一種霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒及其檢測方法

2023-06-06 14:05:21

專利名稱：一種霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及體外診斷試劑技術領域，具體涉及一種霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒 及其檢測方法。
背景技術：
霍亂是一類以腹瀉為主要症狀的烈性傳染病，至今已發生7次世界大流行，1961 年開始由埃爾託霍亂弧菌引起的霍亂第7次世界大流行，波及140個國家和地區，報告病例 400萬以上。據WHO專家會議估計，全球每年約發生550萬例，其中以亞洲、非洲和拉丁美洲 較為嚴重，引起亞洲10萬和非洲2萬人死亡。時至今日，霍亂仍然是最危險的烈性傳染病 之一。因此，早期迅速和正確的診斷對治療和預防本病的蔓延有重大意義。目前霍亂弧菌已被分為200多個血清群，但只有01血清群和0139血清群能夠引 起流行。霍亂毒素(cholera toxin, CTX)是由致病的霍亂弧菌分泌的一種蛋白質，其結構 基因位於染色體上大小為7 9. 7kb的CTX遺傳單元上，它由A、B兩個亞單位構成，其中A 亞單位是霍亂毒素的產毒亞單位，可進入人體小腸細胞內導致人體水分和電解質的大量丟 失，嚴重時危害人生命。傳統霍亂弧菌檢測方法，由於其檢測周期長、程序複雜、所需試劑繁多等缺點已遠 遠不能滿足現代檢測要求。以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為代表的病原核酸檢測技術在 實際應用中存在一些問題，如普通聚合酶鏈式反應(PCR)技術需要專門的儀器，而且存在 容易交叉汙染和操作過程煩瑣的缺點。而螢光實時定量聚合酶鏈式反應(real time PCR) 技術雖然較好地解決了交叉汙染的問題，並簡化了操作過程，但卻需要更複雜的定量測定 儀器，因此不適用於現場快速檢測。而且實時定量聚合酶鏈式反應PCR技術中螢光探針的 成本較高，加大了推廣應用的難度。免疫學檢測技術快速簡便成本低廉，但要求高質量高穩 定性的單克隆抗體，否則因準確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運用生物技 術發展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中恆溫擴增 (IsothermalAmplification)核酸快速檢測技術是病原核酸檢測技術上的長足進步，現已 建立起來的環介導恆溫擴增技術(LAMP)具有很多的優越性。因此，需要一種檢測效果更全面、特異性更高、漏檢率更低的霍亂弧菌毒力基因檢 測試劑盒及檢測方法以解決上述問題。基於環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplication of DNA，簡 稱LAMP)是利用Bst DNA聚合酶和根據靶基因序列設計的三對特殊的引物(即內引物FIP/ BIP、外引物F3/B3以及環引物LF/LB)，特異性識別靶序列上的六個獨立區域，啟動循環鏈 置換反應，在靶標DNA區啟動互補鏈合成，結果在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多 環的花椰菜結構的莖環DNA混合物。LAMP反應過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應 溶液中的Mg2+結合，產生副產物——焦磷酸鎂乳白色沉澱，即可通過肉眼觀察判定結果。加 入顯色試劑後，結果判定更加方便容易。LAMP反應是在恆溫(63 65°C )條件下45 90 分鐘內完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環使所需儀器簡單化，克服了傳統PCR固有的檢測時間長、容易汙染及檢測成本高等缺點。此外，這種檢測方法對檢測人員的 技術素質要求較低，實際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設備，有利於建立成本低 廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴增法。將恆溫基因擴增 技術與PCR技術(包括螢光實時定量PCR技術)進行比較，可以發現該技術在靈敏度、特異 性和檢測範圍等方法學指標上相當於或優於PCR技術，且不依賴任何專門的儀器設備即可 實現現場高通量快速檢測，而且檢測成本遠低於螢光定量PCR技術。目前國家標準中以微 生物分離培養和形態學鑑定為主、結合生化分析和血清學分型鑑定的通行方法，初步鑑定 需2 3天，完成鑑定報告需10 15天。申請號為200810157500. 0的在先申請已經公開了產霍亂毒素霍亂弧菌環介導等 溫擴增快速檢測方法，與此在先申請相比較，本發明的檢測試劑盒與檢測方法採用了三對 引物(內引物FIP/BIP、外引物F3/B3以及環引物LF/LB)，使得本發明的檢測試劑盒與方法 具有更好的擴增效率、特異性及靈敏性。並且，本發明的反應體系中加入了羥基萘酚藍顯色 液，鑑定結果更為直觀清晰。

