Ny-eso-1抗原及其在腫瘤免疫治療中的應用的製作方法

2023-06-14 19:07:46

Ny-eso-1抗原及其在腫瘤免疫治療中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種分離的多肽，其具有SEQ?ID?NO：1的胺基酸序列；一種分離的多肽，其結構為一穿細胞肽在C-端與一個具有SEQ?ID?NO：15的胺基酸序列的多肽的N-端連結；一種組合物，包含所述的分離的多肽，及有關藥學上可接受的載體；一種組合物，包含所述的分離的多肽，及免疫效應細胞；所述組合物在製備抗腫瘤藥物中的應用；以及一種疫苗，該疫苗包含所述的組合物。
【專利說明】NY-ES0-1抗原及其在腫瘤免疫治療中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫學，細胞生物學及腫瘤領域。具體地說，本發明涉及提高人和動物對腫瘤的免疫反應的方法，組合物及其應用。
【背景技術】
[0002]腫瘤免疫治療通過給機體輸入具有抗原性的腫瘤疫苗，激發或調動機體的免疫系統而控制和殺傷腫瘤細胞。治療性腫瘤疫苗刺激機體產生特異性抗腫瘤免疫，以達到治療腫瘤、預防腫瘤轉移和復發的目的。預防性腫瘤疫苗則用於具有遺傳易感性的健康人群以控制腫瘤的發生。
[0003]腫瘤疫苗向機體輸入腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen, TSA)或腫瘤相關抗原(tumor associated antigen, TAA)。TSA或TAA來源於自體或異體腫瘤細胞。近來受到廣泛研究的一個腫瘤抗原是NY-ES0-1.[0004]NY-ES0-1是由Chen等(1997即參考文獻[4]、[5])使用重組cDNA文庫血清學分析技術從食管癌cDNA表達文庫中篩選出來的一種腫瘤共享抗原。NY-ES0-1基因家族至少擁有3個成員，它們分別是ND-ES0-1、LAGE-1 (Lethe等，1998即參考文獻[15])和ES03 (Alpen等，2002即參考文獻[I])，三者串連定位於Xq28 (Chen等，1997即參考文獻[4])。
[0005]NY-ES0-1在多種組織類型腫瘤中呈不同程度的表達。通過免疫組織化學染色(immuno-histochemistry, IHC)發現，蛋白表達頻率最高的是神經母細胞瘤(82% )(Rodolfo等，2003即參考文獻[19])、滑膜肉瘤(80% ) (Jungbluth等，2001即參考文獻
[13])、惡性黑色素瘤(46% ) (Barrow等，2006即參考文獻[2])和卵巢上皮癌(43 % )(Odunsi等，2003即參考文獻[18])。RT-PCR檢測顯示，NY-ES0-1的mRNA在前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、多發性骨髓癌和肝細胞癌中有較高表達，但其中許多通過IHC檢測時，其表達頻率較低。其他報導的表達頻率介於20%~40%的腫瘤包括肺癌、食管癌和子宮癌。表達率較低的腫瘤包括結直腸癌、腎癌、白血病和淋巴瘤。這些腫瘤或者不表達NY-ES0-1，或其表達率僅O~20%。
[0006]最近的研究表明，如果能夠同時激活⑶8+T細胞和⑶4+T細胞，產生的免疫應答反應會更有效而持久。NY-ES0-1既具有誘導體液免疫應答的能力，也具有激活CD4+和CD8+T淋巴細胞的能力，是到目前為止被發現的免疫原性最強大的腫瘤特異性抗原。血清NY-ES0-1抗體陽性的患者中超過90%會產生NY-ES0-1特異性細胞毒性T細胞(CTL) (Jager等，2000即參考文獻[10])。Jager等(1998即參考文獻[11])最早鑑別出一組位於NY-ES0-1胺基酸序列第157-170位的表位 多肽(pl57-167，pl57_165，pl55_163)，這些多肽可被人類白細胞抗原(human leucocyte antigen, HLA) _A2分子提呈,從而誘導出特異性的CTL應答。根據這組多肽胺基酸序列合成的多肽，特別是HLA-2限制性的NY-ESO-1b多肽(pl57_165，SLLMWITQC)，是目前多個腫瘤免疫試驗中最常使用的多肽疫苗。另外，還發現此區域包含一個能被HLA-A2提呈的9肽隱蔽表位(P159-167)，它在以11肽pl59_167為疫苗免疫患者後才能為CD8+T細胞所識別(Gnjatic等，2002即參考文獻[8] ；Held等，2004即參考文獻[9])以及一個HLA-DP4限制性表位pl57-170(Zeng等，2002即參考文獻[24])。
[0007]目前，NY-ES0-1衍生多肽已被用於多種表達NY-ES0-1的腫瘤(包括惡性黑色素瘤、非小細胞性肺癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、神經鞘瘤、平滑肌肉瘤等)的免疫治療臨床試驗，證明NY-ES0-1多肽疫苗可誘導出強大的特異性體液及細胞免疫應答，除了注射部位的輕度紅腫、疼痛外，尚未發生由NY-ES0-1多肽疫苗所致的其他不良反應(Jager等，2000即參考文獻[10] ；Gnjatic等，2002即參考文獻[8] Jager等，2000即參考文獻[12])。此外，針對NY-ES0-1抗原產生自發性免疫應答的患者，也未發生自身免疫疾病(Shackleton 等，1999 即參考文獻[23])。
[0008]然而，如何通過操作抗原及其運載系統去打破自身免疫耐受，利用NY-ES0-1誘導出強而持久的抗腫瘤免疫能力，仍然是腫瘤免疫治療的主要挑戰。
[0009]NY-ES0-1作為一個基於腫瘤抗原某表位的多肽疫苗，容易被體內的蛋白酶降解，半衰期短，不易被抗原呈遞細胞(APC)攝取，且難以進入APC胞內MHC-1類抗原呈遞途徑，故不能有效激發Thl、CTL保護性免疫應答，表現為弱免疫原性。
