登革病毒2型ns3蛋白的表位多肽及其應用的製作方法

2023-06-12 18:26:36

專利名稱：登革病毒2型ns3蛋白的表位多肽及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域，特別涉及登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽，還涉及該表位多肽的衍生物和應用。
背景技術：
登革病毒(denguevirus, DV)是引起人類登革熱(classical dengue fever,DF)、登革出血熱(dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克症候群(dengue shocksyndrome,DSS)的病原體。近年來，隨著人口流動的增加及全球氣侯變暖，每年熱帶和亞熱帶地區約有I億人受到該病毒的感染，其中DHF/DSS患者約為50萬人，病死率高達5%，如未得到及時治療，病死率可上升至50%。近年來，在流行地區，DHF/DSS的發病率呈明顯增加趨勢，已成為嚴重的公共衛生問題。但迄今為止，DF、DHF和DSS的發病機制仍不十分清楚，也缺乏安全有效的預防疫苗和治療藥物。因此，DF、DHF和DSS已成為當今世界嚴重的公共 衛生問題，對其病原體、發病機理及防治策略的相關研究具有重要意義。DV是黃病毒屬的單鏈正股RNA病毒，基因組約為10kb、含有一個0RF，編碼3個結構蛋白(C，prM和E)和7個非結構蛋白(NSl-NS2a/2b-NS3-NS4a/4b-NS5)。DV有四個血清型(DV1-DV4)，以蚊蟲為傳播媒介，其中主要流行的是DV2。目前，DV致病機理和人體免疫防禦機制不明，缺乏有效的治療手段，臨床上仍以治療為主。由於人體抵抗不同型DV感染的能力弱，發病地區的人群反覆感染DV是比較常見的，因而潛在的DHF/DSS發生的可能性很大，導致DV的危害性呈上升趨勢。DV致病機理和人體免疫防禦機制不明使得DV的疫苗研究仍處在實驗階段。DV疫苗研究的重點集中在研製四價疫苗，希望獲得能同時針對四型DV的疫苗，從而在根本上防治DV感染和DHF/DSS的出現。減毒四價活疫苗曾一度被認為是最具前景的候選疫苗。但由於是減毒或滅活病原體，存在一定的毒副作用。基因工程疫苗研究雖然取得了較大進步，獲得了各種重組的DV蛋白。但無論是大腸桿菌還是真核體系的酵母菌、杆狀病毒、哺乳動物細胞等表達方式均有不足，且重組蛋白純化複雜，避免蛋白結構和功能改變困難。迄今為止，仍然沒有獲得既安全又有效的疫苗。20世紀80年代初，Lerner等提出發展合成多肽疫苗，並預測合成多肽疫苗將是人類預防疾病的終極武器。合成肽疫苗(synthetic peptide vaccine)就是用化學合成抗原表位胺基酸序列法製備而成的具有保護性作用的類似天然抗原決定簇的多肽疫苗。多肽具有免疫背景明確、穩定、純度高、易於獲得、批間差異極小、無毒副作用等優點，還有一個極大的優勢就在於可對任意胺基酸順序組合進行合成，可以極方便地將多種病原的表位、同類病原不同亞型的表位組合在一起，從而獲得針對多種疾病的超級疫苗。這種疫苗不含核酸，是最為理想的安全新型疫苗，也是目前研製預防和控制感染性疾病和惡性腫瘤的新型疫苗的主要方向之一。對於合成肽疫苗的設計，最重要的一步是找到特異的抗原表位。登革病毒的非結構蛋白3(NS3)是一個多功能蛋白，具有多種酶活性，涉及到病毒多聚蛋白的加工和RNA的複製及5』加帽。該蛋白具有很好的免疫原性，並存在特異的CD4+和CD8+ T細胞識別表位。可誘導機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫反應。