發明內容
本發明所要解決的技術問題之一是克服現有技術中耗時長，漏檢率高，實驗設備 要求較高的不足，提供一種檢測效果更全面、特異性高、靈敏性好，漏檢率低，方便簡單易操 作的霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒。本發明所提供的霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒包括下列組成以霍亂弧菌CtxA 基因為靶基因、基於環介導恆溫擴增技術設計的各三對引物內引物FIP/BIP、外引物F3/ B3、環引物LF/LB，以及Bst DNA聚合酶、反應液、樣品預處理液、顯色液、穩定液和陽性對
照，所述的三對引物序列分別為內引物FIP 5『-CCAAAATGAACTCGATACCATCCATAAGAAGTTTCTGCTTTAGGTG-3『 (SEQ ID NO 1)內引物 BIP :5，-GGTGCTTGATGAACAATTACATCGTCTGCTGCTGGAGCAATA-3，(SEQ ID NO 2)外弓丨物F3 :5，-AGTCCTCATCCAGATGAAC-3，(SEQ ID NO 3)外弓丨物B3 :5，-CCTGCCAATCCATAACCA-3，(SEQ ID NO 4)環引物LF :5，-ATATTTGGGAGTATGGAATCC-3，(SEQ ID NO 5)環引物LB :5，-TAATAGGGGCTACAGAGATAGATA-3，(SEQ ID NO 6)所述的內引物FIP/BIP、環引物LF/LB各為1. 2 2. 0 μ mol/L，外引物F3/B3的濃 度各為0. 2 0. 25 μ mol/L ；優選內引物FIP/BIP、環LF/LB的濃度為1. 6 μ mol/L，外引物 F3/B3 的濃度為 0. 2 μ mol/L。所述的Bst DNA聚合酶酶濃度4-10U/μ L，優選酶濃度為8U/y L。所述的反應液含1.4 2mmol/L dNTPs,20 25mmol/L Tris-HClUO 12. 5mmol/L KCl、10 12. 5mmol/L (NH4)2SO4,8 10mmol/L MgS04、0. 1 0. 125 體積 % TritonX-100,0. 8 lmol/L 甜菜鹼；優選L4mmol/L dNTPs、20mmol/L Tris-HClU0mmol/L KCl、1 Ommo 1/L(NH4)2S04、8mmol/LMgS04、0. 1% TritonX_100、0· 8mol/L 甜菜鹼。 所述的顯色液為HNB (羥基萘酚藍)或STOR Green I，優選HNB (羥基萘酚藍)。所述穩定液為礦物油。所述的陽性對照為霍亂弧菌01群或0139群基因組DNA。本發明所要解決的另一技術問題是提供一種霍亂毒素毒力基因檢測方法，包括如 下步驟(1)將待測樣品離心，去上清，得到沉澱；(2)將步驟(1)的沉澱加入本發明檢測試劑盒中的樣品預處理液，混合均勻，沸水 浴滅活後冰上冷卻，高速離心，上清即為樣品模板DNA ；(3)在反應容器中加入本發明試劑盒中的Bst DNA聚合酶0.9 1.8體積份數、反 應液38 40體積份數、穩定液52 54. 5體積份數、樣品模板DNA 4. 5 9體積份數、內 引物FIP/BIP、環引物LF/LB各2體積份數、外引物F3/B3各4體積份數，恆溫反應；(4)反應結束後，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性；步驟(3)中所述的恆溫反應的反應條件為溫度63 65°C，反應時間45 90min。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果1.本發明的檢測試劑盒只需一個恆 定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑與設備，檢測成本低；2.由於選擇了霍亂毒素(CTX) 毒力基因的核酸序列的特異性保守區進行引物設計，應用六個區段，六條引物，使得本發明 的檢測試劑盒檢測霍亂弧菌毒力基因的準確率更高。3.本發明的檢測試劑盒擴增快速且 高效，在不到1小時即可完成擴增，且產率更高；4.本發明的基因快速診斷試劑盒，根據是 否擴增就能判斷靶標物質的存在與否，因此具有高特異性；5.本發明的檢測試劑盒靈敏度 高，擴增模板僅需10拷貝或更少；6.本發明的基因快速診斷試劑盒鑑定簡便，可通過肉眼 觀察鑑定，顯色試劑(HNB)羥基萘酚藍使得陰陽性結果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯 可靠。