[0010]採用穿細胞肽(cell penetrating peptide, CPP)可以將抗原肽(包括自身抗原和腫瘤抗原)導入成熟的樹狀細胞(DC)內，可以使DC能有更多的時間來進一步將導入的肽加工處理，並通過新合成的MHC-1類分子遞呈給T細胞，從而延長DC加工和遞呈肽的時間(王榮福，CN02808227)。Batchu等(2005，參考文獻[26])使用TAT-NY-ESO-l融合蛋白刺激樹突狀細胞，發現此融合蛋白能夠有效進人胞漿，且經該融合蛋白處理過的樹突狀細胞相比使用NY-ES0-1蛋白刺激的細胞能更有效地誘導CTL介導的抗癌免疫反應，前者誘導產生的CTL細胞是後者的20倍之多(Zeng等，2006即參考文獻[25])。 [0011]已從蛋白質中鑑定和篩選出幾種CPPs，其中包括人類免疫缺陷病毒(HIV)的Tat蛋白(Frankel和Pabo，1988即參考文獻[7])，單純皰疹病毒的VP22蛋白(Elliott和O' Hare, 1997即參考文獻[27] ； Phe I an等，1998即參考文獻[28])和成纖維細胞的生長因子(Lin等，1995即參考文獻[29] ；Rojas等，1998即參考文獻[20])。Tat肽和穿膜序列(MTS)已在體內外將蛋白導入細胞內(Fawell等，1994即參考文獻[6] ;Kim等，1997即參考文獻[14] ;Schwarze等，1999即參考文獻[21] ;Lindgren等，2000即參考文獻[16]；Caron等，2001即參考文獻[3])。
[0012]作為治療用的多肽抗原，理論上講在不影響其效果的前提下，其序列長度是越短越好，以便降低生產成本和更易控制質量。然而，對於一個較短的多肽抗原，其抗原性，尤其是其作為疫苗的實際效果，很難預測。哪怕輕微的胺基酸序列變化，部有可能導致其抗原表位發生變化。簡單地將某個多肽可以與CPP相連接，獲得的融合體的作為一個抗原肽實際的效果，更是必須試驗證明。

【發明內容】

[0013]為了克服本領域現有技術的缺陷，採用穿細胞肽與一具有SEQ ID N0:15的胺基酸序列的腫瘤抗原相連接，獲得一種性能優異的腫瘤抗原。
[0014]在本發明的一個實施方案中，給出了一個分離的多肽，其胺基酸序列為YGRKKRRQRRRSLLMWITQCFLPV(SEQ ID NO:1) ?
[0015]在本發明的一個實施方案中，給出了一種分離的多肽，其結構為一穿細胞肽在C-端與一個具有SEQ ID NO:15的胺基酸序列的多肽的N-端連結。在本發明的一個實施方案中，其中穿細胞肽具有SEQ ID NO:2-14的胺基酸序列。
[0016]在本發明的一個實施方案中，給出了一種組合物，包含如上述的分離的多肽，及有關藥學上可接受的載體。
[0017]在本發明的一個實施方案中，給出了一種組合物，包含上述的分離的多肽，及一合適的免疫效應細胞。在本發明的一個實施方案中，其所述免疫效應細胞是樹狀細胞、B細胞、巨噬細胞和成纖維細胞。在本發明的一個實施方案中，其中所述免疫效應細胞是成熟的樹狀細胞。
[0018]本發明在另一個實施方案中，還給出了上述組合物在製備抗腫瘤藥物中的應用。這些腫瘤可以是滑膜肉瘤、惡性黑色素瘤、和卵巢上皮癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、多發性骨髓癌、肝細胞癌、肺癌、食管癌和子宮癌。
[0019]本發明在另一個實施方案中，還給出了一種包含上述組合物的疫苗。該疫苗可以是預防性腫瘤疫苗,也可以是治療性腫瘤疫苗。
[0020]本發明人經過多次試驗，意想不到的發現，用穿膜肽(例如YGRKKRRQRRR(SEQ IDNO:4))連接NY-ES0-1部分肽段(P157-169)，所獲得的抗原不僅具有HLA-A2限制性的表位(MHC-1類表位)，還有HLA-DP4限制性的表位(MHC-1I類表位)，其不僅能對HLA-A2陽性人群產生免疫反應，激活特異性CD8+T細胞，也能對HLA-DP4陽性人群產生免疫反應，激活特異性CD4+T細胞。而且，穿膜肽不僅沒有影響NY-ES0-1的抗原性，還可以有效延長其在抗原呈遞細胞中的存留時間，明顯提高特異性⑶8+T細胞的比例，並可以更有效地激活HLA-DP4陽性患者⑶4+T細胞，在臨床上具有良好的效果。
[0021]由於在不同人種和地區人群HLA抗原分子分布存在較大差異，所以與現有技術中以NY-ES0-1為基礎的腫瘤疫苗相比，本發明的藥物有更大的適用人群。
[0022]本發明的一個方面是一種分離的多肽，其結構為一合適的穿細胞肽在C-端與NY-ES0-1 第 157-169 位的胺基酸片段 SLLMWITQCFLPV(SEQ ID NO:15)的 N-端連結。
[0023]本發明的一個方面是一個通過化學合成的方法，將穿膜肽序列YGRKKRRQRRR(SEQID NO:4)與NY-ES0-lpl57-169連接成一個24胺基酸的多肽，其可以同時被HLA-A2分子(HLA-Ι類)和HLA-DP4分子(HLA-1I類)提呈，分別激活⑶8+T細胞和⑶4+T細胞。
[0024]本發明的一個實施方案包括使用上述多肽直接作為一個抗腫瘤疫苗，包含SEQ IDNO:1所代表的肽和一個藥學上可接受的載體。本發明的上述多肽作為一個腫瘤疫苗優點是:(1)連接了穿膜肽，容易進入抗原提呈細胞內被提呈，也可以保護多肽不被蛋白酶降解；⑵可以同時被HLA-A2分子(HLA-Ι類)和HLA-DP4分子(HLA-1I類)提呈，分別激活CD8+T細胞和CD4+T細胞，可針對HLA-A2和HLA-DP4兩種表型的人群，HLA-DP4表型人群分布可高達70%。(3)可以產生持久的免疫反應效應；(4)由於是化學合成，易於純化及保持無菌。