因此，急需一種登革病毒2型NS3蛋白的表位肽，特異性高、免疫原性好。

發明內容
有鑑於此，本發明的目的之一在於提供一個登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽；本發明的目的之二在於提供一個含登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽的衍生物，本發明的目的之三在於提供衍生物在製備預防或治療登革病毒2型感染的藥物中的應用。本發明的目的之四在於提供衍生物在製備診斷或檢測登革病毒2型感染的試劑中的應用。為實現上述發明目的，技術方案為
I.登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽，所述表位多肽的胺基酸序列如SEQ ID NO. I所
/Jn ο2.含權利要求I所述表位多肽的衍生物，所述衍生物為所述表位多肽與載體蛋白·偶聯的交聯體。優選的，所述載體蛋白為牛血清白蛋白。3.所述的衍生物在製備預防或治療登革病毒2型感染的疫苗中的應用。4.所述的衍生物在製備診斷或檢測登革病毒2型感染的試劑中的應用。本發明有益效果在於本發明公開了登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽，是以抗登革病毒NS3蛋白單克隆4F5抗體為基礎，以噬菌體肽庫初步確定單克隆4F5抗體所對應的抗原表位所在區域，然後合成表位多肽，通過拮抗試驗，檢測到表位多肽能夠抑制單克隆4F5抗體結合登革病毒2型抗原的活性。為了增強表位多肽的免疫原性，將表位多肽與載體蛋白偶聯形成交聯體，免疫BALB/c小鼠後能產生特異的免疫反應，因此可以利用表位多肽研製登革病毒2型的疫苗和診斷試劑。


為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中
圖I篩選的噬菌體與抗體4F5的結合能力鑑定結果圖(4F5為單克隆抗體，匪S為正常鼠血清)。圖2篩選噬菌體肽庫的胺基酸序列及登革病毒2型(Trl751株)所對應的序列。圖3 4F5與表位多肽反應的ELISA結果圖。圖4表位多肽的拮抗試驗ELISA結果圖。圖5表位多肽與BSA偶聯的交聯體免疫動物後抗血清效價測定圖。圖6抗交聯體血清與DV2的免疫螢光分析結果圖(a: DV2感染的細胞與表位多肽免疫的抗血清孵育；b:正常細胞與表位多肽免疫的抗血清孵育；c: DV2感染的細胞與對照多肽免疫的抗血清孵育；d:正常細胞與對照多肽免疫的抗血清孵育)。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面對本發明的優選實施例進行詳細的描述。以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細描述。優選實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件進行。實施例I、材料的準備
登革病毒2型(DV2，Trl751株)由本實驗室保存。實驗動物BALB/c小鼠，6-8周齡，SPF級，雌性，體重18_22g，購自第三軍醫大學實驗動物中心。合成多肽由上海生工生物工程公司合成，用二甲亞碸(DMSO)溶解成5mg/mL的濃度，_70°C保存，臨用時用磷酸鹽緩衝液(PBS)稀釋成lmg/mL。弗氏佐劑、弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司；噬菌體肽庫展示試劑盒(Ph.
