抗噬菌體的乳酸菌的製作方法

2023-05-27 11:19:46 1

專利名稱：：抗噬菌體的乳酸菌的製作方法
技術領域：
：本發明涉及乳酸菌(LAB),其中的YjaE蛋白是基本上失活性，從而該LAB具有改善的抗噬菌體性，此外，還涉及含有乳酸菌的起子培養物組合物，以及使用該起子培養物製備食品和飼料製品。
背景技術：
：噬菌體感染所引起的細菌培養物的產品失效被認為是細菌培養物工業中的主要問題之一。該工業中使用的許多菌抹中均已發現存在噬菌體，例如乳酸菌種中的如乳球菌屬、乳酸桿菌屬、明串珠菌屬、小球菌屬或鏈5求菌屬。在食品工業中，乳酸菌起子培養物被廣泛用於食物發酵。在所有的乳酸菌種類中，乳球菌屬是最容易被噬菌體感染所破壞的。導致乳酸菌起子培養物中頻繁的噬菌體感染的一個因素就是在食品工業中，包括乳品工業中的發酵條件通常不是無菌條件。因此，在這樣的工業條件下還不太可能消除噬菌體汙染。噬菌體促使細胞溶解的過程包括噬菌體被吸附在宿主細胞表面、噬菌體DNA被注入到細胞內、噬菌體蛋白質的合成、噬菌體DNA的複製、後代噬菌體的裝配以及後代從宿主中釋放的過程。這些過程中的任何一步受到細胞介導的機理的幹涉都能防止噬菌體感染。在工業應用中的細菌培養物對噬菌體感染的抵抗能力在很大程度上取決於宿主菌林的特徵，該特徵能夠影響上述機理中的一個或多個。乳酸乳球菌中含有用於細胞膜蛋白質的染色體基因(pip)，其可充當扁長噬菌體c2以及其它c2種的噬菌體的受體。當前，製造抗噬菌體乳球菌林的工業優選方法是製備pip基因失活的菌抹。在Kraus等的文章(KrausJ.da/，1998J.DairyScience81:2339-2335)中描述了構建一系列與商用相關的乳酸乳球菌林，其p)7基因未被激活(p*—菌株)。戸>-菌抹對c2種的扁長噬菌體具有完全的抗性，但對936種的小的等軸噬菌體skl、小的等軸噬菌體腿210b和31(p335種)，以及大的等軸噬菌體949(949種)非常敏感。乳酸乳球菌IL1403的完整的基因組已經測序並發表在基因庫資料庫中。yjaE五是乳酸乳球菌IL1403的基因。在本發明的申請日，基因庫進入號AE006322顯示出乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403的完整基因組的218個區中的84個。少>￡基因的編碼DNA序列的CDS序列為從5892到8291。就其功能而言，可被簡單地稱為"假定的蛋白質"。另外，"'a五基因也具有與p^基因的低的同源性。具體而言，"與噬菌體感染蛋白質/*具有22%的等同性"。基因庫進入號NC—002662顯示出乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403的完整序列。這裡，；^五基因的編碼DNA序列的CDS序列為從904024到906423。WO01/77334公開了乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403的完整基因組。在該文件中，W^;基因對應於ORF900。該ORF900沒有相關功能。在第27-29頁，描述了涉及抗噬菌體的一些基因。在第29頁，第2-3行總結了這些噬菌體相關的基因，例如ORF38、41、448、452、518、1461和1472。總之，從技術的角度考慮，"'^;基因的功能在本申請的申請日時是不為人所知的。
發明內容本發明所解決的問題是提供新的抗噬菌體的乳酸菌(LAB)。解決方案的提出是基於本發明者們對Wfl五基因的參與的確認。本發明者們對不同乳酸乳球菌菌抹的；^五基因進行失活，並發現這些y力五菌抹對噬菌體具有抗性。具體參見實施例。按如上所述，乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403的Wa五基因的DNA序列在基因庫中已有公開。其編碼DNA序列示於這裡的SEQIDNO1中，相應的"'a五蛋白質的胺基酸序列示於這裡的SEQIDN02中。因此，本發明的第一個方面涉及乳酸菌，其中由；;>￡基因表達的YjaE蛋白質基本上沒有活性，且；^五基因表達的YjaE蛋白質包含了選自由以下序列組成的組中的DNA序列(a)在SEQIDNO1(IL1403Wa五DNA編碼序列)中位於1-2400處的DNA序列；(b)編碼多肽的DNA序列，可選擇性地具有YjaE蛋白質活性，即與位於SEQIDN02(IL1403YjaE蛋白質序列)1-799處的多肽序列的至少70%相同，例如，至少與80%，優選為至少90%，例如至少95%或至少99%的相同。術語"基本上失活性"應該根據本發明的目的而理解。本發明的目的是製備一種菌株，其中YjaE蛋白質所起作用遠不及其對應的母體野生型菌抹。如下面將說明的，製備這樣的菌林屬於本領域技術人員的日常工作。