[0025]在本發明的另一個特定的實施方案中，提供了一種包含免疫效應細胞，SEQ IDNO:1所代表的肽，以及製藥學上可接受的載體的疫苗。
[0026]這裡的免疫效應細胞可以是抗原負載的，其抗原可以是通過穿細胞肽來導入細胞內的。本領域技術人員可以用以下兩種方法之一來常規製備抗原負載的樹狀細胞:(I)小片段肽也稱抗原性肽，可以直接負載到抗原遞呈細胞表面(Mehta-Damani等，1994即參考文獻[30])。(2)將完整的蛋白和蛋白顆粒與抗原遞呈細胞共同溫育，這些蛋白質最終會被抗原遞呈細胞消化並遞呈到其表面。
[0027]免疫效應細胞指任何有能力在動物體內誘導T細胞反應，並能攝取和更好地遞呈抗原的細胞。在特定的實施方案中，所說的免疫效應細胞是成熟的樹狀細胞、B細胞、巨噬細胞和成纖維細胞。在另一個特定的實施方案中，所說的免疫效應細胞是成熟的樹狀細胞或B細胞。在另一個特定的實施方案中，所說的免疫效應細胞是成熟的樹狀細胞。樹狀細胞是在淋巴組織和非淋巴組織中的形態相似的多樣性群體的一種。這類細胞有獨特的形態學特徵，細胞表面有高表達的MHC II類分子(Steinman等，1991即參考文獻[22])。
[0028]樹狀細胞的表面很特殊，它有一些樹突狀的突起。⑶I+，⑶4+，⑶86+，或HLA-DR+是樹狀細胞表面的特徵性標記。樹狀細胞有很強的激活MHC-限制性T細胞的能力，並能有效的在原位遞呈抗原給T細胞。在T細胞發育和耐受中樹狀細胞遞呈的是自身抗原，而在免疫反應中樹狀細胞遞呈的是異體抗原。成熟的樹狀細胞指高表達MHC II類分子，CD80，和⑶86的樹狀細胞。未成熟的樹狀細胞指低表達MHC II類分子，⑶80，和⑶86但能有效攝取抗原的樹狀細胞。
[0029]在本發明的另一個特定的實施方案中，提供了一種提高動物抗疾病免疫力的方法，該方法包括給動物施用本發明的疫苗。在特定的實施方案中，所說的疫苗包含成熟的樹狀細胞。在特定的實施方案中，所說的動物有CD4+和CD8+T細胞。在另一特定的實施方案中，樹狀細胞是通過注射施用到動物體內的。在另一特定的實施方案中，所說的注射是靜脈注射，腹腔內注射或皮下注射。在另一特定的實施方案中，所說的動物是哺乳動物。在另一特定的實施方案中，所說的哺乳動物是人。
[0030]在本發明另一特定的實施方案中，提供了一種免疫動物的方法，該方法包括給所說的動物施用至少一次疫苗。
[0031]在本發明的另一特定的實施方案中，提供了一種治療動物疾病的方法，該方法包括給所說動物施用至少一次本發明的腫瘤疫苗。
[0032]在另一特定的實施方案中，所說的動物還接受腫瘤治療，其中所說的治療是手術治療，放射治療，化學治療或基因治療。在另一特定的實施方案中，給動物施用本發明的疫苗先於腫瘤治療。在另一特定的實施方案中，給動物施用本發明的疫苗後於腫瘤治療。在另一特定的實施方案中，給動物施用本發明的疫苗與腫瘤治療同時進行。
[0033]在本發明另一特定的實施方案中，提供了一種製備針對腫瘤的組合物的方法，該方法包括提供一種包含SEQ ID NO:1所述肽及藥學上可接受的載體的疫苗。在另一實施方案中，該方法包括提供一種已經導入SEQ ID NO:1的肽的免疫效應細胞。
[0034]本發明的其它目的，特徵及優點將在以下的詳細描述中體現出來。然而，應該理解下面對本發明的特定部分所選的詳細描述和特定的實施例僅僅用於舉例說明，因為在本發明的精神和範圍內，對於本領域技術人員而言，通過下列詳細描述，各種變化和改進是顯而易見的。
[0035]本發明在方法上及組合物中應用了一個特定的穿細胞肽。細胞穿細胞肽有利於所需抗原導入免疫效應細胞。這項蛋白轉導技術上是已知的，在以下文獻中已有描述，如Rojas等(1998即參考文獻[20])和Schwarze等(1999即參考文獻[21])。從HIV1819的TAT和成纖維細胞生長因子等蛋白中，已鑑定出數個CPP(Ludewig等，1999即參考文獻[17]；FrankeI和Pabo，1988即參考文獻[7])。CPP在體內外都能夠導入肽或蛋白到多種細胞。這些穿細胞肽(CPP)或其變異體部可以與本發明中的腫瘤抗原(NY-ES0-lpl57-169)
結合使用。
[0036]一些CPP舉例如下:
[0037]1.AAVLLPVLLAAP (CPPI) (SEQ ID NO:2)
[0038]2.PQIKIffFQNRRMKffKK(ANTP) (SEQ ID NO:3)
[0039]3.YGRKKRRQRRR(HIV Tat47_57)(SEQ ID NO:4)
[0040]4.YARAAARQARA(TAT-PTD-4)(SEQ ID NO:5)
[0041]5.YARAARRAARR(TAT-PTD-5)(SEQ ID NO:6)
[0042]6.AAVALLPAVLLALLAP(信號肽 I) (SEQ ID NO:7)
[0043]7.GALFLGWL GAAGSTMGAWSQPKKKRKV(信號肽 II) (SEQ ID NO:8)
[0044]8.PLSSIFSRIO)P(PRES) (SEQ ID NO:9)
[0045]9.GffTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL(Transportan)(SEQ ID NO:10)
[0046]10.KLALKLALKALKAALKLA (AmphiphiIic model peptide)(SEQ ID NO:11)
[0047]11.DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE(HSVVP22)(SEQ ID NO:12)
[0048]12.KETffffETffffTEWSQPKKKRKV (肽載體)(SEQ ID NO:13)
[0049]13.KKKKKKGGFLGFffRGENGRKTRSAYERMCNILKGK(CL22)(SEQ ID NO:14)