D. -7 Phage Display Peptide Library Kit),購自美國 NEB 公司。LB液體培養基胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，NaCllOg加蒸餾水至IOOOmL,調整pH至7. 4,高壓蒸氣滅菌。LB固體培養基1. 5g瓊脂粉加入IOOmL LB培養液中，高壓蒸氣滅菌後傾倒平板。DNA 電泳緩衝液(50XTAE) Tris 242g，冰乙酸 57. lml, Na2EDTA · 2H20 37. 2g，力口水至IOOOmL即可，應用濃度為1XTAE。EB溶液EB貯存液(10mg/ml)，O. 2g EB溶解於20mL H2O中，混勻後於4°C避光保存。EB染色液10 μ L EB貯存液，IOOmL I X TAE緩衝液。PBS 緩衝液(pH7. 2) =Na2HPO4 14mmol, NaH2P046mmoI，NaCl2 9g，加蒸餾水到 1L。頂層瓊脂每升含10g蛋白腖，5g酵母提取物，5g NaCl，Ig MgCl2 · 6H20，7g瓊脂粉。高壓滅菌，分成50mL等份。固體培養基室溫貯存，用微波爐融化。四環素貯液以20mg/mL的濃度溶於乙醇中。_20°C避光貯存。用前搖勻。LB-Tet平板LB培養基+15g/L瓊脂粉。高壓滅菌，冷卻至低於70°C時，加入ImL四環素貯液，混勻倒平板。平板4°C避光貯存，如果平板顯棕色或黑色請勿用。封阻緩衝液0.IM NaHCO3 (pH 8.6),5 mg/ml BSA, O. 02% NaN3。過濾除菌，4°C貯存。PEG/NaCl: 20% (w/v) PEG-8000,2. 5M NaCl0 高壓滅菌，室溫貯存。碘化物緩衝液IOmMTris-HCl (pH 8. O)，ImM EDTA，4M Nal，室溫避光貯存。
考馬斯亮蘭R-250快速染色系統(參考《精編分子生物學實驗指南》)。染色液0. 29g
考馬斯亮蘭R-250溶於250mL下述脫色液中。脫色液250mL 95%乙醇和80mL冰乙酸，加雙蒸水至lOOOmL。TE buffer(pH 8. 0) 10mmol/L Tris,lmmol/L EDTA。ELISA試劑的配製
1)包被液0.05mmol/L 碳酸鹽緩衝液(ρΗ9· 6) =Na2CO3 I. 6g，NaHCO3 2. 9g，NaN3 0. 2g，加蒸餾水至IOOOmL ；
2)抗體稀釋液10mmol/LPBS(pH7. 3) ；0. 05%Tween-20 ；0. 5%BSA ；
3)封閉液10mmol/LPBS (pH7. 3) ；2. 0% BSA ；
4)洗滌液10mmol/LPBS (pH7. 3) ；0. 05% Tween-20 ；
5)底物液0.lmmol/L Na2HPO4 5. 12ml ；0. 05mmol/L檸檬酸4. 86 ml ；0PD 4mg ；30% H2O25 μ I ;加水至 100 ml ο
Western blot 試劑的配製
1)TBS 緩衝液IOOmmoI/L Tris. cl, ρΗ7· 5，O. 9%NaCl ；
2)TTBS 0. 1% (V/V) Tween20溶於TBS緩衝液中，於4°C保存備用；
3)電轉液在500mL去離子水中加入3.03gTris鹼和14. 41g甘氨酸，再加入200mL甲醇，並補水至1L，溶液pH值約為8. 3-8. 4 ;如果用PVDF膜，甲醇濃度應降至15%，如果用尼龍膜，可不加甲醇。實施例2、抗體純化 (O緩衝液的準備
平衡緩衝液50mM Tris-Cl, 3M NaCl, ρΗ7· 8-8. 5 ；洗脫緩衝液0. IM檸檬酸鈉緩衝液，pH4. O ；
再生緩衝液0. IM檸檬酸鈉緩衝液，pH3. O ；
中和緩衝液1M Tris-Cl，ρΗ9· O ；
以上緩衝液使用前均需O. 45 μ m濾膜過濾。(2)樣品的準備
