一種山羊支原體肺炎亞種選擇性分離培養基及其製備方法與流程
2023-06-10 05:46:01
本發明涉及一種山羊支原體肺炎亞種選擇性分離培養基及其製備方法，屬於獸醫生物學技術領域。
背景技術：
山羊傳染性胸膜肺炎只發生於山羊，多感染3歲以下的山羊，具有顯著的地方流行性，陰雨連綿、寒冷潮溼、羊群密集、擁擠等應激均能誘發本病。舊疫區發病的季節主要是冬季和早春枯草季節羊只營養缺乏，機體抵抗力降低；新疫區的發病，主要原因是引進病羊或帶菌羊，伴隨運輸應激、飼養管理環境改變、草料更換、氣候和水土差異等導致的群體發病。山羊傳染性胸膜肺炎公認的病原體為山羊支原體肺炎亞種，該病原是一種能獨立生活的原核生物，為絲狀支原體族的一員，主要存在於病羊的肺組織、胸膜滲出物及縱膈淋巴結中。山羊支原體肺炎亞種對營養要求嚴格，在初次分離時生長緩慢，在臨床病員分離時常常被環境中的精氨酸支原體和支原體綿羊肺炎亞種的生長所掩蓋，無法分離到所需的目標支原體。在實際生產過程中，山羊傳染性胸膜肺炎典型症狀山羊病料的病原支原體的分離率極低，甚至由於精氨酸支原體和支原體綿羊肺炎亞種等病原微生物的汙染低至1-5％，亟待一種新的實驗方案解決山羊支原體肺炎亞種的分離問題。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種適合山羊支原體肺炎亞種生長，生長快、活菌滴度相對較高且能夠抑制精氨酸支原體和支原體綿羊肺炎亞種生長的山羊支原體肺炎亞種選擇性分離培養基，使用該選擇性分離培養基用於臨床分離培養山羊支原體肺炎亞種，可以提高分離過程中支原體生長速度，山羊支原體肺炎亞種的分離率高達80％以上，特異性和敏感性顯著提高，用於山羊支原體肺炎亞種分離培養、生化特徵、遺傳、免疫等方面的研究。本發明的技術方案如下：
一種山羊支原體肺炎亞種選擇性分離培養基，其主要成分為水解乳蛋白、酵母浸粉、葡萄糖、MEM培養基、PPLO肉湯粉、丙酮酸鈉、1％酚紅溶液、特異性生長抑制血清和去離子水；
所述特異性生長抑制血清為綿羊肺炎亞種支原體特異性生長抑制血清與精氨酸支原體特異性生長抑制血清等體積混合。
進一步的，10L本發明選擇性分離培養基中，包括水解乳蛋白15-40g、酵母浸粉40-60g、葡萄糖15-30g、MEM培養基5-15g、PPLO肉湯粉10-20g、丙酮酸鈉10-30g、1％酚紅溶液(質量分數)10-20mL、健康馬血清1-2L、特異性生長抑制血清10-30mL、去離子水調整至10L；
所述特異性生長抑制血清為綿羊肺炎亞種支原體特異性生長抑制血清與精氨酸支原體特異性生長抑制血清等體積混合。
本發明中，特異性生長抑制血清的製備工藝如下：
綿羊肺炎亞種支原體特異性生長抑制血清的製備：
利用綿羊肺炎亞種支原體培養物免疫紐西蘭白兔，獲得生長抑制效價不低於26的綿羊肺炎亞種支原體特異性生長抑制血清，即得。
精氨酸支原體特異性生長抑制血清的製備：
利用精氨酸支原體培養物免疫紐西蘭白兔，獲得生長抑制效價不低於26的精氨酸支原體特異性生長抑制血清，即得。
將上述綿羊肺炎亞種支原體特異性生長抑制血清和精氨酸支原體特異性生長抑制血清等體積混合，過濾除菌後備用，即得特異性生長抑制血清。
優選的，10L本發明選擇性分離培養基中，包括水解乳蛋白20g、酵母浸粉55g、葡萄糖20g、MEM培養基12g、PPLO肉湯粉18g、丙酮酸鈉15g、1％酚紅溶液15mL、健康馬血清1500mL、特異性生長抑制血清20ml、去離子水調整至10L。
本發明還包括山羊支原體肺炎亞種選擇性分離培養基的製備方法，10L選擇性分離培養基來計，具體步驟如下：