例如，通過向基因中引入終止密碼子或進行移碼插入，從而產生非功能性基因，該基因例如不表達YjaE蛋白質，或者表達部分長度的失活性YjaE蛋白質。另外，也可在基因中引發突變，例如，給YjaE蛋白質突變變異體，其雖具有一些活性，但對於與在此相關的實際目的而言基本上是失活性的。檢測YjaE蛋白質的失活性的方法是分析細菌對適當的有代表性的不同噬菌體組的抗性的增加。如以下將要解釋的，本領域技術人員可以理解，當這裡描述的細菌對代表性的不同噬菌體的抗性的有所增加時，表明YjaE蛋白質基本上是失活性的。如上所解釋，已知乳酸菌可對某些噬菌體敏感，而對其他的不敏感。因此，在本領域範圍內應該可以理解，如果i兌這裡所述的細菌具有對適當的有代表性的不同噬菌體組的增加的抗性，則意味著該細菌對喧菌體組中的至少一種噬菌體具有增加的抗性。當然，通常優選的是細菌具有對噬菌體組中的兩種或多種噬菌體的增加的抗性。基本使YjaE蛋白質失去活性的優點是得到的細菌不但可對c2型噬菌體具有抗性，而且可對其他類型的噬菌體也具有抗性。這裡的實施例表明了這裡描述的LAB不但對c2種的噬菌體具有抗性，而且對936種的小的等軸嗟菌體也具有抗性。這是對pip菌林的改進。如上所述，pip菌株通常只對c2種的噬菌體具有抗性。使YjaE蛋白質基本上失去活性通常不會對LAB的存活性、生長速率或酸的產生帶來負面影響。例如，這裡給出的一些實施例中展示了兩種不同的菌林。本發明的第二個方面涉及起子培養物組合物，其包含第一個方面的乳酸菌。本發明的第三個方面涉及製備食品或飼料製品的方法，包含向食品或飼料製品起始材料中加入根據第二方面的起子培養物組合物，並在具有正常代謝活性的乳酸菌的條件下將該接種的起始材料保持。本發明的第四個方面涉及製備乳酸菌的方法，其中，由；^五基因表達的YjaE蛋白質是基本上失活性的，包含對"V^基因進行適當改性，從而不產生活性YjaE蛋白質的表達，其中，；^五基因包含了選自由以下序列組成的組中的DNA序列(a)在SEQIDNO1(IL1403;^五DNA編碼序列)中位於1-2400處的DNA序列；(b)編碼多肽的DNA序列，可選擇性具有YjaE蛋白質活性，即與位於SEQIDN02(IL1403YjaE蛋白質序列)1-799處的多肽序列的至少80%相同，例如，至少與85%，優選為至少90%,例如至少95%或至少99%的相同。以下描述本發明的實施方式，但僅以實施例的形式描述。發明的詳細描迷根據本發明，對問題的解決方法是提供新的乳酸菌(LAB),其對噬菌體具有抗性，其中，YjaE蛋白質是基本上失活性，從而YjaE蛋白質對於噬菌體感染的功能而言失活性。這裡的表達"YjaE蛋白質對於噬菌體感染的功能而言失活性"是指一種YjaE蛋白質與所述的YjaE蛋白質序列SEQIDNo.2中的不同，其特徵是攜帶YjaE基因而編碼所述功能上失活性的YjaE蛋白質的細菌對至少一種噬菌體有改善的抗性，其中，噬菌體是選自適當的有代表性的不同的噬菌體組。適當的有代表性的不同的噬菌體組優選含有不同的相關的噬菌體，並代表c2種的扁長噬菌體，936種的小的等軸噬菌體，p335種的小的等軸噬菌體，949種的大的等軸喧菌體。一個具體的有代表性的不同的噬菌體組是包含了c2種的扁長噬菌體bIL67、CHL92、MPCIOO、c2、3、24、116、122、134、180、199、227、364、670;936種的小的等軸噬菌體234、649;以及P335種的小的等軸噬菌體228。術語"對噬菌體改善的抗性"是指當在空斑測定，例如下面描述的"通過瓊脂覆蓋法確定噬菌體抗性，，對細菌菌株進行測試時，細菌菌林對至少一種噬菌體具有改善的噬菌體抗性，表現為對給定菌抹，由所述至少一種噬菌體獲得的pfU/ml(每ml的空斑形成單位)與在親菌抹上由相同的噬菌體獲得的pfb/ml相比較的差別。對噬菌體具有改善的抗性的菌株優選地顯示出pfU/ml的降j氐的因子至少為50，例如，至少100，如500,l尤選至少為1000，更優選至少為10000或更多。乳酸菌這裡用的術語"乳酸菌"是指革蘭陽性、微嗜氣或厭氧菌，它們對糖進行發酵，並產生酸，包括其主要為乳酸，以及乙酸、曱酸和丙酸等。工業上最為有用的乳酸菌被發現存在於乳球菌屬、鏈球菌屬、乳酸桿菌屬、明串珠菌屬、小球菌屬或腸球菌屬中。並且，屬於雙歧桿菌屬中的嚴格厭氧菌也通常包含在乳酸菌組中。如上所述，乳酸菌中的成員乳球菌亞種多被噬菌體感染所破壞。優選的實施方式中的乳酸菌是乳球菌屬，優選為乳酸乳球菌種。優選的乳球菌亞種的例子有乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種或乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙醯乳酸生物變種(Lactococcuslactissubsp.lactisbiovar.Diacetylactis)。