[0050]在此所述的任何組合物均用可包含在試劑盒中。例如，引入SEQ ID NO:1所代表的肽的樹狀細胞和/或其他試劑的組合物可以包含在試劑盒中。在一個特定的實施方案中，這一組合物可以是疫苗。在另一特定的實施方案中，含有穿細胞肽的腫瘤抗原可以存放在試劑盒中，而樹狀細胞由另外的途徑提供。試劑盒中的某些成分可以以液相或冷凍乾燥的形式包裝。試劑盒通常將包括至少一支小瓶，試管，培養瓶，瓶子，注射器或其它容器。如果試劑盒含有一種以上的成分，可將能包含第二，三或更多容器以便附加的成分能分別存放。但也可以將幾種成分放在一支試劑瓶中。本發明的試劑盒通常可用便以商業上銷售的密封容器來包裝試劑盒組分。這些容器還可包括將所需的小瓶放入其中的注射或吹制的塑料容器。
[0051 ] 試劑盒可以採用單一容器包裝，也可以採用不同的容器包裝每個成分。各種組合物也可以製備成針劑形式。在這種情況下，注射器，吸液管和/或其他相似的儀器，可以作為存放的容器，以便將試劑應用到身體部位的感染區，注射到動物體內，和/或用於與試劑盒中其它成分混合使用。但該試劑盒的組分也可以是幹的藥粉。當試劑和/或其他組分以藥粉的形式提供時，可用適當的溶劑來配製。可以想像溶劑也可以存放在另外的容器中。試劑盒也可包含第二個容器用以存放無菌的製藥上可接受的緩衝劑和/或其他稀釋液。
[0052]不管容器的數目和/或類型，本發明的試劑盒也可與輔助把最終組合物注射/導入動物體內的器具一起包裝。這些器具可以是一種注射器，吸管，鑷子和/或任何醫用器具。
[0053]在使用本發明的免疫治療組合物治療腫瘤時，其他標準的治療方案也可以使用，如放療和化療。在一個特定的實施方案中，也可以使用其他的免疫治療方法。
[0054]免疫治療劑通常是依靠免疫效應細胞和分子識別和破壞腫瘤細胞。在免疫治療中，腫瘤細胞必須具有能被免疫治療試劑識別的一些標誌，該標誌不能出現在大多數的其它細胞上。在許多腫瘤標誌中，任何一種均可作為本發明合適的靶分子。
[0055]免疫治療一種特殊的方面就是用免疫刺激分子作為一種試劑，或更好與其它試劑連用，例如細胞因子，如 IL-2，IL-4，IL-12，GM-CSF, TNF，IFN-α , β , y ;F42K 和其他細胞因子類似物趨化因子，如MIP-1，MIP-1 β，MCP-1，RANTES, IL-8 ;或生長因子如FLT3配體。
[0056]一種可用於本發明的一種較為特別的細胞因子是腫瘤壞死因子(TNF)。TNF是一種糖蛋白，能殺死某些腫瘤細胞，激活產生細胞因子，激活巨噬細胞和內皮細胞，促進產生膠原和膠原酶，是一種炎症介質，也是一種引起膿毒性體克的介質，並加速分解代謝，引起發熱和嗑睡。一些感染因子通過刺激TNF的產生而導致腫瘤的消退。當TNF在有效劑量下單獨使用時，毒性很大。因此理想的方法可以是用低劑量與其他藥物聯合使用。IFN-Y能增加 TNF的免疫抑制作用，因此聯合用藥時，有潛在危險性。TNF和IFN-α融合物已被發現有增強抗腫瘤活性的能力。
[0057]IFN-a是另一種可用於本發明的比較特殊的細胞因子。IFN-a已被用於治療毛細胞白血病，卡波氏肉瘤，黑色素瘤，一些良性腫瘤，腎細胞癌，卵巢癌，膀胱癌，非何杰金淋巴病，真菌引起的疾病，多發生骨髓瘤，和慢性粒細胞白血病。
[0058]為了增加本發明的疫苗治療的有效性，可以將本發明的疫苗和其他抗腫瘤試劑聯合使用。本發明中的免疫療法也能與化療，放療或其他免疫治療聯用。這些抗癌試劑可以通過殺傷腫瘤細胞或阻止腫瘤細胞的增殖，包括誘導癌細胞的凋亡，降低癌細胞的生長速度，減少腫瘤轉移的數目 和發生，縮小腫瘤的大小，抑制腫瘤的生長，減少對腫瘤細胞的血液供給，促進對腫瘤的免疫反應，預防或阻止癌症的進程，增加患癌病人的壽命。化療為基礎的各種聯合治療劑包括，例如，順鉬(CDDD)、卡鉬、甲苄肼、二氯甲基二乙胺、環磷醯胺、喜樹鹼、異環磷醯胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、白消安、亞硝基脲、放線菌素D、柔毛黴素、阿黴素、博來黴素、普利黴素、依託泊苷(VPl6)、三苯氧胺、鈣穩錠、雌激素受體結合劑、紫杉醇、Gemcitabine、長春花鹼、famesyl-蛋白轉移酶抑制劑、反鉬、5_氟尿嘧唳、長春新鹼、長春鹼和氨甲喋呤，或前面所述的任何類似物或衍生物。應用於腫瘤治療中放射線包括眾所周知的Y-射線，X-射線和/或放射性同位素直接送入腫瘤細胞中，也包括如微波和紫外照射。
[0059]治療性外科包括物理性切除或破壞全部或部分腫瘤組織的切除術外，腫瘤切除術是用物理的方法至少去除腫瘤的一部分。除腫瘤切除術外，腫瘤外科治療還包括雷射外科手術,冷凍手術，電外科手術和 Microscopically Controlled Surgery (Mohs' Surgery)。值得進一步注意的是，本發明可以和去除表淺腫瘤，癌前組織及腫瘤周圍附帶的正常組織的外科手術聯合使用。
[0060]此外，免疫治療可以選擇的在其他試劑治療之前或之後，間隔可以從幾分鐘到幾星期。治療時，可以採用各種組合。
[0061]其它試劑也可以和本發明聯合運用來提高治療效果。這些試劑包括免疫調節劑及影響細胞表面受體及GAP連接上調表達的試劑，影響細胞靜止或分化的試劑，細胞粘附抑制劑，及能增加高度增生的細胞凋亡敏感性的誘導劑。免疫調節劑包括腫瘤壞死因子，α，β，Y-幹擾素，白細胞介素-2及其它細胞因子，F42K及其它細胞因子的類似物，ΜΙΡ，MIP-1 β，MIP-1，RANTES及其它的趨化因子。值得進一步重視的是，上調細胞表面受體和其他的配體如FAS/FAS配體，DR4或DR5/TRAIL等可以增強本發明通過建立起自分泌或旁分泌效應誘導高度增生性細胞凋亡的能力。增加GAP連接的數目可以增強細胞內信號轉導，從而發揮對周圍高度增生細胞群的抗增生作用。在某些情況下，細胞靜止或分化試劑能和本發明聯合運用，並提高治療的抗增生效果。細胞粘附抑制劑也可用於提高本發明的療效，如粘附激酶抑制劑(FAXS)和LOVASTAIN。另外，其它一些用來提高增生細胞對凋亡敏感性的試劑，如抗體C225可於本發明聯合應用，從而提高治療效果。
