一種動態過程中微生物氧消耗速率的測定方法與流程

2023-06-25 07:58:26 1

本發明屬於生物發酵領域，更具體地，本發明涉及一種動態過程中微生物氧消耗速率的測定方法。

背景技術：

氧消耗速率(Oxygen uptake rate，OUR)是指生物發酵過程中的氧氣的攝入量，其是以單位體積發酵液單位時間內攝入的氧的量來計算，又稱為耗氧速率或氧攝取速率。OUR能夠反應發酵過程中微生物的狀態，是一種用於表徵菌體呼吸代謝強度的重要參數。作為特徵參數，氧消耗速率的控制成為很多工業過程最優化生產的目標之一。菌體耗氧速率的大小一方面決定了細胞進行特定生理代謝反應所消耗的氧氣(降低還原度)的量，也取決於發酵環境中氧氣(溶解氧)的充裕程度。發酵過程中，一個難點為計算菌體在周期性溶氧波動情況下的呼吸強度和其他生理代謝變化。

傳統的OUR計算方法利用進出反應器的總氧元素守恆來實現。傳統的OUR計算方法可以較為簡便地計算階段內的OUR值，但其假設無法適用於短時快速變化的環境，從而在原理上無法實現短時動態變化的OUR計算。

針對短時(秒級)的動態過程的OUR計算，近來過來也有所報導，但其方法涉及的步驟繁瑣，採用複雜的數學模型來模擬，模擬前還需要對實際發酵的硬體條件(包括管道長度，尾氣分析儀類型，進氣系統等)進行參數擬合，在實際發酵過程中的應用難度較大。

使用混合空氣或切換進氣組分來控制反應器溶氧水平的方法已有報導。然而目前尚無準確的方法來計算在溶氧水平變化過程中的實際菌體耗氧水平，因此也鮮有針對動態過程的溶氧考察，更多的是基於控制不同溶氧濃度下的(擬)穩態研究。

近來報導的針對高度動態變化過程的OUR計算的方法較好地從原理出發，重建了OUR的計算。然而，其方法存在著過於複雜，系統擬合存在誤差等多方面的缺點，使得其應用難度大大增加。同時，相關文獻報導也僅僅將該方法應用於底物(糖)的一次性補加及周期性補加試驗中，並沒有應用在與溶氧相關的系列試驗中。

綜上，本領域需要開發新型的適用於在動態過程中測定微生物氧消耗速率的方法。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種動態過程中微生物氧消耗速率的測定方法。

