一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原的合成方法

2023-05-28 23:17:11 3

專利名稱：一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原的合成方法
一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原的合成方法技術領域一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原的合成方法，屬於生物化工技術領域。
技術背景全氟辛酸，英文名稱Perfluorooctanoic acid (PFOA)， CAS號335-67-l ，分 子式為<:8昍1502。全氟辛酸(PFOA)及其鹽是一種常用的氟表面活性劑，具有很強的疏水性和疏油性，其化學結構遠較其它表面活性劑穩定。由於它優異的耐 熱、耐低溫、自潤滑性及化學穩定性等，被應用在航天、電子、化學和消防領域， 並被用在生活部門如不粘鍋具、防水透氣材料(如防水衣物)、皮革、汽車部件及微波爐爆玉米花袋等。PFOA難以降解，在環境中具有積累性和持久性，但其 對人及環境的影響至今還沒得出明確的結論。PFOA可通過攝取、吸入、皮膚 接觸而被吸收，從而誘發癌症、肝腫大等疾病。 一些動物實驗表明，PFOA能夠 擾亂脂肪酸的新陳代謝，影響生殖系統，可能與乳腺、睪丸、胰和肝腫瘤有關。 PFOA的生物毒性作用還包括對免疫系統產生抑制作用，幹擾線粒體代謝，導致 肝細胞損傷，疾病感染致死等。由於其疏水疏油的特點，PFOA全氟有機物被生 物攝取後一般不在脂肪組織中積累，其大部分與血漿蛋白結合存在於血液中， 其餘一部分則蓄積在動物的肝臟組織和肌肉組織中。由於它的這種分布特點以 及沒有很好的檢測方法，使得PFOA的汙染問題很長時間沒有受到科學家的重 視。全氟表面活性劑的研究在國際上已然成為環境科學和毒理學研究的熱點， 國內研究還尚屬起步階段。現有的儀器檢測法樣品前處理複雜，所需的儀器昂 貴，成本高，檢測時間長，很難實現對PFOA進行快速、準確的檢測，有必要研 究針對PFOA的快速、便攜的免疫檢測技術。這就需要合成能產生簇特異性抗體 的免疫原。目前為止，國內外尚沒有針對全氟辛酸PFOA的免疫檢測方法的報導， 為了彌補這一空白，設計合成了直接以全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid)為半 抗原的用於全氟有機物檢測的完全抗原。 發明內容本發明的目的是提供一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原的合成方法。所制 備的產品用於全氟辛酸的免疫分析方法研究，為今後人們的研究提供了必需的 免疫原。本發明的技術方案 一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原的合成方法，以全氟辛酸PFOA為半抗原，用碳二亞胺法將其與載體蛋白牛血清蛋白BSA偶聯， 用紫外掃描儀(UNICO,UV-2802pcs)測定偶聯物的偶聯比，製備全氟辛酸類藥物通用人工抗原，即全氟辛酸-牛血清蛋白；步驟為(1) 人工抗原的合成全氟辛酸、牛血清蛋白以摩爾比為40:1的比例反應， 取全氟辛酸、牛血清蛋白溶於0.1mol/L的pH7.4的磷酸鹽緩衝溶液中，充分溶 解後逐滴加入現配的水溶性碳二亞胺的甲醇溶液，室溫輕柔攪拌反應3小時， 即得偶聯物PFOA-BSA人工抗原混合液；透析袋前處理取10cm的透析袋，於沸水中煮沸5min，再用6(TC的去離 子水衝洗3min，保存在4"C去離子水中備用；將人工抗原混合液移入透析袋中，用3X2L的0.01M的pH7.4的磷酸鹽緩 衝溶液和3X2L的去離子水透析3天，每天三次換液；(2) 人工抗原的鑑定全氟辛酸-牛血清蛋白採用紫外掃描測定其偶聯比， 在吸收波長223nm處測吸光值，並計算其偶聯比。本發明的有益效果本發明成功合成了 PFOA的免疫原，合成步驟簡潔， 有效，完全可用於免疫分析當中，為以後人們的研究提供了方便的途徑，可以 滿足國內對其研究的需要。