取用登革病毒2型(Trl751株)免疫的BALB/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞SP20融合，製備的陽性雜交瘤細胞注射入BALB/c小鼠腹腔得到腹水(具體見Zongtao Chen etal. Production of a Monoclonal Antibody Against Non-Structural Protein 3 ofDengue-2 Virus by Intrasplenic Injection)。所得的腹水用平衡緩衝液稀釋10倍，以保證樣品液的成分及PH與平衡緩衝液接近，然後孔徑為O. 45 μ m微孔濾膜過濾，備用。(3)操作步驟
a)填料蛋白A瓊脂糖(Agarose protein A)裝柱後,用純水流洗5個柱床體積洗掉乙醇，用平衡緩衝液流洗10個柱床體積平衡柱子。通過蛋白A可以特異性的與抗體的Fe段結合，但是不同PH值的結合程度不同，因此可以通過調節pH值結合抗體並洗脫抗體。b)將步驟(2)製備的樣品上柱，上樣流速60cm/h。c)然後用平衡緩衝液再洗10個柱床體積，把UV洗至基線。d)用洗脫緩衝液洗脫，收集洗脫峰，洗脫後立即用中和緩衝液中和到中性。e)然後用再生緩衝液流洗5個柱床體積，再依次用純水、20%乙醇分別流洗5個柱床體積，柱子再生後置於4°C保存。純化結果經過親和層析得到純化的4F5抗體(單抗)，純化的4F5抗體進行SDS-PAGE電泳，經考馬斯亮藍染色後，檢測其灰度值分析，結果表明純化的蛋白純度達到85%以上。實施例3、利用曬菌體肽庫篩選抗原表位 一、曬菌體篩選
第一天純化的4F5抗體包被96孔微量板
I.將實施例2製備的4F5抗體溶於0. IM pH8. 6的NaHCO3中，製備成濃度為lOOPg/mL的4F5抗體溶液。2.在96孔微量板上每孔加入150μ 步驟I製備的4F5抗體溶液，反覆旋轉直到表面完全溼潤(小心不要使溶液濺出)。3.然後將96孔微量板放入增溼容器(如排列有溼紙巾的可封口塑料盒)中，4°C輕微震蕩，孵育過夜。第二天
4.挑宿主菌ER2738單克隆(噬菌體滴度測定時鋪的板)於20mL LB液體培養基中，37°C劇烈震蕩培養。5.倒掉96孔微量板中的包被液，板倒置在乾淨的紙巾上用力拍甩以除去殘餘溶液。每孔加滿封阻液，4°C作用至少I小時。6.將步驟5封阻液除去後，再用TBST (TBS+0. 1% [v/v] Tween-20)緩衝液快速洗板6次。每次均勻旋轉以使板或孔的底部及邊緣均被洗到，傾去緩衝液，倒置在乾淨紙巾上拍甩以除去殘餘溶液(或使用自動洗板機)。此操作要快以避免板乾燥。
7.用IOOPL的TBST緩衝液稀釋成濃度為2 X IO11的噬菌體(即ΙΟμ 的原始文庫)， 然後加到已包被好的板上，室溫溫和搖動60min。8.傾倒除去未結合噬菌體，倒置板在乾淨的紙巾上拍甩除去殘餘溶液。9.按步驟6的用TBST緩衝液洗板10次，每次換一乾淨紙巾以避免交叉汙染。10.用非特異性緩衝液O. 2M Glycine-HCl (pH 2. 2), lmg/mL BSA來分離已結合的分子溫和搖動lOmin，洗脫液吸入另一乾淨微量離心管中。然後再用15PL(1M Tris-HCl(pH 9. I)中和上述洗脫液。11.參照試劑盒說明書測定洗脫物的滴度(測定量約為WLX試劑盒Ph. D. _7 Phage Display Peptide Library Kit 購自美國 NEB 公司)。12.剩餘洗脫物擴增將洗脫物加入到20mL ER2738培養物中(菌體應當處於對數前期)，37°C劇烈搖動培養4. 5小時。13.將培養物轉入一離心管中，然後，在4°C、IOOOOrpm條件下，離心lOmin。上清
液轉入另一離心管中，再離心。14.將上清的80%轉入一新鮮管中，加入相當於上清液體積1/6的PEG/NaCl。4°C沉澱過夜，使噬菌體充分沉澱。第三天