在本發明的第一方面，提供一種微生物氧消耗速率的測定方法，所述方法包括：

(1)以生物反應器進行微生物發酵，以溶氧電極監控過程溶氧濃度，採集溶氧數據(DO)；

(2)以式8進行溶氧電極響應動力學回歸計算；

(3)將獲得的相對溶氧濃度(％)換算為絕對溶氧濃度(mol/kg)；

(4)計算溶氧隨時間的微分值；

(5)以式6計算，獲得微生物氧消耗速率；

式8；

式6；

其中，CO2,me為溶氧電極顯示的溶氧百分比(％)；

CO2,L為實際發酵液中的溶氧百分比(％)；

為溶氧電極平均響應時間(s)；

CO2為絕對溶氧濃度(mol/kg)；

kLa為比氧傳質係數(1/h)；

CO2*為飽和溶解氧濃度(mol/kg)；

OUR表示氧消耗速率(mol/kg/h)。

在一個優選例中，步驟(1)中，採集溶氧後，還對數據進行降噪處理。

在另一優選例中，對於溶解氧周期性波動的發酵過程，採用快速傅立葉變換的方法獲得降噪。

在另一優選例中，對於溶解氧非周期性波動的發酵過程，使用曲線擬合獲得平滑的溶氧值。

在另一優選例中，步驟(3)中，以式9計算絕對溶氧濃度；

式9；

其中，pfermentor為反應器內的絕對壓力(bar)；

HO2為標準狀態下的氧亨利係數(kg.bar/mol)；

fO2,air為空氣中的氧氣分壓。

在另一優選例中，所述的氧亨利係數HO2在標準狀態下(25℃水溶液)為769.23kg(H2O).bar/mol(O2)。

在另一優選例中，所述的飽和溶解氧濃度(CO2*)變化符合亨利定律。

在另一優選例中，步驟(4)中，以式7計算溶氧隨時間的微分值；

式7。

其中，CO2|tn為tn時刻的溶氧值；

CO2|tn+1為tn+1時刻的溶氧值；

CO2|tn-1為tn-1時刻的溶氧值；

tn+1為溶氧記錄的時間軸中的第n+1個離散點的時刻；

tn-1為溶氧記錄的時間軸中的第n-1個離散點的時刻。

在另一優選例中，所述的飽和溶解氧通過在特定過程中將OUR限定為0得到；較佳地，以式11計算；

式11。

在另一優選例中，反應過程採用pH電極反饋控制pH值。

在另一優選例中，通過控制通氣氣體種類而不改變通氣總量來控制發酵過程的溶氧梯度的定量變化；較佳地，所述的氣體包括但不限於：氧氣、空氣、氮氣、二氧化碳。

本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、一種用於計算短時高度動態生物過程中菌體耗氧速率的方法的計算流程。

圖2、基於新型方法與傳統方法計算的OUR數值比較。

圖3、根據本發明的實現的單位周期內實測溶氧變化曲線與數學處理後的溶氧曲線。實際測定溶氧(藍色實線)；經傅立葉變換降噪後的曲線(黑色虛線)；經溶氧電極一級動力學回歸後的溶氧曲線(黑色實線)。

圖4、單周期內d(CO2)/dt的變化曲線。使用未經降噪處理的溶氧作為數據源(黑色虛線)，使用經過降噪處理的溶氧作為數據源(黑色實線)。

圖5、發酵液飽和溶氧在120s周期內的變化趨勢。

圖6、利用本發明的方法計算的短周期快速變化下，菌體OUR在120s周期內的變化值。

具體實施方式

在生物反應過程中，一大難點是檢測在溶氧波動情況下對於菌體實際耗氧水平的檢測。鑑於此，本發明人經過深入研究後，建立了一種簡便的新型反 應器耗氧速率計算方法，實現了傳統耗氧速率計算方法無法應用的高度動態生物過程的氧消耗速率計算。本方法具有低硬體依賴性，計算過程簡便，操作性強等特點。本發明的方法可以應用於對大型生物反應器實際生產過程中由於混合不均勻導致的氧梯度進行研究，對工業放大的優化研究有較大的價值。

除非另外說明，本發明中，所有溶氧相對值/百分比均以標準環境(25攝氏度，1個大氣壓)下純水在標準空氣(氧氣含量20.95％(v/v))中的飽和溶解氧的值為100％。

本發明的方法通過控制通氣氣體種類而不改變通氣總量來控制發酵過程的溶氧梯度的定量變化，是一種基於溶氧數據的OUR計算方法，所述方法的優點是：

(1)針對簡單過程(進氣成分無波動，尾氣成分變化不劇烈)，可以直接通過過程測定的溶氧值計算菌體耗氧速率，其結果與傳統方法一致，驗證了方法的準確性。同時，能夠降低計算OUR所需的硬體成本。

(2)針對短時高度動態過程(進氣成分劇烈波動，發酵系統不穩定，尾氣成分劇烈變化)，傳統方法由於假設不成立無法進行計算，而本發明的方法可以準確計算其OUR值，實現了從無法計算到有辦法計算。

(3)針對OUR計算，應用了一系列溶氧、尾氣信號預處理方法，包括但不限於：基於人工設定閾值的快速傅立葉變換；基於曲線擬合的數據重構；基於一級動力學的電極信號回歸；基於零級動力學與一級動力學的尾氣測定信號回歸。

