一種鋯基親水色譜柱的製備方法及其在測定原料乳及乳製品中三聚氰胺含量中的應用的製作方法

2023-06-12 22:50:36 2

專利名稱：一種鋯基親水色譜柱的製備方法及其在測定原料乳及乳製品中三聚氰胺含量中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種鋯基親水作用色譜柱的製備方法及其在測定原料乳及乳製品中三聚氰胺含量中的應用，屬於色譜檢測技術領域。
背景技術：
色譜柱是色譜的「心臟」。理想的色譜柱應該具有良好的化學穩定性、滲透性；另夕卜，色譜柱的柱壽命要長，這樣就能充分保障色譜數據的重複性；最重要的是，色譜柱對待測組分要有適當的保留作用，容量因子k』在2 10範圍內為宜。三聚氰胺是一種化工原料，因分子中含氮量高，稱為「蛋白精」。乳製品中如果含有三聚氰胺，可能會導致嬰幼兒尿結石、腎衰竭等嚴重疾病，甚至死亡。2008年中國爆發三聚 氰胺毒奶粉事件後，國家質量監督檢驗檢疫總局和國家標準化管理委員會頒布了《原料乳與乳製品中三聚氰胺檢測方法》(GB/T22388-2008)。該標準包括三個方法高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜/質譜法(LC-MS/MS)和氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS和GC-MS/MS)。三聚氰胺極性強，易解離成離子，所以在傳統色譜柱CS柱和C18柱上不被保留。GB/T22388-2008HPLC法中採用離子對色譜法解決這一問題，但是離子對試劑的加入不但增加檢測費用，而且會造成基線漂移，影響檢測結果的靈敏度和準確性。更重要的是這種分離模式需要的樣品預處理操作非常煩瑣，周期冗長，檢測效率低，有機試劑用量大，有些步驟還會導致假陽性結果出現。因此研究開發簡便、快速、靈敏、準確、適用於HPLC檢測食品中三聚氰胺的方法，對維護食品安全，保護人民的身體健康和消費者的合法權益，促進食品行業的快速健康發展具有重要意義。色譜實踐表明親水作用色譜(Hydrophilic interaction liquidchromatography,HILIC)能有效保留反相色譜中保留弱或不保留的強極性物質。本發明採用鋯基親水作用色譜法測定原料乳及乳製品中三聚氰胺的含量。

發明內容
本發明目的是提供一種性能良好的鋯基親水作用色譜柱。本發明目的之二是提供一種鋯基親水作用色譜柱的應用，也就是提供一種簡便、快速、準確測定乳製品中三聚氰胺的HPLC方法。具體的，本發明所說的鋯基親水作用色譜柱的製備方法，包括以下步驟(I)將顆粒分布均勻、直徑3 5 μ m的矽膠微米球顆粒置於6mol/L的鹽酸溶液中超聲O. 5 2h，進行活化預處理，過濾，用蒸餾水充分洗滌至無氯離子存在，乾燥；(2)將步驟⑴處理過的矽膠微米球放入濃度為O. 001 O. 12mol/L十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液中，磁力攪拌或超聲0.5 3h，過濾、洗滌、乾燥，得到在矽球表面被膜一層表面活性劑的複合物(SiO2-SDS)；
