增加1.6倍的蛛絲毛羊，利用此種細毛羊生產的羊毛紡紗，會有效減少損失，生產出的紡織產品也具有輕便、耐磨，不易變形等特點，產品舒適度和美觀度將大大增加，顧客的滿意度也將顯著提高，對於紡織行業的發展有重要的促進意義。同時蛛絲毛產品的國際市場也會被打開，將有效帶動國民經濟，特別是牧業地區的經濟的可持續發展。
【具體實施方式】
[0018]實施例1獲得擬蜘蛛牽絲蛋白基因
[0019]分析了 Lewis等人篩選到的蜘蛛牽絲蛋白基因3'端片段MaSpl以及Hinman等人篩選到的MaSp2，得知蜘蛛牽絲蛋白序列的組成特徵:(I) GPGQQ/GPGGX (X為Ala、Ser、Tyr或Val)，形成β -轉角，與蛛絲彈力成正比；(2) GGX (X為Ala、Tyr、Leu或Glu)，形成310螺旋,連接轉換β -摺疊；(3) PolyGlyAla/Poly Ala,形成β-摺疊，與強度成正比;
(4)間隔序列。我們設計了 MaSpl胺基酸序列為:Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr GlyGly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Ala Ala Ala Ala AlaAla ;MaSp2胺基酸序列為:Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly GlnGln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala，並優化合成了人工擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體(S)，序列大小560bp，如SEQ ID N0.1所示，前後分別加入了酶切位點，前端為:BamH 1、Nae I ,後端為:Sma 1、Not I ,用於基因加倍。
[0020]實施例2毛囊特異表達載體的構建
[0021]羊毛的主要成份是角蛋白，啟動子Kap6.1啟動角蛋白結合蛋白的表達。
[0022]克隆綿羊角蛋白結合蛋白啟動子Kap6.1，以該啟動子置換載體pEGFP_Nl上的原始啟動子CMV，構建了表達載體pKap-EGFP，該載體序列如SEQ ID N0.3所示。轉染綿羊胎兒皮膚成纖維細胞，檢測了啟動子Kap6.1活性，結果顯示其能啟動增強型綠色螢光蛋白EGFP在綿羊胎兒皮膚成纖維細胞表達。
[0023]在pKap-EGFP載體的多克隆位點引入目的基因擬蜘蛛牽絲蛋白四聚體(4S)，構建毛囊特異表達載體pKap-E4S，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0024]實施例3生產轉基因克隆羊
[0025](I)培養了新疆美利奴細毛羊胎兒皮膚成纖維細胞，細胞傳代後轉入6孔板，接種細胞濃度為2X IO5個/mL，生長24h，匯合率達70%_80%，可進行轉染實驗，本實驗使用InvitrogenTMReagent公司的Lipofectamine2000試劑盒進行。具體方法是:配置溶液1:90 μ L opt1-mem+10 μ LLipofectamine2000,室溫放置 5min ;配置溶液 I1:質粒為 4 μ g,其他用opt1-mem補齊至100 μ L ;將溶液I與溶液II混合，室溫下，靜置20min ;與此同時,將6孔板中的細胞用opt1-mem輕柔洗2遍,加入400 μ L opt1-mem ;將混合液逐滴加入孔中，搖動培養板，輕輕混勻，在37°C 5%C02培養箱中培養5h-6h ；5h-6h後，更換含10%血清的全培養基，在37°C 5%C02培養箱中繼續培養，細胞轉染後長滿單層，用胰蛋白酶消化，按1:30的比例(六孔板一個孔傳15cm大皿5個)傳入大皿中，加入含600 μ g/ml G418篩選培養液。每3d換液一次，大概生長9d-10d，可見培養板中出現了單克隆，挑取單克隆細胞，先接種到24孔板，接種傳代後進行鑑定。
[0026]分別作了 DNA和RNA水平鑑定，挑出陽性轉擬蜘蛛牽絲蛋白基因單克隆細胞凍存備用。
[0027](2)以體外成熟卵母細胞做受體，轉基因陽性細胞做供體，利用核移植的方法製備了克隆重組胚胎，待胚胎在體外發育後，移入同期發情的代孕母羊(小尾寒羊)子宮，妊娠期結束後，做好接產和鑑定工作。
[0028](3)對誕生的7隻羊的羊毛進行了 DNA、RNA水平和毛拉力、伸度檢測，檢測時選取兩月齡、新疆美利奴細毛轉基因和非轉基因羊各七隻，分別剪一定量前腿、後退、腰部羊毛利用拉力檢測儀測定了毛的拉力和拉伸度，每個部位測200根(見表1)，測定完取平均值做了 P檢驗，結果P〈0.001，證明轉基因羊和非轉基因羊毛拉力和伸度差異極顯著。擬蜘蛛牽絲蛋白基因已表達，毛的抗拉強度和伸度明顯增強。
[0029]表1羊毛韌性檢測數據
[0030]單位:F(N), L (mm)
[0031]
【權利要求】
1.一種擬蜘蛛牽絲蛋白基因，其特徵在於，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種擬蜘蛛牽絲蛋白基因四聚體，其特徵在於，是將SEQ ID N0.1所示序列加倍成四聚體，所得四聚體基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.攜帶權利要求1或2所述基因的載體、轉基因細胞系、重組菌或動物。
4.根據權利要求3所述的載體，其特徵在於，核苷酸序列如SEQID N0.4所示。
5.一種高強度羊毛，其特徵在於，是表達了擬蜘蛛牽絲蛋白基因的羊毛。
6.根據權利要求5所述的高強度羊毛，其特徵在於，是表達了SEQ ID N0.2所示擬蜘蛛牽絲蛋白基因四聚體的羊毛。
7.根據權利要求6所述的高強度羊毛，其特徵在於，是以SEQID N0.3所示的表達載體表達了 SEQ ID N0.2所示基因的羊毛。
8.一種製備權利要求5所述高強度羊毛的方法，是通過構建攜帶擬蜘蛛牽絲蛋白基因的毛囊特異性表達載體以及體細胞核移植，製備表達擬蜘蛛牽絲蛋白基因的克隆羊，以獲得的克隆羊生產高強度羊毛。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，具體步驟為: (O克隆角蛋白結合蛋白Kap6.1啟動子，置換載體pEGFP-Nl上的原始啟動子CMV，構建了表達載體pKap-EGFP，載體pKap-EGFP的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示； (2)人工合成擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體並加倍成四聚體； (3)在pKap-EGFP載體的多克隆位點引入目的基因擬蜘蛛牽絲蛋白四聚體，構建了毛囊特異表達載體pKap-E4S ； (4)培養新疆美利奴細毛綿羊胎兒皮膚成纖維細胞，利用脂質體的方法進行了基因轉染，經G418篩選、DNA和RNA水平鑑定後獲得陽性轉基因細胞； (5)以體外成熟卵母細胞做供體，轉基因陽性細胞做受體，利用核移植的方法製備了克隆重組胚胎，通過胚胎移植的方法生產轉基因克隆羊產高強度羊毛。
10.一種產權利要求5所述羊毛的羊的製備方法，是通過轉基因技術製備表達擬蜘蛛牽絲蛋白基因的轉基因羊。
【文檔編號】C12N1/15GK103789318SQ201410014440
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月14日 優先權日:2014年1月14日
【發明者】孟凡華, 張東, 王申元, 周歡敏, 劉羿羿, 張焱如, 劉春霞, 曹俊偉, 張立, 邢燕平, 李璐 申請人:內蒙古農業大學