一種葡激酶及其表達載體的製作方法

2023-06-09 15:19:11 1

專利名稱：：一種葡激酶及其表達載體的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物醫藥領域，具體地說涉及一種具有溶栓作用的葡激酶及其表達載體。
背景技術：
：心腦血管疾病嚴重威脅人類健康，是主要的致死性疾病。血栓的形成是許多心腦血管疾病的誘因，也是造成死亡和病殘的主要原因。溶栓療法是這類疾病的主要治療手段之一。自80年代以來溶栓治療己經成為急性心肌梗死的常規療法。目前臨床常用的溶栓類藥物包括尿激酶(UK)，鏈激酶(SK)，重組組織型纖溶酶原激活物(r-tPA)，但在臨床的應用中均有其局限性。天然葡激酶(staphylokinase，SAK)是溶原性金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)合成的一種單鏈蛋白，由136個胺基酸組成，其中包括45個帶電胺基酸殘基不含半胱氨酸及糖基，分子量15.5kDa。1948年Lack發現金黃色葡萄球菌培養物血清中有一種蛋白質能溶解人的血栓，進一步的研究發現SAK可以選擇性地作用T纖維蛋白原，揭示了葡激酶具有作為良好的溶栓藥物的應用前景。目前，已有許多作為溶血栓藥物的葡激酶的專利申請，如《溶血栓藥物重組葡激酶》(專利號ZL00112674.1)，《利用基因工程技術生產葡激酶的方法》(專利號ZL98102132.8)，《葡激酶基因及其高表達工程菌株》(專利號ZL97105988.8)，《,中重組葡激酶的製備方法》(專利號ZL94112105.4)等。以上發明中所述葡激酶序列多從噬菌體基因組中獲得。
發明內容本發明第一目的是提供一種具有高效溶栓作用的葡激酶。木發明第二目的是提供含有上述葡激酶基因的表達載體。本發明第三目的是提供上述葡激酶的製備方法。本發明第四目的是提供上述葡激酶在製備治療心腦血管疾病藥物上的應用。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種葡激酶，是具有SEQIDNo:1所示的胺基酸序列的多肽。編碼上述葡激酶的基因，具有SEQIDNo:2所示的DNA序列。含有上述葡激酶基因的重組表達載體。所述的載體是指pBV220、pET17、pET15或pET28等。含有上述葡激酶基因的宿主菌。所述的宿主菌是指Ac。〗i21、￡c。，H5a、￡c。頂B101、Ec。BJM109或Acoh'JM103等。上述葡激酶在製備治療心腦血管疾病藥物上的應用。上述葡激酶在製備治療溶血栓藥物上的應用。上述葡激酶在製備治療心肌梗塞藥物上的應用。含有上述葡激酶基因的重組表達載體的構建方法，包括以金黃色葡萄球菌1.1476的DNA為模板，以P1和P2為引物進行PCR擴增，得PCR擴增產物；然後將PCR擴增產物和質粒載體分別用EcoRI和BamHI進行雙酶切，再用T4連接酶將酶切後的上述質粒載體和所得葡激酶基因DNA片段進行連接，獲得含有葡激酶基因的載體質粒；再將該載體質粒轉化入宿主菌，獲得含有本發明葡激酶基因的工程菌株；其中所述的引物為Pl:5'GGAATTCAAATGTGAAGTTCATTCGACAAAGGA3'(SEQIDNo:3)P2:5'CGGGATCCTTATTTCTTTTCTATAAGAAC3'(SEQIDNo:4)。上述構建方法中所述的質粒載體是指pBV220、pET17、pET15或pET28等。上述構建方法中所述的宿主菌是指Aco7iBL21、EcohDH5a、￡c。h麗01、￡coh'JM109或￡c。h'JM103等。下面以質粒載體pBV220、大腸桿菌BL21為例，具體介紹上述含有本發明葡激酶基因的重組表達載體的構建方法，具體包括如下步驟(1)、以金黃色葡萄球菌1.1476(Staphylococcusaureus1.1476)的總DNA為模板，以P1和P2為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；所述引物為Pl:5'GGAATTCAAATGTGAAGTTCATTCGACAAAGGA3'(SEQIDNo:3)P2:5'CGGGATCCTTATTTCTTTTCTATAAGAAC3'(SEQIDNo:4)(2)、將步驟(1)所得PCR擴增產物和pUC18質粒分別用EcoRI和BamHI進行雙酶切，然後用T4連接酶將所得酶切後的擴增產物與酶切後的pUC18連接，得連接產物；將連接產物轉化大腸桿菌DH5oc感受態細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質粒，獲得含有SAK基因的pUC18重組質粒；(3)、用EcoRI和BamHI雙酶切步驟(2)所得的pUC18重組質粒和pBV220質粒，然後用T4連接酶將酶切後的pUC18重組質粒中的SAK基因與pBV220質粒連接，得到連接產物；將連接產物轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，篩選陽性克隆，得到含有本發明葡激酶基因的工程菌株BL21。