如上所述，乳球菌亞種含有膜蛋白質的染色體基因(pip)，其可充當扁長噬菌體c2以及其它c2種的噬菌體的受體。在一個優選的實施方式中，這裡描述的LAB也具有失活的pip基因。YiaE蛋白質和yjaE五基因基於已知技術中的與yjaE五相關的序列信息，以及在此所揭露的內容，本領域技術人員應當能夠相對容易地確認在另一種類型的LAB中的基因是否為yjaE基因。例如，本發明者們擁有3種不同菌林的乳球菌亞種中的yjaE基因。在胺基酸水平上，這3種序列基本上與IL1430菌抹(SEQIDNO2)的序列相同。例如，菌抹CAal20的序列在IL1430的200位處具有Lys(K)而不是Glu(E)。序列的其餘部分與IL1430的相同。因此，目前認為，特別是當LAB是乳球菌亞種時，不同菌抹中的不同萬V必序列頗為相同。然而，在沒有任何理論限制下，在今後的測序從其他屬中找出具有類似yjaE序列的LAB。如上所述，YjaE蛋白質可以是由yjaE基因表達的YjaE蛋白質，該基因包含選自由以下序列組成的組的DNA序列(b)編碼多肽的DNA序列，可選擇性具有YjaE蛋白質活性，即與位於SEQIDNO2(IL1403YjaE蛋白質序列)1-799處的多肽序列的至少70%相同。(b)中編碼多肽的DNA序列，優選為與位於SEQIDNO2的1-799處的多肽序列的至少80%相同，例如至少85%相同，更優選為有至少90%相同，進一步優選為有至少93%相同的編碼多肽的DNA序列和最優選的是(b)中編碼多肽的DNA序列優選為與位於SEQIDNO2的1-799處的多肽序列的至少96%相同，更優選為有至少99%相同的編碼多肽的DNA序列。(b)中的DNA序列可以是如(a)中的DNA序列的非天然的變異體，以編碼多肽的非天然的變異體。本領域的技術人員知道如何製備這樣的變異體，例如，通過定點突變或隨機突變或變換相似基因。使YiaE蛋白質基本失活的方法如上所討論的，本領域技術人員可按常規操作製備出這裡所描述的菌抹，其中的YjaE蛋白質是基本上失活性的。可參見這裡給出的實施例以及
背景技術：
部分KrausJ.等的描述。通常而言，一條常規的方法可以在；^五基因組的基因序列中通過同源重組引入或替代適當的DNA片段(例如，通過使用公眾可獲得的pGhost載體)。如果引入的片段包含無義(停止)密碼子，則基因會失活，從而該LAB會成為具有失活性的YjaE蛋白質的LAB。其他適合的改性可以是移碼突變，缺失、突變或插入。此外，適當的改性還可以被引入到相關區域，例如，啟動區。如上所解釋的，yjaE基因的適當的改性可以是指許多情況，例如，終止密碼子，可導致如移碼、缺失、突變等的插入。對於本領域技術人員而言，可按常規選擇適當的方法向；yjaE五基因中虧1進一適當的改性從而不產生活性YjaE蛋白質的表達。另外，還可以進行隨機突變(例如，通過UV輻射)和對突變進行選擇，其中，YjaE蛋白質基本上失活性。此外，可以對相關的自發的突變進行選擇，其中，YjaE蛋白質基本上失活性。在一優選的實施方式中，YjaE蛋白質是失活性的。在一優選的實施方式中，YjaE蛋白質是失活性的。例如，可通過在YjaE蛋白質中如引入移碼或終止密碼子進行突變，而使YjaE蛋白質失去活性，特別是當突變發生在蛋白質的大約一半處，見實施例1和3。然而，包括84核苷酸在2007-2090位上的框內缺失在內的任何突變，將導致蛋白質缺少至少一個對應於推導蛋白質序列中的胺基酸14-33,625-642,664-683，691-710,719-738或774-792的可預測的跨膜區，都將導致YjaE蛋白質對噬菌體感染在功能上失活性的一種失活的蛋白質。因此，本發明的一種實施方式涉及的乳酸菌中編碼YjaE蛋白質的yjaE基因缺少至少一個對應於由推導蛋白質序列中的胺基酸14-33，625-642，664-683,691-710,719-738或774-792的可預測的跨膜區。如在實施例4中所討論的，可以對YjaE蛋白質的個體區域的細胞內和細胞外定位進行預測。YjaE蛋白質的個體區域的細胞內和細胞外定位被認為在噬菌體感染中對其功能有重要影響。對此，84核苷酸在2007-2090位(胺基酸670-697)上的框內缺失顯得尤為有趣。這是由於該缺失導致的一種蛋白質，其中的其餘部分的可預測的細胞內和細胞外定位發生了交換。因此，本發明的另一實施方式中的乳酸菌，其中，由yjaE基因編碼的YjaE蛋白質，其中，YjaE蛋白質的可預測的細胞內和細胞外定位區的分布隨著在菌抹IL1403中的可預測的情況而發生了改變。使YiaE蛋白質失去活性的測定方法如上所述，檢測YjaE蛋白質的失活性的方法是分析細菌對適當的有代表性的不同噬菌體組的抗性的增加。通常可使用標準的空斑測定法來完成。