(4)相比於傳統方法，本方法基於完整的物質守恆，從而避免了基於假設而造成個別發酵過程不適用的情況。就具體而言，該計算方法成功地實現了針對進氣成分(出氣成分，溶解氧值)劇烈變化的生物過程(即實例2)的OUR計算。

(5)相比於傳統方法，基於本方法計算OUR對於尾氣中氧氣信息並非必須，從而降低了對於簡單過程的OUR計算的硬體要求。並且驗證了其與傳統OUR計算方法得到結果的一致性。

(6)相比於現有文獻所列舉的針對短時間高度動態生物過程的方法，本方法實現較為簡便，不需要對當前整個發酵硬體設備進行充分的數學模型定義。存在普遍適應性。

(7)利用該種策略可以定量準確的研究短時間溶氧波動情況下菌體的呼吸代謝響應水平，對於工業規模溶氧梯度的對生產的影響具有指導意義。

本發明的OUR計算方法，從原理出發，在適當應用相關理論基礎的同時也規避了繁複的數學模型。從實際數據出發，經過適當的數學處理後即可獲得該階段的OUR參數，實現了針對短時動態環境變化下的OUR簡易計算。同時該方法可以實現在沒有尾氣中氧氣信息的條件下近似估計OUR，大大降低了OUR計算的硬體基礎。

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。

實施例1、OUR的獲得方法

現有技術中，針對OUR的計算基於反應器氣相部分的氧分子守恆(式1)，液相部分的氧分子守恆(式2)，以及液相-氣相間的氧傳遞(式3)。

式1

式2

式3

其中，Vhead為反應器頂部體積(L)，Fg,in/out為絕對進氣/出氣通氣量(mol/h)，fO2,in/out為進氣/出氣中氧氣比例(-)，Mbroth為發酵裝液體積(kg)，OUR為單位體積發酵液耗氧速率(mol/kg/h)，kLa為反應條件下的比氧傳質係數(1/h)，CO2*為飽和溶解氧濃度(mol/kg)，CO2為溶解氧濃度(mol/kg)。TO2為氣液兩相間的氧氣傳遞速率(mol/h)，其中「(-)表示無量綱(即百分比)」。

對於傳統的OUR計算公式，假設溶解氧變化及尾氣中O2分壓變化是忽略不計的(即)，則由(式1)-(式3)可得：

式4

式5

fN2,in為進氣中惰性氣體比例(-)，fN2,out為出氣中惰性比例(-)。

其中進氣與尾氣體積可以通過通氣中的惰性氣體部分(需要滿足該氣體組分不參與生物過程反應，此處以氮氣為例)進行校準(式5)。顯然，對於劇烈變化的動態過程或瞬時變化(即對於)，上述等式並不成立。同時考慮到溶氧電極及尾氣採集的響應脈衝，因此無法利用該方法實現OUR的計算。

鑑於此，本發明人經過深入的研究和反覆的試驗，提出在已知溶氧濃度的變化(CO2隨時間變化曲線)及比氧傳質係數kLa的情況下，僅僅通過(式2)與(式3)計算得到OUR值。即：