與現有技術相比，本發明具有的優點和有益效果為(1)本發明葡激酶溶栓作用強，可用於製備治療心肌梗塞等血栓疾病藥物；(2)本發明葡激酶表達載體表達量高，rSAK的表達量佔菌體總蛋白的45%以上；(3)本發明葡激酶溶栓活性高，其比活性為4.0xl04AU/mg。圖1為PCR擴增產物的電泳圖譜1為分子量標準；25為PCR擴增產物。圖2為表達載體pBV220-SAK的鑑定電泳圖譜1.為分子量標準；2.為pBV220-SAK質粒；3.為經EcoRI/BamHI雙酶切後的pBV220-SAK質粒；4.為經EcoRI/BamHI雙酶切後的pBV220空載體5.為重組質粒pBV220-SAKPCR擴增產物。圖3為重組葡激酶對電剌激引起的小型豬冠脈血栓的溶解作用的柱形圖圖4為重組葡激酶對心肌梗死作用的柱形圖具體實施方式下面以具體實施例對本發明作進一步的說明，但是不對本發明構成任何限制。如無特別指明，下述實施例中所用的試劑、試驗方法等皆為本領域技術人員所熟知。實施例1本發明葡激酶基因的克隆和表達載體的構建(1)、金黃色葡萄球菌總DNA的提取取0.5ml金黃色葡萄球菌1.1476(購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)的保存菌液接種於100mlLB培養基中，37。C震蕩培養過夜，然後在4。C、7000rpm離心8分鐘，收集菌體，用20mlTE洗菌體一次，再用20mlTE重懸菌體，向其中加入120ul蛋白酶K，混勻，加入2.2ml10%的SDS，混勻，再在37。C溫浴1小時，然後以等體積的酚抽提一次(顛倒混勻1分鐘)；0.1體積的3MNaAc(pH5.2)，等體積的異丙醇，沉澱2小時；4°C、12000rpm下離心10分鐘，去上清液，將沉澱用75%乙醇洗，然後溶於200ulddH20中，取2ul樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳，同時取適量檢測其0D260和0D280，測定其純度和濃度。(2)、葡激酶基因的PCR擴增設計一對寡核苷酸引物P1和P2，其序列為Pl:5'GGAATTCAAATGTGAAGTTCATTCGACAAAGGA3'(SEQIDNo:3)P2:5'CGGGATCCTTATTTCTTTTCTATAAGAAC3'(SEQIDNo:4)在引物的5'和3'端分別引入了EcoRI和BamHI酶切位點，以步驟(1)的總DNA為模板，進行PCR擴增；PCR擴增條件為變性94。C40秒，退火52°C40秒，延伸72。C1分鐘，共進行30個循環，得擴增產物；取擴增產物5ul進行瓊脂糖凝膠電泳。結果(見圖1)在約400bp的位置處有一DNA條帶，其大小與葡激酶基因大小一致，說明擴增得到的可能是葡激酶基因。(3)、葡激酶基因的鑑定用EcoRI(購自華美生物工程公司，下同)和BamHI(購自華美生物工程公司，下同)分別雙酶切上述PCR擴增產物和載體質粒pUC18(軍事醫學科學院基礎醫學研究所保存)，T4DNA連接酶(購自華美生物工程公司，下同)連接酶切後的擴增產物和載體質粒pUC18，得連接產物；轉化連接產物進入大腸桿菌DH5a感受態細胞，篩選陽性克隆，提取陽性克隆中的質粒DNA，用EcoRI和BamHI雙酶切質粒DNA進行分析，證明獲得有SAK基因插入的陽性重組克隆，命名此克隆為pUC18-SAK，利用自動序列分析儀進行DNA序列分析。序列分析結果顯示所得葡激酶的核苷酸序列如SEQIDNo:2所示，其胺基酸序列如SEQIDNo:l所不。