可參見實施例1中根據瓊脂覆蓋法對合適的空斑測定的描述。空斑測定通過將特定的噬菌體作用於目標菌抹得到的pfU/ml(每毫升中含有的空斑單位)，相比於相同的噬菌體作用於親菌林(YjaE蛋白質具有天然的野生型活性)所得到的pfWml,以它們之間的差別來測定目標菌抹的抗謹菌體性(YjaE失活的蛋白質)。相應地，這裡所描述的乳酸菌對至少一種噬菌體具有增強的抵抗性的特點，其中該噬菌體選自於適當的有代表性的不同噬菌體組。可參見這裡的實施例中的優選方法來分析抗噬菌體性。適當的有代表性的不同噬菌體組應優選含有不同且相關的噬菌體，包括c2種的扁長噬菌體，936種的小的等軸噬菌體，p335種的小的等軸噬菌體，949種的大的等軸噬菌體。c2種的扁長噬菌體的適當的例子為bIL67,CHL92,MPC100,c2,3，24,364,P謝。936種小的等軸噬菌體的適當的例子為skl,p2，jj50,234，649。p335種的小的等軸噬菌體的適當的例子為mm210b,31,p335。949種的大的等軸噬菌體的適當的例子為949。上述所列的所有噬菌體均可在文獻中查到或通過向Chr.HansenA/S,Denmark請求而得到。優選地，這裡所述的乳酸菌對c2種的扁長噬菌體和/或936種小的等軸噬菌體已具有改善的抵抗性。另一種測量YjaE蛋白質的失活性的方法就是分析的基因序列，看其是否含有適當的能夠引起諸如基因失活的改性。如上面所敘述的，適當的改性可通過多種手段，例如終止密碼子、可導致如移碼、缺失、突變等的插入。這是本領域的技術人員例行確定(如通過排序基因)是否基因含有這樣的適當的改性。相應地，在優選的實施方式中，這裡所描述的乳酸菌含有對;^五基因的適當的改性，其中的改性導致基本上不表達活性的YjaE蛋白質。更優選地，改性導致活性YjaE蛋白質不被表達。測量YjaE蛋白質失活性的進一步方法就是分析活性YjaE蛋白質是否會存在於細菌的細胞膜中。這可以通過此處實施例中描述的標準分離法測量。相應地，在優選的實施方式中此處所描述的乳酸菌並不含有細胞膜中活性YjaE蛋白質的可測量的量。含有這裡描述的LAB的起子培養物這裡描述的乳酸菌被用作食品和飼料製品生產中的起子培養物。通常，這樣的^±培養物組合物包含濃縮形式的細菌，包括冷凍的，乾燥的或凍幹的濃縮物，在每克的組合物中，通常活細胞的濃度範圍在io4到1012cfU(菌落形成單位)，每克組合物至少包括10、fU,例如，至少為105cfii/g,如至少為106cfo/g，如至少為107cfu/g,如至少為108cfii/g，如至少為109cfii/g,如至少為101GcfU/g，如至少為10"cfti/g。組合物還可進一步含有防凍劑和/或傳統的添加劑，例如營養物，如酵母提取物、糖和維生素。在乳酸菌發酵過程中，一般會採用混合的乳酸菌的培養物。因此，在一些實施方式中，組合物包含了多種菌抹，它們可以是屬於相同的種或可屬於不同的種。在起子培養物組合物中的這種有用的乳酸菌組合的典型例子是以下菌林的混合物明串珠菌屬，一種或多種乳球菌亞種，例如，乳酸乳球菌乳酸亞種，乳酸乳球菌乳脂亞種，或乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙醯乳酸生物變種。製備食品和飼料製品的方法如上所述，本發明的一方面涉及製備食品或飼料製品的方法，包含向食品或飼料製品起始材料中加入這裡描述的起子培養物組合物，並在具有正常代謝活性的乳酸菌的條件下將該接種的起始材料保持。有用的食品起始材料包括任何可用於傳統的乳酸菌發酵步驟的材料，例如，奶、蔬菜材料、肉製品、水果汁、果汁、生麵團和牛奶雞蛋麵糊。由該方法得到的發酵產品，包括典型的乳製品，例如奶酪，包括新鮮的奶酪製品和酪乳。在進一步的實施方式中，底物材料為用於動物祠養的起始材料，例如，青貯飼料，如草、穀類材料、豆、紫花苜蓿或甜根的葉，其中，細菌培養物在被青貯的飼料農作物中進行接種，以保存這些材料。並且，在富含蛋白質的動物廢棄物中，例如屠宰後的碎屑和魚的廢棄物中，發酵的目的也是保存這些廢棄物，並為動物飼養之用。本發明的乳酸菌的另一重要應用是將細菌培養物用作所謂的益生菌。本文中的術語"益生菌，，是指微生物培養物，當它們被人或動物以活細胞的形式攝食後，能夠改善健康條件，例如，通過抑制胃腸道內的有害微生物，通過增強免疫系統，或通過有助於營養物的消化。鑑定DNA序列這裡所述的DNA序列鑑定二個序列之間的相似程度，其表示第一個序列偏離第二個序列的程度。在本發明的申請日,NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)在Internet站點(http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/)中提供了對標準的BLAST計算機序列同源性檢索的可能性。