(3)將步驟(2)得到的複合物(SiO2-SDS)置入鋯溶液或鋯溶膠中，磁力攪拌或超聲0.5 3h，靜置、過濾、洗滌、乾燥，得到組裝一層納米氧化鋯的複合物(SiO2-SDS-ZrO2)；(4)將上述複合物(SiO2-SDS-ZrO2)重複步驟(2)、(3)操作4_8次，得到組裝多層納米氧化鋯的複合物微米球；(5)將步驟(4)得到的在矽球表面組裝了多層氧化鋯的複合物微米球在500 600°C灼燒，得到表面多層納米氧化鋯包覆微米矽球，經進一步浮選得到顆粒均勻的核殼型鋯基親水作用色譜填料，即為Zr/Si HILIC。(6)將步驟(5)製備的Zr/Si HILIC微球，以四氯化碳為勻漿液、甲醇為頂替液，勻漿法裝入色譜柱中，色譜柱標記為HBSD-Zr/Si HILIC柱。本發明提供的一種鋯基親水作用色譜柱的應用，具體就是在測定原料乳及乳製品 中三聚氰胺含量中的應用，通過以下步驟來實現(I)樣品預處理液態奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等其中一種，取lg(精確至O. OOOlg試樣置於50mL具有塞子的塑料離心管中，向離心管加SmL質量濃度為I %的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超聲提取IOmin,振蕩提取IOmin,以大於4500r/min的轉速離心IOmin,取ImL上清液用O. 2 μ m濾膜過濾，待HPLC測定；或者取奶酪、奶油和巧克力等其中一種，稱取lg(精確至O. OOOlg)試樣於研缽中，加入5g海砂研磨成乾粉狀，定量轉移至50mL具塞塑料離心管中，向離心管加8mL質量濃度為1%的三氯乙酸溶液和2mL乙腈,超聲提取IOmin,振蕩提取IOmin,以大於4500r/min的轉速離心IOmin,取ImL上清液用O. 2 μ m濾膜過濾,待HPLC測定；(2)高效液相色譜分離分析條件如下色譜柱HBSD-Zr/SiHILIC 柱(100X4. 6mm)流動相0. 05M磷酸鹽緩衝液(pH = 3. O)乙腈=90 10 (V/V)流速I. OmT,/miη檢測器紫外檢測器(或二極體陣列檢測器)波長240nm進樣量20μ L柱溫室溫(3)三聚氰胺標準曲線的繪製準確稱取IOOmg三聚氰胺標準品置於IOOmL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解並定容至刻度，搖勻，配製成濃度為lmg/mL的標準儲備液，於4° C避光保存。準確移取標準儲備液，用流動相稀釋定容，得到濃度為O. 2,0. 8,2. 0,20. 0,40. O,80. 0,120. 0,150. Og/mL的標準溶液系列。按濃度由低到高依次進樣進行HPLC分離測定，以峰面積A對濃度C作圖，得一條直線如圖I所示，為三聚氰胺的標準曲線。(4)樣品定量測定待測樣品經步驟(I)程序進行樣品預處理後，在與繪製標準曲線完全相同的色譜條件下進行HPLC分析。待測樣液中三聚氰胺的響應值應在標準曲線線性範圍內，超過線性範圍必須稀釋後再進樣分析。
本發明取得以下有益效果I、本發明使用鋯基親水作用色譜柱，能有效保留三聚氰胺。相對於GB/T22388-2008HPLC法，本發明分析操作中無需添加離子對試劑，可降低檢測成本30 %，節省分析時間20%。2、樣品預處理操作簡便、快速本發明方法由於採用鋯基親水作用色譜分離模式，共存雜質在色譜柱上無保留，因此提取液不需要進一步淨化，經過膜後可直接進HPLC儀器進行測定。省略了過濾、固相萃取淨化和氮氣吹乾等繁瑣步驟，使樣品預處理所需時間短，有機溶劑用量少。與國標方法相比，單一樣品處理可降低50%的成本，節省60%的處理時間。3、樣品可以批量處理，一次可同時進行12個樣品的處理，節省時間，成本降低。4、回收率高因為樣品預處理步驟少，可減少處理過程中的樣品損失。本發明方法在Img/kg, 10mg/kg和100mg/kg三個不同濃度水平下的加標回收率在93-105%之間。5、方法靈敏度高GB/T22388-2008HPLC法中，由於流動相中離子對試劑的加入加大了基線噪聲，使檢測靈敏度降低，檢測定量限為2mg/kg。本發明方法流動相組成簡單，基線平穩、噪聲小，使其檢測靈敏度增加，檢測定量限為0.01mg/kg。6、精密度高相對標準偏差小於3%。7、流動相組成簡單，與質譜兼容本發明的色譜柱及色譜條件可直接用於LC-MS/MS分析測定。