[0062] 激素治療也可與本發明聯合使用，或與前面所述的任何方法聯合使用。激素可治療以下一些腫瘤，如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌和子宮頸癌，其效應是降低或阻斷一些激素如睪丸酮或雌激素的作用水平。激素治療通常與至少一種其它腫瘤治療方案聯用，以用來減少腫瘤轉移的風險。
[0063]激素治療也可與本發明聯合使用，或與前面所述的任何方法聯合使用。激素可治療以下一些腫瘤，如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌和子宮頸癌，其效應是降低或阻斷一些激素如睪丸酮或雌激素的作用水平。激素治療通常與至少一種其它腫瘤治療方案聯用，以用來減少腫瘤轉移的風險。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0064]下列附圖是本說明書的一部分，用於進一步說明本發明的某些方面。參考這些附圖，並結合下述特定實施方案的詳細描述，可以獲得對本發明更好的理解。
[0065]圖1說明由HLA-A2陽性前列腺癌病人的外周血製備的效應T細胞識別WX001 (見實施例)時檢測到的IFN-Y點數，明顯高於對照多肽。
[0066]圖2說明從HLA-A2.1轉基因小鼠分離的T細胞經WX001刺激後檢測到大量的IFN- Y釋放(特別是LN實驗組)，表明WX001能誘導HLA-A2.1Tg轉基因小鼠產生腫瘤特異性T細胞，且T細胞活性為HLA-A2.1特異性。
[0067]圖3說明從HLA-A2.1轉基因小鼠分離的T細胞識別了加WX001的HLA-A2.1陽性293T細胞，但沒有識別單獨HLA-A2.1陽性293T細胞。
[0068]圖4說明WXOOI可被特異性⑶4+T細胞和⑶8+T細胞識別。
[0069]圖5說明DCs/WXOOl免疫轉基因小鼠後，與單獨注射DCs組比較腫瘤明顯變小。
【具體實施方式】
[0070]下列實施例用來說明本發明優選的實施方案。本領域技術人員應當知道，在下列實施例中公開的技術代表了發明人在實施本發明中很好地發揮作用的那些技術，因此被認為用來構成實施本發明的優選模式。然而，由於這些技術的公開，本領域技術人員知道可以對在此公開的特定實施方案作出許多技術上的改變，仍可得到相同或相似的結果，而不偏離本發明的精神和範圍。
[0071]實施例1:WX001的合成，和實驗動物與管理
[0072]WX001的合成選擇方法為固相合成法合成受試品WX001。國內外常用的方法有Boc/Bz I和Fmoc/tBu兩種方法,但由於Boc/Bz I法需要特殊的反應設備，同時使用毒性很大的氟化氫，所以我們確定採用Fmoc/tBu方法。由於WX001的C端為羧基,對於Fmoc/tBu方法，使用的樹脂為羥基型HMPA樹脂，利用α位保護的門冬氨酸羧基與載體羥基反應形成穩定的酯鍵而獲得開始的載體樹脂。以Fmoc-Val-HMPA樹脂(100~200目，交聯度為1_2%，取代值為0.2~0.6mmol NH/g)為起始原料。產品通過HPLC方法進行純化。得到WXOOl白色粉末，2-8°C保存，含量:99.12%,
[0073]實驗動物與管理:試驗動物每組3隻，體重20±2g，4_5周齡，實驗動物來源於Jaxson轉基因中心。動物飼養環境:溫度20~25°C，溼度70 %，光照明暗時間各12h，飼料為鈷6°輻照的全家營養顆粒飼料，飲水經實驗動物反滲透純水機處理，裝入消毒飲水瓶。
[0074]實施例2 =WXOOl誘導腫瘤病人外周血產生腫瘤特異性T細胞
[0075]目的:採用腫瘤病人的外周血進行體外試驗，觀察WX001能否誘導產生腫瘤特異性T細胞，確定其有效性。
[0076]方法:(I)效應細胞製備:用⑶8微磁珠(Miltenyi Biotec)從HLA-A2陽性腫瘤病人的外周血篩選⑶8+T細胞，同時通過陰性選擇分離製備抗原提呈細胞(APC)。第一天，I X IO6 的 APC 加 WX001 (10mg/ml)在 5% C02、37°C培養 2-3 小時。APC 洗滌後 4000rad 照射，同 I X 105CD8+T 細胞種植在 10%人血清(Valley Biomedical)和 RPMI1640 (Invitrogen)完全培養基的96孔板。第二天，加入細胞因子(20U/ml的IL-2和10U/ml的IL-7)，效應T細胞製備完成。
[0077](2) ELISP0T測試:穩定表達HLA-A2基因的人腎上皮細胞系293T細胞加入WX001或對照多肽(10mg/ml)，2小時後洗滌。1.5X IO4效應細胞和5X IO4的293T接種96孔Multiscreen 板(Millipore),預包被 10 μ g/ml 幹擾素 Y (IFN- Y ,Endogen)抗體後培養於含2%人血清的RPMI1640。5% C0237°C培養20小時後，移去培養基，用2%胎牛血清(FCS)的PBS加0.005% Tween20洗滌6次，每孔加鼠抗人IFN- Y生物素標記抗體(Endogen)室溫作用2小時，2% FCS 的PBS加0.005% Tween20洗滌6次，鏈黴素結合AP (Pierce)室溫I小時，2% FCS的PBS加0.02% Tween20洗滌6次，然後與製備好的BCIP/NBT混合物(Pierce)作用 10-20 分鐘。
[0078]結果:如圖1所示，加WX001時效應T細胞針對293T細胞產生的IFN-Y點數明顯高於對照多肽，表明WX001能誘導前列腺癌患者外周血產生腫瘤特異性T細胞。