在[Altschuletal(1997),"GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms",NucleicAcidsRes.25:3389-3402]中對BLAST程序進行了描述。在本文中，優選的計算機同源性檢索程序為"標準的核苷酸-核苷酸BLAST[blastn]"檢索，該定義與在本發明的申請日，在NCBI的Internet站點上設置檢索條件Lowcomplexity;Expect:10，WordSize:11相一致。在程序中還引進了參考序列，並且該程序能夠鑑定出發布序列的片段以及其與對應的參考序列片段的相同百分比。鑑定胺基酸序列類似於核苷酸同源性分析，在本文中，優選的計算機同源性檢索程序為"標準的蛋白質-蛋白質BLAST[blastn]，，檢索，該定義與在本申請的申請日，在NCBI的Internet站點上設置Composition-basedstatistics:yes，檢索條件Lowcomplexity;Expect:10,WordSize:3，Matrix:BLOSUM62,GapCosts:Existence11Extension1相一致。圖例圖1顯示了細菌細胞膜中可預測的if爭膜區域以及從CAal20中推斷出的YjaE蛋白質位置。箭頭處的數字表示在胺基酸序列中的位置(SEQIDNo.2)以及表示圍繞跨膜區域的胺基酸。實施例材料和方法空班測定--通過瓊脂覆蓋法確定對噬菌體的抗性。該方法用於評價給定的乳酸乳球菌突變菌抹對噬菌體的抗性。將該給定菌株在給定噬菌體下獲得的pfti/ml(每ml的空斑形成單位)與親菌株在相同噬菌體作用下獲得的pfii/ml的差別進行比較。各個空斑均起源於一個噬菌體，且在生長著細菌的菌莒上呈現出清晰的無細菌生長的圓形區域。期望的菌株在盤上(M17+所需的添加劑)呈現清晰的條紋。5-10個單獨的菌落被接種在培養液體中，且檢測呈指數生長的培養物的OD600。當培養物的OD6。。在0.5和0.8之間時，將100pl的培養物與100jil的噬菌體混合。對噬菌體-溶液進行這樣的重複操作，滴定度範圍在1011pfu/ml到10pfWml,如在親菌林中所測量的。細胞和噬菌體在總量為3ml的上層瓊脂中混合(M17，10mMCaCI2，0.75%瓊脂)，再倒到盤(M17,10mMCaCl2,1.5%瓊脂)上，並在30°C培育過夜。通過計算形成的空斑數目來評價盤。確定用於給定菌抹的噬菌體的pfli/ml。給定菌抹的噬菌體抗性由在該菌株中發現的pfWml與在親菌林中發現的來決定。檢驗在細菌膜中是否存在活性YJAE蛋白質用溶解酵素消化細胞，使細胞壁與膜分離，並通過標準步驟，如差速離心收集膜。使用用於膜蛋白質的標準的蛋白質增溶試劑盒，例如PierceBiotechnology(Rockford，IL,USA)的用於膜蛋白質的2-D樣品製劑15(2-DSamplePreparationforMembraneProteins)或BioRad(Hercules,CA,USA)ReadyPrepProteinExtractionKit(MembraneIorII),通過增;容作用將蛋白質從膜中分離。然後，按照標準程式將溶解的蛋白質在pH7.5-9.5(YjaE蛋白質的pl是8.6-8.9)的範圍內進行二維凝膠電泳。YjaE蛋白質的分子量(85kDa)和pi將決定其在二維凝膠中的位置，而YjaE蛋白質的缺席或改變(例如，截短的)將與親菌林形成對比。親菌林的YjaE蛋白質的確認可通過凝膠內消化和質譜來驗證。文獻Valyasevi，R.，Sandine，W.E.,Geller，B丄.,1991.Amembraneproteinisrequiredforbacteriophagec2infectionofLactococcuslactissubsp.lactisC2.J.Bact.173(19)，6095-6100.Silveira,M.G"Baumgartner,M.，Rombouts,F.M.,Abee,T.，2004.Effectofadaptationtoethanoloncytoplasmicandmembraneproteinprofilesof(9ewococcwsoe"/.Appl.Environ.Microbiol,70(5)，2748-2755.Nouwens，A.S.,Cordwell，S.J.,Larsen,M,R.，Molloy，M.P.，Gillings,M.,Willcox，M.D.P.，Walsh,B丄,2000.Complementinggenomicswithproteomics:themembranesubproteomeofi^Mi/o附owosam/g/wo犯PAOl.Electrophoresis21,3797-3809.Molloy,M.P.,Herbert,B.R.,Slade,M.B.,Rabilloud，T.,Nouwens，A.S.,Williams,K丄.