(4)、含有本發明葡激酶基因的表達載體的構建EcoRI和BamHI雙酶切步驟(3)所得的pUC18-SAK質粒和表達載體pBV220質粒(由中國預防醫學科學院病毒所侯雲德教授惠增)，用T4DNA連接酶連接酶切後的pUC18-SAK質粒中的SAK基因和pBV220質粒，轉化連接產物進入大腸桿菌BL21(來自軍事醫學科學院基礎醫學研究所)感受態細胞中，篩選陽性克隆，提取陽性克隆的質粒DNA;EcoRI和BamHI雙酶切陽性克隆中的質粒DNA;同時利用提取的質粒DNA為模板，以Pl:5'GGAATTCAAATGTGAAGTTCATTCGACAAAGGA3'(SEQIDNo:3)P2:5'CGGGATCCTTATTTCTTTTCTATAAGAAC3'(SEQIDNo:4)6為引物進行PCR擴增，將前述酶切產物和PCR擴增產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果(見圖2)證明獲得了在pBV220中插入了SAK基因的表達載體，插入的重組質粒。命名為pBV220-SAK。(5)、含有本發明葡激酶基因的工程菌的表達活性檢測試驗將步驟(4)經篩選獲得的重組克隆轉種於含氨苄青黴素(Ap+)的M9-CA培養基(培養基組成為NA2HP0412.8g、KH2P043.Og、NaCl0.5g、NH4C10.5g、葡萄糖10.Og和維生素Bl1ixg/ml)中，30°C培養2小時至0D600為0.40.6，然後迅速移至42°C水浴中震蕩培養4.5小時，在10000rpm下離心15min，載樣緩衝液重新懸浮菌體，100°C煮沸處理5分鐘，然後進行SDS-PAGE檢測。結果顯示，分子量為15kDa的位置有一表達量非常高的蛋A帶，此蛋白的大小與SAK蛋白相同，而空載體對照則無此蛋白帶，說明所獲得的重組克隆能高效表達SAK蛋白，薄層掃描結果顯示，SAK的表達量佔菌體總蛋白的45。/。以上，說明本發明所獲得表達菌株中葡激酶的表達量高於文獻報導的表達量(25%)。實施例2本發明葡激酶溶栓活性試驗(1)、製備纖維蛋白平板稱取125mg瓊脂糖(Biorad電泳級)，加入23ml生理鹽水，煮沸溶解，60。C水浴平衡，加入凝血酶(100IU/ml)(購自生物藥品檢定所)，纖溶酶原(購自生物藥品檢定所)280ri(0.5mg/ml)，要邊加邊搖勻，加2.2ml人纖維蛋白原(購自生物藥品檢定所)(6mg/ml),搖勻，混濁後馬上倒平板(直徑8cm)，4。C冰箱水T放置至少半小時(應在兩大之內使)，充分凝固後待用。(2)、標準品和待測樣品的稀釋標準品為葡激酶標準品(購自生物藥品檢定所)，按如下方法(見表l)進行對倍稀釋，本發明葡激酶樣品根據標示量稀釋至5Pg/ml的濃度，待用。表1葡激酶標準品稀釋倍數表tableseeoriginaldocumentpage7(3)、打孔，點樣在形成的纖維蛋白平板內打孔(直徑2mm)，每孔點樣6W，每個樣品和標準品復孔點樣，溼盒(在飯盒內加少量水以保持一定的溼度)於25"C水平放置16小時。(4)、結果計算和檢定報告點樣平板在黑色背景下縱橫兩次量取溶圈直徑，以各個稀釋度的活性的對數(x)為橫坐標，以溶圈直徑的平均數(四次量取的數值)的對數為縱坐標(y)，採用Excel軟體分析結果。利用統計學軟體中的回歸分析方法作標準曲線，並求得y二a+bx中的a和b及線性回歸係數r值，根據樣品的溶圈直徑可求得樣品的活性。經過計算其溶栓比活性為4.0xl04AU/mg，說明本研究中葡激酶活性較高。實施例3本發明葡激酶對小型豬冠脈血栓的溶栓作用試驗(1)、小型豬冠脈血栓手術過程及模型製備實驗前小型豬(中國實驗小型豬，中國農業大學中國實驗小型豬繁育場提供，雄性，體重2030kg)禁食12h，自由飲水，實驗當天靜脈注射3。％戊巴比妥鈉(20mgkg-I)和肌注氯氨酮(IOmgkg-l)混和麻醉，並靜注戊巴比妥鈉維持麻醉。小型豬仰臥位固定於手術臺上，氣管插管，連接SC-3型電動呼吸機，行人工正壓呼吸；分離右頸總動脈，插入充滿0.5%肝素的塑料管，連於TP-400T壓力換能器上，經AP-641G血壓放大器，測量收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)及平均動脈壓(MABP);分離左股靜脈，插管作給藥、補液及取血用。於第4肋間開胸，暴露心臟，剪開心包，做心包床；分離左冠狀動脈前降支下l/3部位一段血管，約lcm，將彎曲成90。的4#皮下注射針頭刺入上述冠脈，進入血管腔約4mm，並保持與血管內膜接觸，固定，經連線接9V乾電池的正極，負極置於動物皮下，以便形成環路，為了最大限度地減少漏電，除與冠脈接觸部位的電極外，電極其他部分及連線均進行絕緣處理；左心室擬缺血區心外膜表面放置20個標測點心外膜電極，經AB-621G生物電放大器標測心外膜心電圖；四肢插入針狀電極，經AC-601G心電放大器，測量II導聯心電圖(ECGII)。上述諸指標同步記錄於RM-6300八導生理記錄儀上。