圖1為實施例2霍亂弧菌01群LAMP靈敏度實驗結果。圖2為實施例2霍亂弧菌01群LAMP靈敏度實驗結果電泳圖。圖3為實施例2霍亂弧菌01群PCR靈敏度實驗結果電泳圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定 的範圍。實施例1霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒的製備(1)按以下序列經DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物內引物FIP 5『-CCAAAATGAACTCGATACCATCCATAAGAAGTTTCTGCTTTAGGTG-3『 (SEQ ID NO 1)內引物 BIP :5，-GGTGCTTGATGAACAATTACATCGTCTGCTGCTGGAGCAATA-3，(SEQ ID NO2)外弓丨物F3 :5，-AGTCCTCATCCAGATGAAC-3，(SEQ ID NO 3)外弓丨物B3 :5，-CCTGCCAATCCATAACCA-3，(SEQ ID NO 4)環引物LF :5，-ATATTTGGGAGTATGGAATCC-3，(SEQ ID NO 5)環引物LB :5，-TAATAGGGGCTACAGAGATAGATA-3，(SEQ ID NO 6)(2)購置DNA聚合酶Bst DNA聚合酶置於容器；(3)配製反應液和引物反應液含有 1.4mmol/L dNTPs,20mmol/L Tris-HCl, 10mmol/LKCl, 10mmol/L (NH4) 2S04,8mmol/L MgS04、0. 1% ΗοηΧ-100、0· 8mol/L 甜菜鹼、內 引物FIP/BIP、環引物LF/LB各1· 6 μ mol/L和外引物F3/B3各0. 2 μ mol/L,置於容器；(4)配製樣品預處理液樣品預處理液含有20mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)、2mmol/ LEDTA 和 1. 2%體積 Triton X-100，置於容器；(5)購置穩定液礦物油，置於容器；(6)購置顯色液HNB (羥基萘酚藍)，置於容器；(7)提取陽性對照提取霍亂弧菌01群基因組DNA，置於容器；(8)將上述7個容器裝成試劑盒，封裝。製備工藝簡述如下1、將內引物FIP/BIP、外引物F3/B3以及環LF/LB合成純化後，定量配製，濃度檢 測，抽樣質檢；2、將上述(2) (4)步驟配製的液體無菌分裝，並按照實驗用進行濃度確定，抽樣 質檢；3、將穩定液分裝，抽樣質檢；4、將陽性對照標本製備，分裝，抽樣質檢；5、組裝試劑盒。實施例2霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒的應用1材料與方法1. 1 材料1. 1. 1 菌株本發明採用菌株有14株，主要來源於中國疾病預防控制中心、上海市疾病預防控 制中心、浦東新區疾病預防控制中心。詳見表1。表1菌株名稱及來源
權利要求
1.一種霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒，包括Bst DNA聚合酶，反應液，樣品預處理液， 顯色液，穩定液和陽性對照，其特徵在於還包括以霍亂弧菌CtxA基因為靶基因、基於環介 導恆溫擴增技術設計的各三對引物內引物FIP/BIP、外引物F3/B3以及環引物LF/LB，所述 的三對引物分別為內引物 FIP :5，-CCMMTGMCTCGATACCATCCATMGMGTTTCTGCTTTAGGTG-3，SEQ ID NO 1內引物 BIP :5』 -GGTGCTTGATGAACAATTACATCGTCTGCTGCTGGAGCAATA-3』 SEQ ID NO 2外弓丨物 F3 :5，-AGTCCTCATCCAGATGAAC-3，SEQ ID NO 3夕卜弓丨物 B3 :5，-CCTGCCAATCCATAACCA-3，SEQ ID NO 4環引物 LF:5』 -ATATTTGGGAGTATGGAATCC-3，SEQ ID NO 5環引物 LB :5』 -TAATAGGGGCTACAGAGATAGATA-3』 SEQ ID NO 6
2.根據權利要求1所述的霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒，其特徵在於所述的內 引物FIP/BIP、環引物LF/LB均為1. 2 2. Ομπιο /L，外引物F3/B3的濃度均為0. 2 0.25 μmol/L0
3.根據權利要求2所述的霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒，其特徵在於內引物FIP/ BIP、環引物LF/LB的濃度均1. 6ymol/L，外引物F3/B3的濃度為0. 2ymol/L。
4.根據權利要求1所述的霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒，其特徵在於所述的BstDNA 聚合酶酶濃度4-10υ/μ 1，所述的顯色液為羥基萘酚藍或SYBR Green I。