，Gooley，A.A.，2000.ProteomicanalysisoftheEscAm'c/z/aco/z'outermembrane.Eur.J.Biochem.267,2871-2881.實施例l:炎#乙諒^霧#*的"'"￡差廚關去法#菌抹/丄〃05:參見W001/7733416Stuer-Lauridsen,B.,Janzen,T.,Schnabl,J.,Johansen，E.,2003.Identificationofthehostdeterminantoftwoprolate-headedphagesinfectingZ^ctococcws/adVirology309,10-17.載體pGhost載體詳細說明參見下列文章Maguin，E.，Pr6vost,H.,Gruss，A.,1996.Constructionoffood-grademutantsoflacticacidbacteria.Lait76，139-146.Biswas,I.，Gruss,A.,Ehrlich,S.D.，Maguin，E.，1993.High-efficiencygeneinactivationandreplacementsystemforGram-positivebacteria.JournalofBacteriology175(11)，3628-3635.失活歩驟的描述生成650bp的PCR片段，覆蓋在yjaE基因從nt703-1344的中間部分。使用的模板是來自乳酸乳球菌CAal20的染色體DNA。該片段被克隆於載體pGhost9中。該PCR片段含有獨特的BsrGJKH位點，當其被克列諾片段填充並再連接時，將變為SmzBI位點並導致一個鹼基的移碼。通過同源重組，將此構建併入到CAal20的yjaE的染色體版本中，則載體pGhost9隨後成功雜交，留下移碼突變。產生的突變通過限制性分析和對PCR片段測序進行驗證，突變株被命名為CAal20AyjaE。在乳酸乳球菌IL1403上進行類似的構建，其突變株命名為IL1403AyjaE。通過空斑測定測試這些菌林對感染親菌抹的噬菌體的抗性，發現這些構建的菌抹對一些噬菌體(即用YjaE蛋白質感染的噬菌體)產生了抗性。該失活性的yjaE基因是基於與構建的片段的同源重組，當代替正常片段時，該構建的片段經改性產生功能障礙的基因。代替是通過使用pGhost9作為載體進行，但也可用任何其他沒有在乳酸乳球菌中進行重組功能的載體。結果以下的噬菌體組淨皮用於進行如上描述的空斑測定。c2種的扁長噬菌體blL67、CHL92、MPCIOO、c2、3、24、116、122、134、180、199、227、364、670。936種的小的等軸噬菌體234、649。p335種的小的等軸噬菌體228。結果示於以下表l中。表1示出了一些噬菌體對兩種乳酸乳球菌菌抹和他們的；^五突變抹產生感染(+)或不產生感染(-)-IL1403IL1403AyjaCAal20CAal20deltayja3+-+-24+-+-116++--122++--134++--180++--199++--227++--228++--234--+-364--+-649--+-670--++CHL92+-+-blL67+---MPC100++--c2++--結果表明，具有失活性的；^五基因的菌抹對c2種的扁長噬菌體和936種的小的等軸噬菌體均具有改善的抗噬菌體性。進一步測試菌抹的存活性、生長速率和產酸性。對比相應的野生型菌抹，沒有可測量的負面影響被發現。實施例2:用於產生自發性抗噬菌體突變體的一般方法該方法可通過在yjaE基因中由DNA測序確定的突變而被用於獲得自發性抗噬菌體突變體。從保存的冷凍儲存中刮下期望的菌抹在10ml的培養液體M17(OxoidCM0817，OxoidLtd.,Basingstoke,Hampshire,England)+所需的添加劑中進行接種。在本例中，所述的添加劑是0.5%的乳糖用於菌抹CAal20和34，0.5%的葡萄糖用於菌林IL1403和Bu2-60。檢測呈指數生長的培養物的OD600。當培養物的OD600達到0.5和0.8之間時，將100ul的培養物與感染複數(MOI)為每個細胞1-10個噬菌體的噬菌體混合。細胞和噬菌體在總量為3ml的上層瓊脂中混合(M17,10mMCaC12，0.75%瓊脂)，再倒到盤(M17,10mMCaC12,1.5%瓊月旨)上，並在30℃培育一天或兩天。大多數的細胞都被感染性的噬菌體殺滅，但自發性抗噬菌體的突變體菌落最終將出現。自發性抗噬菌體的突變體的出現的頻率在不同菌林中可有所不同。