15.將步驟14所得的沉澱在4°C、10000 rpm條件下離心15min。倒掉上清液,再短暫離心，吸去殘留上清液。16.將步驟15的沉澱物重懸於ImL TBS溶液中，懸液轉入微量離心管中，在4°C、IOOOOrpm條件下,離心5min,使殘餘細胞沉澱。17.上清液轉入另一新鮮微量離心管，加入相當於上清液體積1/6的PEG/NaCl再沉澱。冰上孵育15-60min。4°C、IOOOOrpm條件下,離心lOmin,棄上清,再短暫離心,用微量移液器吸去殘餘上清。18.沉澱物重懸於200μ TBS溶液中，質量分數為0. 02%的NaN3溶液中。離心lmin，沉澱任何殘餘的不溶物。上清轉入新鮮管中，即為擴增後的洗脫物。19.將步驟18得到的擴增後洗脫物用常規M13方法，用LB/IPTG/Xgal平板滴定擴增後的洗脫物，4°C貯存。20.再包被一個板或孔準備第二輪淘選時用。第四和第五天
21.計數板上藍斑數確定滴度，用這個值來計算相應於洗脫物中2X1011 pfu的加入量。
22.進行第二輪淘選用第一輪淘選擴增的洗脫物中2X1011 pfu的噬菌體量重複4-18步驟,在清洗步驟中將Tween的濃度增至O. 5% (v/v)。23.在LB/IPTG/Xgal平板上測定第二輪淘選所得洗脫物擴增後的滴度。24.再包被一個板或孔準備第三輪淘選時用。第六天
25.進行第三輪淘選用第二輪淘選擴增的洗脫物中2X IO11 pfu的噬菌體量重複步驟4-11,清洗步驟中同樣用O. 5% (v/v)的Tween。26.在LB/IPTG/Xgal平板上測定第三輪淘選所得洗脫物未擴增時的滴度。第三輪洗脫物不必再擴增，滴度測定時得到的噬菌斑可做測序用。 27.挑一 ER2738單克隆於LB-Tet培養基中培養過夜(不要接種稀釋後的鋪板培養物)。28.噬菌斑的擴增將ER2738過夜培養物按1:100稀釋接種於LB培養基，分I mL
到培養管中。每個要鑑定的克隆一管。29.用滅菌牙籤挑一藍色噬菌斑到上述I mL培養管中。注意要從總量不到100個噬菌斑的平板上挑選，以便保證每個被挑的噬菌斑僅含一個DNA序列。37°C搖床培養4. 5-5小時(不要過長)。30.培養物轉入微量離心管中，離心30秒。上清轉入以新鮮管中，再離心。用移液器將80%的上清轉入新鮮離心管，此即為擴增噬菌體貯液。二、結合克隆的特徵鑑定
用ELISA檢測所選噬菌體對靶分子4F5抗體(單抗)的結合 I·將上述擴增噬菌體，於4°C保存。2.對每一個要鑑定的噬菌斑克隆，接種一管ER2738於20mL LB培養基中，37°C培養至稍微渾濁。3.每管ER2738培養液中加入5 μ 擴增噬菌體，37°C通氣培養4. 5小時。4.將步驟3的培養物轉入離心管中，在4°C、10000 rpm條件下，離心10 min。收集上清,將上清移入新鮮離心管,再離心。5.將步驟4的離心產物取80%上清於新鮮離心管中，加入相當於上清液體積1/6的PEG/NaCl，4°C沉澱至少I小時。6.將步驟5的樣品在4°C、10000 rpm條件下,離心15 min,棄上清,再進行短暫離心，吸去殘餘上清。7.將步驟6的沉澱重懸於ImL TBS中，懸液轉入微量離心管，4°C、10000 rpm條件下，離心5min除去沉澱中的殘留細胞。8.將上清液轉入新鮮微量離心管，加入相當於上清液體積1/6的PEG/NaCl再沉澱，冰上作用15-60min，然後在4°C、IOOOOrpm條件下，離心lOmin，棄上清，再進行短暫離心，吸去殘餘上清。9.將沉澱重懸於50μ TBS中，常規M13方法測定噬菌體滴度，4°C貯存。10.用 100-200μ 濃度為 lOOPg/mL 的純化抗體(溶於 O. IM pH 8. 6 NaHCO3 中)包被ELISA板的每個孔，每個待鑑定克隆包被一排孔，在密封的溼盒中4°C包被過夜。