式6

其中：

式7

其中，CO2|tn為tn時刻的溶氧值；

CO2|tn+1為tn+1時刻的溶氧值；

CO2|tn-1為tn-1時刻的溶氧值；

tn+1為溶氧記錄的時間軸中的第n+1個離散點的時刻；t表示某一

時刻(時間點)，n代表大於等於1的正整數，t0時刻表示開始點；

tn-1為溶氧記錄的時間軸中的第n-1個離散點的時刻。

然而，直接使用原始數據通過差分法(式7)計算溶氧微分會引入較大的誤差，原因包括：

1)電極信號的採集、傳輸噪聲；

2)發酵液的飽和溶解氧濃度也會隨尾氣變化而變化；

3)由於考察的時間區間為秒級，因此溶氧值還需要針對使用的溶氧電極進行響應時間(通常為秒級)的校準。

因此，在使用(式6)計算OUR之前，對原始溶氧數據進行處理以降低誤差。相對應的措施包括：

1)針對周期性的波動，採用快速傅立葉變換(FFT)的方法進行降噪。對於非周期性的波動，使用曲線擬合獲得平滑的溶氧值。

2)將所有相對溶解氧濃度(％)換算為絕對溶氧濃度(mol/kg)。相對溶氧濃度(％)與絕對溶氧濃度(mol/kg)之間的轉換遵循亨利定律(式9)：

式9

其中，CO2,L為實際發酵液中的溶氧百分比(％)，fO2,air為空氣中的氧氣分壓(0.2095)，pfermentor為反應器內的絕對壓力(bar)，HO2為標準狀態(25攝氏度水溶 液)下的氧亨利係數(769.23kg(H2O).bar/mol(O2))。

發酵液中的飽和溶解氧濃度(CO2*)變化同樣符合亨利定律，即：

式10

fO2,offgas指尾氣中氧氣濃度數據。此處用於計算特定條件下的絕對溶氧濃度，在確定亨利常數(此處HO2＝769.23kg(H2O).bar/mol(O2))下pfermentor，HO2均為常數，fO2,offgas為測定值。

3)降噪後的溶氧值利用一級動力學方程(式8)回歸電極的動力學響應。

式8

其中，CO2,me為溶氧電極顯示的溶氧百分比(％)，CO2,L為實際液體中的溶氧百分比(％)，為溶氧電極平均響應時間(s)。

最終的該方法使用策略見圖1。圖1中，尾氣中的氧氣分壓採集、降噪、質譜響應動力學回歸等流程(該部分處理不涉及微分，因此尾氣部分校準對後期的計算影響不大)如下：

(i)尾氣中的氧氣分壓採集使用過程質譜儀/尾氣分析儀直接採集。

(ii)降噪使用方法與溶氧曲線的降噪方法一致。

(iii)動力學回歸包含一個零級動力學延遲及一個一級動力學延遲。

a)一級動力學延遲與溶氧的動力學延遲公式(式8)一致。

式11

b)零級動力學延遲表示為一個純粹的時間延遲，即

式12

其中，fO2,offgas,raw為尾氣分析儀/過程質譜儀採集的原始信號，τdelay,offgas為由於通氣管道產生的尾氣信號淨延遲時間(s)，τr,offgas為由於在尾氣分析儀/過程質譜儀氣體收集腔的氣體混合產生的尾氣信號平均響應時間(s)。

實施例2、發酵過程中OUR測定實例

2.1材料與方法

本實施例中，以產黃青黴(Penicillium chrysogenum)生物合成青黴素(Penicillin)為例。

實驗階段分為批培養階段與O2波動實驗階段。

2.1.1菌株

用於發酵的菌株是：Penicillium chrysogenum Wis54-1255，購於美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。

2.1.2培養基

批發酵培養基成分包括：

O2波動階段實驗採用連續培養方式進行，連續培養培養基成分同批發酵培養基，但其中PAA濃度增加至0.8g/L。

2.1.3反應過程控制策略

接種使用產黃青黴的孢子懸液。反應器體積為5L，通氣量轉速控制隨發酵階段的變化而變化。發酵罐壓力維持在1.5bar。反應過程中使用電化學溶氧電極監控過程溶氧濃度，使用玻璃pH電極反饋控制發酵pH在6.5，使用2mol/kg NaOH溶液作為鹼液。

批培養採取逐步增加轉速的策略，以控制溶氧不低於100％常壓飽和氧濃度為準。此時通氣量控制在1L/min。

在批培養結束後開始連續補料並通過出料控制體積在3kg，控制稀釋率為0.051/h。同時開始O2波動策略。以120秒為控制周期，120秒中以30s通入空氣、90s通入氮氣，增加通氣量至3L/min並維持不變。與之對應的溶氧波動周期為120秒，振幅達到約60％空氣飽和溶氧。在大約50小時後溶氧波動呈現高度一致性。