取出抗噬菌體的突變體，在盤上整齊劃線，通過在本文中它處所描述的空斑測定，測試對產生這些突變體的步鑑中所用的噬菌體以及對感染親菌株的其他噬菌體的噬菌體抗性。隨後，將突變體在培養液體中接種，並取出染色體DNA,用於產生包括了期望基因的PCR片段，本例中，該期望基因是yjaE基因。然後對這些PCR片段進行測序，以確定各突變體中的DNA序列與親抹中的是怎樣不同。實施例3:自發性抗噬菌體yjaE突變體的產生菌抹IL1403:乳酸乳球菌。參見W001/77334CAal20:乳酸乳球菌。參見Chr.HansenCultureCollection.Stuer隱Lauridsen,B.,Janzen,T.,Schnabl，J.,Johansen,E.,2003.Identificationofthehostdeterminantoftwoprolate-headedphagesinfectingLactococcuslactis.Virology309:10-17。Bu2-60:乳酸乳球菌。Wetzel,A"Neve,H.，Geis,A.,Teuber,M.，1986.Transferofplasmid-mediatedphageresistanceinlacticacidStreptococci.Chem.Mikrobiol.Technol.Lebensm.10:86-89。菌抹34:乳酸乳球菌。參見Chr.HansenCultureCollection.菌抹CAal20和34可由Chr.Hansen購得。歩驟的描述按照在"材料和方法"中所描述的，菌抹經過該歩驟而產生自發性抗噬菌體的突變體。在不同組合下的一個菌林和一個噬菌體分別為菌抹34和(D24,Bu2-60和03,Bu2-60和①364,IL1403和OblL67,CAal20和0>24。以染色體DNA為基礎，從每個自發性突變體產生包括了全部yjaE基因的PCR片段以及產生從該基因的起始和終止密碼子開始的大約150nt上遊和下遊的基因的PCR片段。對這些PCR片段進行測序，並將每個突變體的序列與親菌林的比較。結果用PCR和DNA測序對總共21個自發性突變體進行了研究。所有的突變體菌抹均具有yjaE基因的突變(詳細情況見表2)。表2.自發性突變。所有的位置均指DNASEQno.l突變描述192位的a在8個自發性突變體中缺失a(3個來自34,l個來自CAa120,1個來自IL1403,以及3個來自Bu2-60),導致在224-226位出現一個終止密碼子。192位的al個自發性突變體(來自34)具有一個額外的a,導致在204-206位出現一個終止密碼子。291位的a在2個自發性突變體中缺失a(來自IL1403),導致在350-352位出現一個終止密碼子。419位的c在1個自發性突變體(來自CAal20)中c被a取代，導致在418-420位出現一個終止密碼子。766位的c在2個自發性突變體(來自CAal20)中c被t取代，導致在766-768位出現一個終止密碼子。865位的c在1個自發性突變體(來自Bu2-60)中c淨皮t取代，導致在865-867位出現一個終止密碼子。998位的a在2個自發性突變體中缺少a(—個來自IL1403,一個來自CAal20),導致在1040-1042位出現一個終止密碼子。1869位的c在1個自發性突變體(來自Bu2-60)中c被a取代，導致在1867-1869位出現一個終止密碼子。-111到-16位在1個自發性突變體(來自Bu2-60)中發現96nt的缺失，導致從yjaE基因的上遊發生啟動子的缺失。601到1987位在1個自發性突變體(來自CAal20)中發現1386nt的框內缺失，其跨越了推導YjaE蛋白質的預期的大外環的主要部分和在預期的膜錨定區的第一個跨膜區(對應於推導蛋白質序列中的胺基酸201-663)2007到2090位在l個自發性突變體(來自Bu2-60)中的推導YjaE蛋白質的預期的膜錨定區中發現84nt的框內缺失(對應於推導蛋白質序列中的胺基酸670-697)還測試了這些突變體對以下表3中所示的其他噬菌體的噬菌體抗性。所有的自發性抗噬菌體突變體均顯示出對c2種的扁長噬菌體和936種的小的等軸噬菌體的改善的抗噬菌體性。每個菌林的所有自發性抗噬菌體突變體顯示出相同的噬菌體感染分布謙，因此表中示出自發性抗喧菌體突變體的欄代表了本例中所有#皮研究的自發性突變體。表3.示出了不同乳酸乳球菌菌林和它們的構建的(AyjaE)或自發性的(spont)yjaE突變體被一些噬菌體感染(+)或不被感染(-)。自發性突變體的詳細情況參見表2。Complextableseetheoriginaldocumentpagexc2種的扁長噬菌體blL67、CHL92、MPCIOO、c2、3、24、116、122、134、180、199、227、364、670。936種的小的等軸噬菌體234、649。