[0079]實施例3 =WXOOl免疫HLA-A2.1轉基因小鼠產生了特異性T細胞
[0080]目的:WX001通過直接或樹突狀細胞(DCs)注射HLA-A2.1轉基因小鼠後用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測是否產生特異性T細胞。
[0081]方法(I) =WXOOl直接免疫HLA-A2.1Tg轉基因小鼠:C57BL/6(B6)小鼠和轉基因小鼠足底注射WX001，IOOmg/只。11天後，免疫小鼠的脾(SC)和淋巴節(LN)取出製備單細胞懸液，細胞(2 X 105，200ml RPMI1640完全培養基)接種到U-型底96-孔板，加入或不加ImM WXOOl0 18小時後取上清液，採用ELISA試驗進行IFN-Y檢測。
[0082]結果:如圖2所示，從HLA-A2.1Tg轉基因小鼠分離的T細胞經WX001刺激後檢測到大量的IFN- Y釋放(特別是淋巴節)，且T細胞活性為HLA-A2.1特異性，而其他實驗組沒有或檢測到極少量IFN-Y釋放。說明WX001在轉基因小鼠中誘導了 T細胞活化，產生了腫瘤特異性T細胞。
[0083]方法(2):WX001通過DCs免疫HLA-A2.ITg轉基因小鼠:來源於HLA-A2.ITg轉基因小鼠的DCs細胞經WX001刺激後，靜脈注射至HLA-A2.1Tg轉基因小鼠，14天後分離脾和淋巴節，收集細胞用WX001體外刺激5天後作為效應細胞，表達HLA-A2.1分子的293T細胞作為刺激細胞加入或不加WX001，用ELISA試驗測定上清液IFN- Y。[0084]結果:如圖3所示，加入WX001刺激的HLA-A2.1陽性表達的293T細胞檢測到大量的IFN- Y釋放，但沒有識別未加WX001刺激的HLA-A2.1陽性293T細胞，說明轉基因小鼠免疫注射後產生的腫瘤特異性T細胞可以有效識別WX001。
[0085]實施例4 =WXOOI可被特異性⑶4+T細胞和⑶8+T細胞識別
[0086]目的:WX001具有HLA-A2和HLA-DP4兩個抗原表位，觀察WX001是否可以分別被特異性⑶4+T細胞和⑶8+T細胞識別。
[0087]方法:分別從外周血單核細胞中磁珠分選⑶4+和⑶8+T細胞，⑶8-⑶4-亞群作為抗原呈遞細胞(APC) ,5% 0)2371:條件下，4?(:經1乂001刺激2~3小時。APC洗滌後4000rad照射，分別同1X105CD4+T細胞、CD8+T細胞種植在10%人血清(Valley Biomedical)和RPMI1640 (Invitrogen)完全培養基的96孔板。第二天，加入細胞因子(20U/ml的IL-2和10U/ml的IL-7)，特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞製備完成。以WX001分別刺激293ECIIDP4 (DP4+)和293T(A2+)細胞，ELISA法檢測其激活被特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞識別後釋放IFN- Y的能力。
[0088]結果:WX001特異性的CD4+T細胞可特異性地識別WXOOI刺激過的293ECIIDP4細胞，釋放IFN- Y，而不能識別WX001刺激或未刺激的293T細胞，表明此免疫反應是通過HLA-DP4分子提呈的。
[0089]WXOOI特異性的CD8+T細胞可特異性地識別WXOOI刺激過的293T細胞釋放IFN- Y，而不能識別WX001刺激或未刺激的293EC II DP4細胞，表明此免疫反應是通過HLA-A2分子提呈的。
[0090]實施例4:體內藥效學試驗:WX001對接種鼠前列腺癌RM1/NY-ES0-1腫瘤的轉基因小鼠產生免疫治療作用
[0091]目的:WX001通過樹突狀細胞免疫的HLA-A2.1轉基因小鼠接種了腫瘤細胞，觀察WX001對轉基因小鼠身上腫瘤的生長的影響，通過體內試驗證明WX001的有效性。
[0092]方法:WX001刺激過的DCs免疫接種HLA-A2.1轉基因小鼠，DCs不加肽或者不處理做對照。免疫兩周後，所有小鼠背脊注射2X105RM1鼠前列腺癌細胞RM1，該細胞表達NY-ES0-1和HLA-A2.1分子。遊標卡尺觀測腫瘤生長和大小，一周兩次。
[0093]結果:DCs經WX001刺激後免疫轉基因小鼠誘導了免疫反應，明顯抑制了腫瘤生長，說明WX001產生了抗腫瘤免疫並抑制腫瘤生長。另外，所有實驗術觀察到小鼠體重變化和行為異常，提示藥物免疫沒有毒性。
[0094]結論:WX001是化學合成的治療性抗腫瘤多肽，具有HLA-A2和HLA-DP4兩個抗原表位，可以分別被特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞識別。在體內外均可有效地誘導免疫反應產生特異性T細胞，可以分別被特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞識別。WX001與外周血淋巴細胞作用後，可以明顯促進效應細胞幹擾素的釋放，說明WX001可以誘導腫瘤病人外周血腫瘤特異性T細胞的產生。WX001通過直接或樹突狀細胞免疫HLA-A2.1轉基因小鼠，均可以檢測到大量的幹擾素釋放，表明WX001誘導了 T細胞活化，產生了腫瘤特異性T細胞。
[0095]動物試驗結果證實，WX001通過樹突細胞免疫接種了腫瘤的HLA-A2.1轉基因小鼠，抑制腫瘤生長的效果明顯高於其它試驗組。
[0096]參考文獻