手術完畢待各項指標穩定後，記錄一次，作為血栓形成前的正常值。而後開始接通直流電，電流強度為150uA，一般於通電後約40min，心外膜電圖ST段開始抬高，再刺激5min，若心外膜電圖ST段不降低，即切斷電源，認為冠脈血栓已形成。為了防止血栓形成或再通後的室顫，整個實驗過程中輸注0.02%鹽酸利多卡因生理鹽水液。(2)、實驗分組及給藥方案30隻小型豬分成5組，每組6隻，在冠脈血栓形成30min後開始靜脈給藥，採用先推注，隨後用蠕動泵恆速輸注的方式給予不同的藥物。溶劑對照組靜脈溶劑對照液，陽性藥對照組靜脈給予重組鏈激酶，受試物各組分別靜脈給予不同劑量的重組葡激酶。靜脈推注體積為5ml，lmin內注畢，輸注速度為0.5ml.min-l，60min內輸畢。各組具體給藥劑量及給藥方式詳見表2。120min後放血處死動物，結束實驗。陽性對照藥重組鏈激酶(recombinantStr印tokinase，r-SK)，上海實業醫大生物技術有限公司生產，批號990101。無菌、白色凍乾粉末，每瓶5mg(5X105IU)。臨用前用無菌注射用水溶解，並用生理鹽水稀釋至所需濃度。溶劑對照(EC):軍事醫學科學院基礎醫學研究所提供，白色絮狀固體。不含重組葡激酶，其組分(人血清白蛋白1.5%，甘露醇1.2%，0.1moL七-lNaCl，0.02moL'L-lPB，pH二7.6)與製劑相同。臨用前用無菌注射用水溶解，並用生理鹽水稀釋至所需濃度。表2各組具體給藥劑量及給藥方式tableseeoriginaldocumentpage9(3)、冠脈血栓溶解測定實驗結束後，取血栓形成部位的冠脈血管段，10%福馬林液固定後，石蠟包埋，以電極剌入點為起點，間隔lmm，橫向連續切成5片，HE染色，顯微鏡下採用落點求積法計算血栓佔管腔百分數。結果(見圖3)與溶劑對照組相比，r-SK組殘存血栓平均減少了34.5%;r-SAK高、中、低3個劑量組分別減少了71.9%、56.6%、34.0%。與r-SK組相比，r-SAK高、中2個劑量組，最大血栓面積分別減少了34.3%、15.4%。上述結果表明r-SAK對電刺激引起的冠脈血栓較r-SK具有更強的溶栓作用。(4)心肌缺血程度及缺血範圍的測定實驗結束後，取出心臟，用生理鹽水洗去血液。主動脈及血栓形成處以下左前支冠脈(LDA)插管，主動脈用伊文斯藍(lmg，mr)進行逆行冠脈灌注，LDA冠脈用磷酸鹽緩衝液同時進行灌注，上述雙向灌注的壓力均為80mmHg，5min後，停止灌注，將血栓形成部位以下的左室，垂直於前降支均勻切成5片，將染色心肌投射描記在透明膠片上，以確定心肌的危險區；然後，常溫下1%TTC染色15min，投射描記在透明膠片上，以確定梗死區；計算梗死區佔心肌百分數及梗死區佔危險區百分數。心臟TTC染色結果(見圖4)表明，溶劑對照組其梗死區佔左室的11.4%。r-SK組及r-SAK高、中、低3個劑量組梗死範圍均明顯減輕(p〈0.010.001)，分別較對照組降低了66.7%、70.2%、59.0%、31.6%，r-SAK與等劑量的r-SK作用相似，說明本發明葡激酶具有較強溶栓作用。SEQUENCELISTING中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所〈120>—種葡激酶及其表達載體〈160〉4〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉136〈212〉PRT<213〉Staphylococcusaureus〈400〉1SerSerSerPheAspLysGlyLysTyrArgLysGlyAspAspAlaSer151015TyrPheGluProThrGlyProTyrLeuMetValAsnValThrGlyVal202530AspGlyLysGlyAsnGluLeuLeuSerProArgTyrValGluPhePro354045lieLysProGlyThrThrLeuThrLysGluLyslieGluTyrTyrVal505560GluTrpAlaLeuAspAlaThrAlaTyrLysGluPheArgValValGlu65707580LeuAspProSerAlaLyslieGluValThrTyrTyrAspLysAsnLys859095LysLysGluGluThrLysSerPheProlieThrGluLysGlyPheVal100105110ValProAspLeuSerGluHislieLysAsnProGlyPheAsnLeulie115120125ThrLysValVallieGluLysLys130135408<212〉廳<213〉Staphylococcusaureus2tcaagttcattcgacaaaggaaaatatagaaaaggcgatgacgcgagttattttgaacca60acaggcccgtatttgatggtaaatgtgactggagttgatggtaaaggaaatgaattgcta120tcccctcgttatgtcgagtttcctattaaacctgggactacacttacaaaagaaaaaatt180gaatactatgtcgaatgggcattagatgcgacagcatataaagagtttagagtagttgaa240ttagatccaagcgcaaagatcgaagtcacttattatgataagaataagaaaaaagaagaa300acgaagtctttccctataacagaaaaaggttttgttgtcccagatttatcagagcatatt360aaaaaccctggattcaacttaattacaaaggttgttatagaaaagaaa408〈210>3〈211>33〈212>DNAArtificial〈220>〈223>PI3ggaattcaaatgtgaagttcattcgacaaagga33〈210〉4〈211〉29<212〉DNAArtificial<223〉P24cgggatccttatttcttttctataagaac29權利要求1、一種葡激酶，其特徵在於是具有SEQIDNo1所示的胺基酸序列的多肽。2、編碼權利要求1所述葡激酶的基因，其特徵在於具有SEQIDNo:2所示的DNA序列。3、含有權利要求2所述葡激酶基因的重組表達載體。4、按照權利要求3所述的重組表達載體，其特徵在於所述的載體是指pBV220、pET17、pET15或pET28等。5、含有權利要求2所述葡激酶基因的宿主菌。6、按照權利要求3所述的宿主菌，其特徵在於所述的宿主菌是指Eco7iBL21、Ecoh'DH5a、^cWiHB101、Ecoh'JM109或Ecoh'JM103等。7、含有權利要求2所述葡激酶基因的重組表達載體的構建方法，具體包括如下步驟(1)、以金黃色葡萄球菌1.1476的總DNA為模板，以P1和P2為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；所述引物為PI:5'GGAATTCAAATGTGAAGTTCATTCGACAAAGGA3'P2:5'CGGGATCCTTATTTCTTTTCTATAAGAAC3'(2)、將步驟(1)所得PCR擴增產物和pUC18質粒分別用EcoRI和BamHI進行雙酶切，然後用T4連接酶將所得酶切後的擴增產物與酶切後的pUC18連接，得連接產物；將連接產物轉化大腸桿菌DH5oc感受態細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質粒，獲得含有SAK基因的pUC18重組質粒；(3)、用EcoRI和BamHI雙酶切步驟(2)所得的pUC18重組質粒和pBV220質粒，然後用T4連接酶將酶切後的pUC18重組質粒中的SAK基因與pBV220質粒連接，得到連接產物；連接產物轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，篩選陽性克隆，得到含有本發明SAK基因的工程菌株BL21。8、權利要求1所述的葡激酶在製備治療心腦血管疾病藥物上的應用。9、權利要求1所述的葡激酶在製備治療溶血栓藥物上的應用。10、權利要求1所述的葡激酶在製備治療心肌梗塞藥物上的應用。全文摘要本發明公開了一種葡激酶及其表達載體，該葡激酶是具有SEQIDNo1所示的胺基酸序列的多肽，其基因編碼序列如SEQIDNo2所示。本發明還公開了含有該葡激酶基因的表達載體。本發明葡激酶溶栓作用強，可用於製備治療心腦血管疾病藥物，尤其是心肌梗塞等血栓疾病藥物；其次本發明葡激酶溶栓活性高，其比活性為4.0×104AU/mg；此外，本發明葡激酶表達載體表達量高，葡激酶的表達量佔菌體總蛋白的45％以上。文檔編號A61K38/49GK101314769SQ200810116348公開日2008年12月3日申請日期2008年7月9日優先權日2008年7月9日發明者徐東剛,旻王,欣蔡,鄒民吉申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所