p335種的小的等軸噬菌體228。實施例4:預測推導YjaE五蛋白質中的跨膜區一些公共網站提供從氨基^列預測蛋白質的跨膜區的服務。例如SwissEmbnet的www.ch.embnet.org,和DTU的PredictionServersofComplextableseetheoriginaldocumentpagexCenterforBiologicalSequenceAnalysis的www.genome.cbs.dtu.dk/services/。將由CAal20的yjaE基因序列4,導出的胺基酸序列輸入SwissEmbnet的TMPRED，則給出了如圖1所示的預測的跨膜區和在YjaE蛋白質的細菌膜中的位置。由DTU的CBSServer的預測給出了類似的結果。權利要求1.乳酸菌，其中，由yjaE基因表達的YiaE蛋白質是基本上失活性，其中，yjaE基因表達的YjaE蛋白質包含了選自由以下序列組成的組中的DNA序列(a)在SEQIDNO1(IL1403yjaEDNA編碼序列)中位於1-2400處的DNA序列；(b)編碼多肽的DNA序列，選擇性地具有YjaE蛋白質活性，即與位於SEQIDNO2(IL1403Yjae蛋白質序列)1-799處的多肽序列的至少70％相同。2.權利要求1的乳酸菌，其中，所述的基本上失活性的YjaE蛋白質對於噬菌體感染而言是功能上失活性。3.權利要求2的乳酸菌，其中，所述細菌具有對噬菌體改善的抗性，優選地顯示出在pfti/ml上降低的因子至少為50，例如，至少100，如500，優選至少為1000，更優選至少為10000或更多。4.前述任何一項權利要求中的乳酸菌，其中，乳酸菌是乳球菌屬，優選是選自由以下乳球菌屬的菌種所組成的組乳酸乳球菌乳脂亞種，乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙醯乳酸生物變種。5.前述任何一項權利要求中的乳酸菌，其中，編碼多肽(b)的DNA序列是編碼與位於SEQIDNO2中的1-799處的多肽序列至少90%相同的多肽的DNA序列，更優選的是編碼與位於SEQIDNO2中的1-799處的多肽序列至少96%相同的多肽的DNA序列。6.前述任何一項權利要求中的乳酸菌，其中，yjaE基因編碼的YjaE蛋白質缺少至少一個可預測的跨膜區。7.前述任何一項權利要求中的乳酸菌，其中，yjaE基因編碼的YjaE蛋白質，其中，YjaE蛋白質的細胞內和細胞外定位區的可預期分布相對於在菌抹IL1403中位置發生了變化。8.前述任何一項權利要求中的乳酸菌，其中，YjaE蛋白質是失活性。9.前述任何一項權利要求中的乳酸菌，其中，YjaE基因是失活性。10.前述任何一項權利要求中的乳酸菌，其中，YjaE蛋白質是失活性，其是由於向；YjaE基因引入了適當的改性，優選的適當的改性選自由以下情況組成的組終止密碼子，可導致如移碼、缺失和突變的插入。11.前述任何一項權利要求中的乳酸菌，其中，乳酸菌的特徵是具有對至少一種噬菌體有改善的抗性，其中，噬菌體是選自適當的有代表性的不同的噬菌體組，其中，適當的有代表性的不同的噬菌體組優選含有不同的相關的噬菌體，並代表c2種的扁長噬菌體、936種的小的等軸噬菌體、p335種的小的等軸噬菌體和949種的大的等軸噬菌體。12.前述任何一項權利要求中的乳酸菌，其中，乳酸菌在細胞膜中不含可測量的活性YjaE蛋白質的量。13.—種起子培養物組合物,包含權利要求l-12中任何一項的乳酸菌，其中，優選的起子培養物組合物具有活細胞的濃度範圍是每克組合物中為104-1012cfu。14.一種製備食品或飼料製品的方法，包含向食品或飼料製品起始材料中加入權利要求13的起子培養物組合物，並在具有正常代謝活性的乳酸菌的條件下將該接種的起始材料保持。15.—種製備權利要求1-12中任何一項的乳酸菌的方法，其中，由yjaE基因表達的YjaE蛋白質是基本上失活性，包含對yjaE基因進行適當改性，從而不產生活性YjaE蛋白質的表達，其中，yjaE基因包含了選自由以下序列組成的組中的DNA序列(a)在SEQIDNO1(IL1403YjaEDNA編碼序列)中位於1-2400處的DNA序列；(b)編碼多肽的DNA序列，可選擇性具有YjaE蛋白質活性，即與位於SEQIDNO2(IL1403YjaE蛋白質序列)1-799處的多肽序列的至少80%相同。全文摘要一種乳酸菌(LAB)，其中的YjaE蛋白質是基本上失活性，從而該LAB得到改善的抗噬菌體抗性，以及一種起子培養物組合物包含該乳酸菌和使用該起子培養物製備食品或飼料製品。文檔編號C12N1/21GK101175848SQ200680001787公開日2008年5月7日申請日期2006年1月6日優先權日2005年1月6日發明者託馬斯·簡森,柏姬·斯圖-勞裡森申請人:科·漢森有限公司