[0097][I] Alpen B, Gure AO, Scanlan MJ, et al.A new member of the NY-ESO-1 genefamily is ubiquitously expressed in somatic tissues and evolutionariIyconserved[J].Gene，2002，297(1-2): 141-149.[0098][2]Barrow C, Browning J，MacGregor D，et al.Tumor antigen expressionin melanoma varies according to antigen and stage [J].Clin Cancer Res, 2006,12(3Ptl):764-771.[0099][3]Caron, N.J.等，Tat-eGFP融合蛋白載入肌肉細胞.分子治療.3，310-318(2001)
[0100][4]Chen YT, Boyer AD, Viars CS，et al.Genomic cloning and localizationof CTAG， a gene encoding an autoimmunogenic cancer—testis antigen NY-ES0-1, tohuman chromosome Xq28[J].Cytogenet Cell Genet，1997，79(3-4):237-240.[0101][5]Chen YT, Scanlan MJ, Sahin U，et al.A testicular antigen aberrantlyexpressed in human cancers detected by autologous antibody screening[J].ProcNatl Acad Sci USA，1997，94(5):1914-1918.[0102][6]Fawell，S.等，T_at介導異體蛋白進入細胞.美國國家科學院院刊91，664-668(1994)
[0103][7]Frankel，A.D.&Pabo，C.0.HIV tat 蛋白的細胞攝取.細胞 55，1189-1193(1988)
[0104][8]Gnjatic S，Jader E，Chen W，et al.CD8 (+)T cell responses against adominant cryptic HLA-A2epitope after NY-ESO-1peptide immunization of cancerpatients[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99 (18):11813-11818.[0105][9]Held G，Matsuo M，Epel M，et al.Dissecting cytotoxic T cell responsestowards the NY-ESO-1protein by peptide/MHC specific antibody fragments[J].EurJ Immunol，2004，34(10):2919-2929.[0106][10]Jager E，NagataY，Gnjatic S，et al.Monitoring CD8+T cell response toNY-ES0-1 !correlation of humoral and cellular immune responses[J].Proc Natl AcadSci USA，2000，97(9):4760-4765.[0107][11]Jager E，Chen YT, Drijfhout JW, et al.Simultaneous humoral andcellular immune response against cencer—testis antigen NYES0—1:definitionof human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)-A2-binding peptideepitopes [J].J Exp Med，1998，187(2):265-270.[0108][12] Jager E，Gnjatic S，Nagata Y，et al.1nduction of primaryNY-ESO-1immunity:CD8+T lymphocyte and antibody responses in peptide-vaccinatedpatients with NY-ESO-l+cancers[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97 (22):12198-12203.[0109][13]Jungbluth AA, Antonescu CR，Busam KJ, et al.Monophasic and biphasicsynovial sarcomas abundantly express cancer/testis antigen NY-ESO-1but notMAGE-Alor CT7[J]Int J Cancer，2001，94(2):252-256.[0110][14]Kim，D.T.等，通過連接tat肽將可融性蛋白導入MHC-1類分子途徑.免疫學雜誌，159，1666-1668 (1997)[0111][15]Lethe B，Lucas S，Michaux L，et al.LAGE-1, a new gene with tumorspecificity[J].1nt J Cancer，1998，76(6):903-908.[0112][16]Lindgren，M.，Hallbrink，M.，Prochiantz，A.& Landel，U.穿細胞妝.藥理學動態.21,99-103(2000)
[0113][17] Ludewig，B.，Odermatt，B.，Ochsenbein，A.F.，Zinkernagel，R.M.&Hengartner, H.樹狀細胞在誘導和維持自身免疫病中的作用.免疫學回顧169，45-54(1999)