圖1PF0A、 BSA及其偶聯物的紫外掃描組合圖。
具體實施方式
實施例1(1) 人工抗原的製備稱取全氟辛酸2mg (0.00483mmo1)、牛血清蛋白BSA 8 mg(0.000121mmo1) 溶於lmL PBS(0.1mol/L)溶液中，充分溶解後逐滴加入現配的水溶性碳二亞胺 EDC的甲醇溶液(40pL EDC溶於50pL甲醇)，室溫輕柔攪拌反應3小時。即 得偶聯物PFOA-BSA混合液。透析袋前處理取10cm的透析袋，於沸水中煮沸5min，再用6(TC的去離 子水衝洗3min，保存在4"C去離子水中備用。將反應液放入透析袋於0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次換液。(2) 全氟辛酸人工抗原的鑑定偶聯比測定，即估算偶聯物中被偶聯的兩種分子的比率(偶聯比率)的方 法，雖然種類很多，但都是依據檢測偶聯物中被偶聯的兩種分子含量(或相對 含量)的原理建立起來的.分光光度法是利用物質對光的吸收與其濃度呈比例 關係的原理分別測定被偶聯的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯物中，兩 種分子均有各自不同的紫外掃描光譜，並表現出光譜圖迭加的性質。摩爾吸收係數s:取全氟辛酸(PFOA)純品配製濃度為lmg，mL"的超純水 溶液，通過紫外掃描可知PFOA的最大吸收波長為209nm，在209nm處的吸光 值為0.760。摩爾吸光係數計算為^=吸光值/摩爾濃度。本實驗計算得￡扁=314.05 L'mol。偶聯物蛋白濃度測定配製濃度為0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200嗎'mL—1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍染色液，立即混勻，30'C水浴 溫熱5分鐘，每個濃度做平行樣.在595nm處測吸光值，繪製蛋白濃度與吸光 值的關係曲線。將偶聯物溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定PFOA-牛血清 蛋白抗原溶液的吸光值，從曲線上得到偶聯物溶液的相應的蛋白濃度。本實驗 計算得偶聯物溶液的蛋白濃度為4.1016mg'mL—1。偶聯比測定分別配製濃度O.Smg.mL-1的PFOA-BSA及0.5mg.ml/1的牛血 清蛋白(BSA)，通過紫外掃描可知PFOA-BSA的最大吸收波長為223 nm，在最 大吸收波長223 nm處的最大吸光值為2.2465; BSA在223 nm處的最大吸光值 為2.2024。2.2465與2.2024的差0.0441可代表偶聯物PFOA-BSA中的PFOA的 紫外吸收值(即偶聯物的吸光值一蛋白質的吸光值)。根據上述差值和PFOA的 摩爾吸光係數，可算得PFOA-BSA中的PFOA的摩爾濃度為0.0001404mol/L， 再轉成嗎'mL"濃度為58.14(ig'rnL"。由已知的PFOA-BSA的質量濃度減去這 個PFOA濃度，得到PFOA-BSA中的BSA質量濃度，同樣轉化為摩爾濃度。則 偶聯比為PFOA-BSA中的PFOA的摩爾濃度與PFOA-BSA中的BSA的摩爾濃 度之比值。本實驗計算得偶聯比r"21.03。
權利要求
1.一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原的合成方法，其特徵是以全氟辛酸PFOA為半抗原，用碳二亞胺法將其與載體蛋白牛血清蛋白BSA偶聯，用紫外掃描儀測定偶聯物的偶聯比，製備全氟辛酸類藥物通用人工抗原，即全氟辛酸-牛血清蛋白；步驟為((1)人工抗原的合成全氟辛酸、牛血清蛋白以摩爾比為40∶1的比例反應，取全氟辛酸、牛血清蛋白溶於0.1mol/L的pH 7.4的磷酸鹽緩衝溶液中，充分溶解後逐滴加入現配的水溶性碳二亞胺的甲醇溶液，室溫輕柔攪拌反應3小時，即得偶聯物PFOA-BSA人工抗原混合液；透析袋前處理取10cm的透析袋，於沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水衝洗3min，保存在4℃去離子水中備用；將人工抗原混合液移入透析袋中，用3×2L的0.01M的pH 7.4的磷酸鹽緩衝溶液和3×2L的去離子水透析3天，每天三次換液；(2)人工抗原的鑑定全氟辛酸-牛血清蛋白採用紫外掃描測定其偶聯比，在吸收波長223nm處測吸光值，並計算其偶聯比。
全文摘要
一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原的合成方法，屬於生物化工技術領域。本發明以全氟辛酸PFOA為半抗原，用碳二亞胺將其與載體蛋白牛血清蛋白BSA偶聯，用紫外掃描儀測定偶聯物的偶聯比。本發明成功合成了全氟辛酸的人工抗原全氟辛酸-牛血清蛋白，合成步驟簡潔，有效，完全可用於免疫分析中，為以後人們的研究提供了必需的人工抗原，可以滿足國內對其研究的需要。
文檔編號C07K1/00GK101328216SQ20081002110
公開日2008年12月24日 申請日期2008年7月24日 優先權日2008年7月24日
發明者彭池方, 徐麗廣, 李灼坤, 胥傳來, 媛 袁, 謝會玲, 偉 馬 申請人:江南大學