11.甩出多餘靶分子溶液，並倒置平板在紙巾上拍甩除去殘液，每孔加滿封阻液。12.甩出封阻液，用I X TBS/Tween洗板6次，每次均倒置平板在乾淨紙巾上拍甩去洗液，Tween濃度為O. 5% (v/v)。13.在單獨的封阻板中每孔預先加入200μ TBS/Tween,由每孔加入IO11個病毒子。14.用多通道移液器將每排稀釋好的噬菌體加入包被有靶分子的板中，室溫震蕩作用1-2小時。
15.然後用I X TBS/Tween洗板6次(同步驟12)。16.在封阻液以1:5000的比例加入HRP標記的抗-M13抗體(體積比)，每孔加入200μ 稀釋抗體，室溫震蕩作用I小時。17.用 lXTBS/Tween 洗板 6 次(同步驟 12)。18.按下述方法準備HRP底物溶液，每孔加200μ 底物溶液，室溫作用10_60min。
19.用酶標儀讀出0D490 nm處的吸光值。結果，所選噬菌體對抗體的結合如圖I所示，我們隨機選取16個噬斑擴增後檢測與4F5抗體和對照抗體的結合。結果13個噬菌體與4F5抗體有高的親和力，而與正常血清沒有特異反應。實施例4篩選噬菌體插入胺基酸序列的測定
I.按上述方法進行噬菌斑擴增，在第一步離心後，將5(Κ)μ 含噬菌體上清轉入一新
鮮離心管。2.加入200μ PEG/NaCl，顛倒混勻，室溫放置IOmin。3. 4°C, 12000rpm 離心 10 min,棄上清液。4.短暫離心，小心吸去殘餘上清。5.沉澱物重懸於IOOPL碘化物緩衝液中，加入250μ 乙醇，室溫溫育10 min。短時間的室溫溫育使單鏈噬菌體DNA沉澱而大多數噬菌體蛋白保持在溶液中。6. 4°C，12000rpm離心lOmin，棄上清，然後用70%的乙醇洗沉澱，短暫真空乾燥。7.沉澱重懸於 30μ TE [10 mM Tris-HCl (pH 8. O), I mM EDTA]中。8.上述沉澱物送大連寶生物公司測序。測序引物為M13(_96)，序列為5， -CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3，。9.所讀序列相應於模板的反義鏈，然後將互補鏈寫出，根據試劑盒說明書所列的遺傳密碼錶由此鏈翻譯得到胺基酸序列(使用的試劑盒為Ph.D.-7 Phage DisplayPeptide Library Kit,購自美國 NEB 公司。結果經過測序分析得到結果如圖2所示。經過胺基酸序列比對對應DV2 (登革病毒 2 型)NS3 蛋白上的一段序列為Arg Val Gly Arg Asn Pro Lys Asn Glu Asn (SEQID NO. I)(縮寫為RVGRNPKNEN，DV2 (登革病毒2型，Trl751株)NS3蛋白的460-469位胺基酸)。
實施例5合成表位多肽 I)表位肽的合成
針對實施例4中所確定的4F5抗體識別表位合成表位多肽和對照多肽(送上海生工生物工程有限公司合成)，合成表位多肽序列為Arg Val Gly Arg Asn Pro Lys Asn Glu Asn(SEQ ID NO. 1)，對照多肽序列Thr Lys Glu Gly Glu Arg Lys Lys Leu (SEQ ID NO. 2)(縮寫為TKEGERKKL，DV2 NS3蛋白的583-591位胺基酸)，純度為85%以上，合成量為10mg。2)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法驗證表位多肽與4F5抗體的反應性 將合成的表位多肽和對照肽以及對照蛋白BSA包被ELISA板，以確定4F5抗體所針對
的表位。具體操作步驟如下
(O用包被液將合成的表位多肽與對照多肽分別稀釋至0Pg/mL、0. 5Pg/mL、lPg/mL、2M-g/mL> 4M-g/mL> 8M-g/mL> 16M-g/mL 和 32M-g/mL0(2)包被酶標板每孔分別加IOOyL步驟(I)的稀釋液，4°C過夜，洗滌液洗滌5
遍,風乾。