5.根據權利要求4所述的霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒，其特徵在於所述的酶濃度 為8U/μ L，所述的顯色液為羥基萘酚藍。
6.根據權利要求1所述的霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒，其特徵在於所述的反 應液含1.4 2mmol/L dNTPs、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KC1、10 12. 5mmol/L (NH4) 2S04、8 lOmmol/L MgS04、0. 1 0. 125 體積％ TritonX_100、0· 8 lmol/ L甜菜鹼。
7.根據權利要求6所述的霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒，其特徵在於所述的反應 液含1.4mmol/L dNTPs、20mmol/L Tris-HClU0mmol/L KCl、1 Ommo 1/L(NH4)2S04、8mmol/L MgS04、0. 1% TritonX-100,0. 8mol/L 甜菜鹼。
8.根據權利要求1所述的霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒，其特徵在於所述穩定液為 礦物油；所述的陽性對照為霍亂弧菌01群或0139群基因組DNA ；所述的樣品預處理液含 20mmol/L ρΗ8· 0 的 Tris-HCl、2mmol/L EDTA 禾口 1. 2%體積 Triton X-100。
9.一種根據權利要求1的試劑盒進行的霍亂毒素毒力基因檢測方法，其特徵在於包 括如下步驟(1)將待測樣品離心，去上清，得到沉澱；(2)將步驟(1)的沉澱加入權利要求1檢測試劑盒中的樣品預處理液，混合均勻，沸水 浴滅活後冰上冷卻，高速離心，上清即為樣品模板DNA ；(3)在反應容器中加入權利要求1檢測試劑盒中的BstDNA聚合酶0. 9 1. 8體積份 數、反應液38 40體積份數、穩定液52 54. 5體積份數、樣品模板DNA 4. 5 9體積份 數、內引物FIP/BIP、環引物LF/LB各2體積份數、外引物F3/B3各4體積份數，恆溫反應； 其中所述的內引物FIP/BIP、外引物F3/B3以及環引物LF/LB為以霍亂弧菌ctxA基因為靶 基因、基於環介導恆溫擴增技術設計的各三對引物，其序列分別為內引物 FIP :5，-CCMMTGMCTCGATACCATCCATMGMGTTTCTGCTTTAGGTG-3，SEQ ID NO 1 內引物 BIP :5』 -GGTGCTTGATGAACAATTACATCGTCTGCTGCTGGAGCAATA-3』 SEQ ID NO 2 夕卜弓丨物 F3 :5，-AGTCCTCATCCAGATGAAC-3，SEQ ID NO 3 夕卜弓丨物 B3 :5，-CCTGCCAATCCATAACCA-3，SEQ ID NO 4 環引物 LF:5』 -ATATTTGGGAGTATGGAATCC-3，SEQ ID NO 5 環引物 LB :5』 -TAATAGGGGCTACAGAGATAGATA-3』 SEQ ID NO 6 (4)反應結束後，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性。 、
10.根據權利要求9所述的霍亂毒素毒力基因檢測方法，其特徵在於步驟(3)中所述 的恆溫反應的反應條件為溫度63 65°C，反應時間45 90min。
全文摘要
本發明涉及一種霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒及其檢測方法，本發明的試劑盒包括以霍亂弧菌ctxA基因為靶基因、基於環介導恆溫擴增技術設計的三對引物內引物FIP/BIP、外引物F3/B3、環引物LF/LB，以及Bst DNA聚合酶、反應液、樣品預處理液、顯色液、穩定液和陽性對照；檢測霍亂毒素毒力基因的方法包括細菌DNA的提取、霍亂毒素毒力基因的環介導恆溫擴增和顯色檢測。本發明的霍亂毒素毒力基因檢測試劑盒擴增效率高、特異性強、靈敏度高、漏檢率低，顯色效果明顯，適用於產毒霍亂弧菌的快速檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102094090SQ201010584749
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月13日 優先權日2010年12月13日
發明者張勝萍, 杜正平, 王傳貴, 王婷, 田楨幹, 陸曄 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局, 華東師範大學