2.2針對穩定過程的OUR計算驗證

2.2.1實驗過程參數

實驗過程中的參數設定為：

●Fg,in＝Fg,out＝1[L/min]

●Mbroth＝4[kg]

●pfermentor＝1.3[bar]

●kLa＝240[1/h]

●τr,CO2＝7.29[s]

●τr,offgas＝1.79[s]

●τdelay,offgas＝3.35[s]

●HO2＝769.23[kg(H2O).bar/mol(O2)]

2.2.2根據本發明的新方法的OUR計算

根據前述實施例1的揭示，實行步驟如下：

1.採集DO數據；

2.利用多元曲線擬合重構溶氧數據，降低信號採集噪聲；

3.利用(式8)回歸溶氧電極動力學響應的影響；

4.利用(式9)計算溶氧的絕對濃度；

5.利用(式7)計算溶氧隨時間的微分值

6.由於進氣中氧氣分壓不變(空氣)，因此可以直接利用空氣中氧氣分壓(20.95％)計算飽和溶解氧濃度CO2*；

7.利用(式6)計算OUR。

2.2.3根據傳統方法的OUR計算

在應用本方法的同時，同時比較了基於傳統OUR計算方法(式4)的結果，將檢測參數(fO2,in與fO2,out)代入式4來計算。

2.2.4本發明方法與傳統方法的OUR測定比較

前述2.2.2與2.2.3兩種方法的比較結果如圖2。

由圖2結果可以發現，針對批發酵這樣一個簡單的擬穩態過程，基於新型方法計算的數值可以省略尾氣中氧氣濃度數據(fO2,offgas)採集而使用理論公式推導得到，在使得整體數據更為連貫(對於多路同時檢測的尾氣分析儀，數據分析頻率受檢測氣路數量影響，間隔大約為0.5-2小時)的同時降低了OUR計算的硬體要求，最終結果與傳統方法也有較好的一致性。

2.3針對高度變化的OUR計算

實驗過程中的參數設定為：

●Fg,in＝Fg,out＝3[L/min]

●Mbroth＝4[kg]

●pfermentor＝1.3[bar]

●kLa＝500[1/h]

●τr＝7.29[s]

●τr,offgas＝1.79[s]

●τdelay,offgas＝1.10[s]

●HO2＝769.23[kg(H2O).bar/mol(O2)]

考慮整個實驗過程的周期性，選取周期變化中的任意一個周期作為計算時間區間，採用的實驗數據處理方法與前述2.2中相同。

如圖3所示，通過對原溶氧值進行了降噪和回歸處理後，其信號與原數值相比發生較為明顯的變化。

如圖4所示，比較了使用了合適降噪(實線)與未使用降噪(虛線)對溶氧差分值與整體準確性的影響，證明了在該方法中對溶氧直接測定值做數學優化的必要性。

在該實例中由於進氣成分隨時間發生劇烈變化，即進氣中氧氣分壓比例在0％(氮氣)至20.95％(空氣)之間波動，因此需要計算在一個周期(120s)內的飽和溶氧值(CO2*)的變化。

根據(式6)，飽和溶氧值(CO2*)可以通過在特定過程中將OUR限定為0得到，即(式11)。實際實驗中通過在實驗結束後對反應器內菌體進行滅活處理，使其在保證流變特性不變的前提下喪失耗氧能力，重複同樣的供氧策略並測定周期內溶氧變化，以實現對飽和溶氧值(CO2*)的標定。最終飽和溶氧在120s周期內的變化結果如圖5所示。

式11

基於上述數學處理及標定工作，獲得了可以代入式(6)的與得到在該過程中菌體好氧水平的變化趨勢。

如圖6所示，OUR在達到一定高度後並沒有繼續隨溶氧的增加而增加，也沒有在之後隨溶氧的降低而降低。與先前微生物過程檢測中「臨界溶氧濃度」一概念相符。該策略的應用，不僅僅成功實現了在120s短周期內的溶氧劇烈波動，同時也實現了在劇烈波動下對於OUR的數值計算。

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文 獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。