(3)封閉加封閉液200 μ L /孔，4°C過夜，洗滌5遍，風乾，密封4°C保存備用。(4)抗體稀釋將實施例2純化的4F5抗體按1:1000倍稀釋(濃度)。(6)取包被好的酶標板，加入依次稀釋抗體100 μ L/孔，37°C水浴30分鐘，洗滌4遍,風乾。(7)加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG抗體工作液(I :2000稀釋)100 μ L /孔，37 °C水浴30分鐘，洗滌4遍，風乾。(8)加底物顯色液ΙΟΟμ L /孔，室溫避光反應5-10分鐘。(9)加終止液2M/L H2SO4 50 μ L/孔，立即在酶標儀上以490nm波長測定OD值。結果如圖3所示，隨著濃度的增加，4F5抗體與表位多肽的結合反應增加，而與對照多肽和BSA的反應沒有變化，說明，表位多肽與4F5抗體有特異性反應。實施例6抗體拮抗試驗
(I)用包被液將DV2抗原(登革病毒2型，Trl751株)稀釋到100 Pg/mL。(2)包被酶標板加ΙΟΟμ L/孔上述抗原液，4°C過夜，洗滌液洗滌5遍，拍幹。(3)封閉加封閉液200yL /孔，4°C過夜，洗滌5遍，拍幹，密封4°C保存備用。(4)抗體稀釋將實施例2純化的4F5抗體按1:1000倍稀釋。稀釋後的抗體與不同濃度的表位多肽和對照多肽混合，抗原肽和對照多肽濃度分別為0Pg/mL, 5Pg/mL, IOPg/mL 和 15M"g/mL。(5)取包被好的酶標板，依次加入步驟(4)製備的抗原抗體混合物，每孔加入IOOyL, 37°C水浴30分鐘，洗滌4遍，拍幹。(7)加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG抗體工作液(I 2000稀釋)100 μ L/ L，37°C水浴30分鐘，洗滌4遍，拍幹。(8)加底物顯色液100μ L /孔，室溫避光反應5-10分鐘。(9)加終止液2M/L H2SO4 50 μ L/孔，立即在酶標儀上以490nm波長測定OD值。結果如圖4所示，隨著表位肽濃度的增加，顯色反應逐步降低，而對照多肽的反應沒有變化，進一步說明合成的抗原多肽是該抗體的抗原表位。實施例7表位多肽與BSA的偶聯及免疫小鼠
I、由於單個表位多肽分子量較小，屬於半抗原，免疫原性較差，所以欲將其與載體蛋白BSA偶聯，從而增強其免疫原性，可以引發特異性抗原抗體反應。本實驗採用戊二醛將合成肽表位通過化學偶聯法偶聯到牛血清白蛋白(BSA)上形成交聯體(簡稱為表位多肽的衍生物)，即抗原，具體由上海生工生物工程公司完成。
2、動物免疫
權利要求
1.登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽，其特徵在於所述表位多肽的胺基酸序列如SEQID NO. I 所示。
2.含權利要求I所述表位多肽的衍生物，其特徵在於所述衍生物為所述表位多肽與載體蛋白偶聯形成的交聯體。
3.根據權利要求2所述表位多肽的衍生物，其特徵在於所述載體蛋白為牛血清白蛋白。
4.權利要求2所述的衍生物在製備預防或治療登革病毒2型感染的疫苗中的應用。
5.權利要求2所述的衍生物在製備診斷或檢測登革病毒2型感染的試劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽，該表位肽的胺基酸序列如SEQIDNO.1所示，具有特異性高，免疫原性好的優點，該表位多肽可以直接與載體蛋白偶聯形成交聯體，製成表位多肽的衍生物，製得的衍生物能夠製備預防登革病毒2型感染的疫苗，安全、可靠，無毒副作用，對預防和治療登革病毒2型感染奠定了基礎。
文檔編號G01N33/569GK102936278SQ20121049401
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月28日 優先權日2012年11月28日
發明者田衍平, 陳宗濤, 徐小峰 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學