[0114][18] Oduns i K，Jungb Iuth AA，Stockert E，et a I.NY-ESO-1 andLAGE-1cancer-testis antigens are potential targets for immunotherapy inepithelial ovarian cancer[J].Cancer Res，2003，63(18):6076-6083.[0115][19]Rodolfo M，Luksch R，Stockert E，et al.Antigen-specific immunityin neuroblastoma patients:antibody and T—cell recognition of NY-ESO-1tumorantigen[J].Cancer Res，2003，63(20):6948-6955.[0116][20] Rojas，M.，Donahue，J.P.，Tan，Z.& Lin，Y.Z.有細胞膜穿透性的蛋白質的遺傳工程.自然生物工程.16,370-375(1998)
[0117][21] Schwarze, S.R.，Ho，A., Vocero-Akban, Α.& Dowdy, S.F.體內蛋白質傳導:將有生物活性的蛋白導入小鼠.科學，285，1569-1572 (1999)
[0118][22] Steinman,等，免疫學年評.9:271 (1991)
[0119][23] Shackl e ton MJ，Sturrock S，MacGreogor D，et al.CancerImmunosurveillancel999[C].New York:Cancer Research Institute，1999:1-9.[0120][24]Zeng G，Li Y，El-Gamil M，et al.Generation of Ny-ESO-1-specificCD4+and CD8+T cells by a single peptide with dual MHC class I and class IIspecificities:a new strategy for vaccine design[J].Cancer Res，2002，62(13):3630-3635.[0121][25]Zeng GiAldridge MEiTian X,et al.Dendritic cell surface calreticulinis a receptor for NY-ES0-1:direct interactions between tumor-associated antigenand the innate immune system[J].J Immunol，2006，177:3582-3589.[0122][26]Batchu RB, Moreno AM，Szmania SM，et al.Protein transduction ofdendritic cells for NY-ESO-1-Based immunotherapy of myeloma.Cancer Res，2005，65:10041-10049.[0123][27]Elliott，G & 0, Hare, P.單純皰疹病毒結構蛋白在細胞內轉移和蛋白質轉運中的作用.細胞88，223-233 (1997).[0124][28]Phelan，A.，Elliott，G.& O' Hare，P.用單純皰疹病毒 VP22 來導入有功能的 P53.自然生物技術.16,440-443(1998).[0125][29]Lin，Y.Z.，Yao, S.Y.，Veach, R.A.，Torgerson, Τ.R.& Hawiger, J.具有穿細胞肽和核定位的合成肽能抑制NF-KB轉錄因子進入細胞核.生物化學雜誌.270，14255-14258(1995).[0126][30]Mehta-Damani，A.等，1994 免疫學雜誌 153:996-1003.[0127] 本說明書中引述的所有文獻及所有專利/專利申請都應該視為其全文被本說明書引用 。
【權利要求】
1.一種分離的多肽，其具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列。
2.一種分離的多肽，其結構為一穿細胞肽在C-端與一個具有SEQ ID N0:15的胺基酸序列的多肽的N-端連結。
3.如權利要求2所述的分離的多肽，其中穿細胞肽具有SEQID NO:2-14的胺基酸序列。
4.一種組合物，包含如權利要求1-3所述的分離的多肽，及有關藥學上可接受的載體。
5.一種組合物，包含如權利要求1-3所述的分離的多肽，及免疫效應細胞。
6.如權利要求5所述的組合物，其中所述免疫效應細胞是樹狀細胞、B細胞、巨噬細胞和成纖維細胞。
7.如權利要求6所述的組合物，其中所述免疫效應細胞是成熟的樹狀細胞。
8.權利要求1-7所述組合物在製備抗腫瘤藥物中的應用。
9.如權利要求8述的應用，其中腫瘤為神經母細胞瘤、滑膜肉瘤、惡性黑色素瘤、和卵巢上皮癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、多發性骨髓癌、肝細胞癌、肺癌、食管癌和子宮癌。
10.如權利要求7所述的應用，其中腫瘤為前列腺癌。
11.一種疫苗，該疫苗包含權利要求3-6中所述的組合物。
【文檔編號】C07K19/00GK103965360SQ201310045976
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月5日 優先權日:2013年2月5日
【發明者】王榮福 申請人:杭州威星藥業有限公司