按配比稱取水解乳蛋白、酵母浸粉、葡萄糖、MEM培養基、PPLO肉湯粉、丙酮酸鈉、1％酚紅溶液，溶解於去離子水5000mL，攪拌，使之完全溶解，使用去離子水調整至8480mL,用0.45μm濾膜過濾除菌，4℃保存備用。
使用前，加入健康馬血清1500mL、特異性生長抑制血清20mL，用1mol/L氫氧化鈉溶液調整pH為7.6-7.8，優選的，pH為7.7，使用過濾除菌去離子水適量調整至總體積10L，即得山羊支原體肺炎亞種選擇性分離液體培養基。
本發明與現有技術相比具有以下優點：
本發明山羊支原體肺炎亞種選擇性分離培養基用於臨床分離培養山羊支原體肺炎亞種，提高了分離過程中支原體的生長速度，提高了山羊支原體肺炎亞種的分離率，分離率為80％以上。本發明不僅可用於山羊支原體肺炎亞種的快速分離鑑定，又可用於動物疫苗企業山羊支原體肺炎亞種菌種的製備與純化。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
實施例1山羊支原體肺炎亞種選擇性分離培養基及其製備方法
選擇性分離培養基的組成：水解乳蛋白20g、酵母浸粉55g、葡萄糖20g、MEM培養基12g、PPLO肉湯粉18g、丙酮酸鈉15g、1％酚紅溶液15mL、健康馬血清1500mL、特異性生長抑制血清20ml、去離子水調整至10L；
特異性生長抑制血清的製備工藝如下：
綿羊肺炎亞種支原體特異性生長抑制血清的製備：
利用綿羊肺炎亞種支原體培養物免疫紐西蘭白兔，獲得生長抑制效價不低於26的綿羊肺炎亞種支原體特異性生長抑制血清，即得。
精氨酸支原體特異性生長抑制血清的製備流程：
利用精氨酸支原體培養物免疫紐西蘭白兔，獲得生長抑制效價不低於26的精氨酸支原體特異性生長抑制血清，即得。
將上述綿羊肺炎亞種支原體特異性生長抑制血清和精氨酸支原體特異性生長抑制血清等體積混合，過濾除菌後備用，即得特異性生長抑制血清。
上述山羊支原體肺炎亞種選擇性分離培養基的製備方法，具體步驟如下：
按配比稱取水解乳蛋白、酵母浸粉、葡萄糖、MEM培養基、PPLO肉湯粉、丙酮酸鈉、1％酚紅溶液，溶解於去離子水5000mL，攪拌，使之完全溶解，使用去離子水調整至8480mL,用0.45μm濾膜過濾除菌，4℃保存備用。
使用前，加入健康馬血清1500mL、特異性生長抑制血清20mL，用1mol/L氫氧化鈉溶液調整pH至7.7，使用過濾除菌去離子水適量調整至總體積10L，即得山羊支原體肺炎亞種選擇性分離液體培養基。
實施例2山羊支原體肺炎亞種選擇性分離培養基及其製備方法
選擇性分離培養基的組成：水解乳蛋白15g、酵母浸粉55g、葡萄糖15g、MEM培養基15g、PPLO肉湯粉20g、丙酮酸鈉12g、1％酚紅溶液15mL、健康馬血清1500mL、特異性生長抑制血清20ml、去離子水調整至10L。
特異性生長抑制血清及山羊支原體肺炎亞種選擇性分離培養基的製備方法同實施例1。
實施例3山羊支原體肺炎亞種選擇性分離培養基及其製備方法
選擇性分離培養基的組成：水解乳蛋白35g、酵母浸粉40g、葡萄糖20g、MEM培養基15g、PPLO肉湯粉15g、丙酮酸鈉20g、1％酚紅溶液18mL、健康馬血清1800mL、特異性生長抑制血清20ml、去離子水調整至10L。
特異性生長抑制血清及山羊支原體肺炎亞種選擇性分離培養基的製備方法同實施例1。
試驗例1本發明山羊支原體肺炎亞種選擇性分離培養基的應用
對實施例1、實施例2和實施例3中的山羊支原體肺炎亞種選擇性分離培養基進行應用，以PPLO培養基、Hayflick’s培養基作為對照。以PCR方法檢測山羊支原體肺炎亞種感染陽性的47份病料為研究對象，使用上述的5種培養基進行了山羊支原體肺炎亞種病原分離鑑定，結果如表1所示：
表1