8、色譜性能穩定，色譜柱使用壽命長本發明方法由於流動相極性大，可將提取液中的雜質脫除掉，不會累積在色譜柱上，所以色譜性能穩定。另外由於色譜柱固定相是不經修飾的Zr/Si HILIC填料，色譜柱可以用強酸強鹼衝洗。色譜柱可永遠使用。9、重複性好擁有一根HBSD-Zr/Si HILIC色譜柱，可永遠使用，充分保證色譜數據(保留時間、峰面積、定性、定量)的重複性。


圖I是三聚氰胺標準曲線。圖2是三聚氰胺陰性樣品色譜峰圖。圖3是三聚氰胺陽性樣品色譜峰圖。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明。實施例I鋯基色譜柱的製備和三聚氰胺的分離將經仔細篩選的顆粒直徑為3. 5 μ m(s = 0. 30)的矽膠微米球置於6mol/L的鹽酸溶液中超聲0. 5h進行活化預處理，抽濾、洗滌、乾燥。將經活化預處理過的矽膠微米球放入0. lmol/L的鋯溶液中磁力攪拌I. 5h進行自組裝，得到在矽球表面組裝一層氧化鋯納米顆粒的複合物SiO2-ZrO2，抽濾，洗漆，乾燥；反覆上述操作四次。經500°C灼燒，即可製得核-殼型Zr02/Si02微球，將Zr02/Si02微米球進一步浮選後得到Zr/Si HILIC。經分析表徵Zr/Si HILIC粒徑3. 7 μ m(s = 0. 31)，圓筒狀中孔結構，比表面積為168. lm2/g，孔體積0. 377cm3/g，孔徑8. 5nm,滲透性與娃膠接近,在pH = 1-12範圍內化學性質穩定，實驗數據表明Zr/Si HILIC是一種較為理想的鋯基色譜填料。用勻漿法將本實施例製備的Zr/Si HILIC裝入100X4. 6mm色譜柱中，得到本發明的產品HBSD-Zr/Si HILIC色譜柱。在流動相0. 05M磷酸鹽緩衝液(pH = 3. 0)乙腈=90 10 (V/V)時，三聚氰胺的保留時間為3. 210min，容量因子k』為3. 7。
實驗說明HBSD_Zr/Si HILIC是一種親水作用色譜柱，特別適合於強極性和親水性化合物的分離分析。對三聚氰胺的保留適中(2 <k』< 10)，非常適用於三聚氰胺的含量的測定。實施例2空白實驗於50mL具塞塑料離心管中加SmL濃度為I %的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超聲提取IOmin,振蕩提取IOmin,以大於4500r/min的轉速離心IOmin,取ImL上清液用O. 2μηι濾膜過濾。室溫下進行HPLC測定，用標準曲線法定量。結果未檢出三聚氰胺。空白實驗表明樣品處理過程對三聚氰胺的測定無幹擾。實施例3陰性樣品及檢測定量限的確定準確稱取Ig(精確至O. OOOlg)奶粉陰性樣品於50mL具塞塑料離心管中，向離心·管加8mL濃度為I %的三氯乙酸溶液和2mL乙腈,超聲提取IOmin,振蕩提取IOmin,以大於4500r/min的轉速離心IOmin,上清液經O. 2 μ m濾膜過濾,室溫下進行HPLC測定。用標準曲線法定量，結果未檢出三聚氰胺(見圖2)。向IOOg奶粉陰性樣品中準確添加O. OlOOg三聚氰胺標樣，充分混勻。準確稱取樣品Ig (精確至O. OOOlg)於50mL具塞塑料離心管中，採用如上方法提取，以該提取溶液作為母液，逐級稀釋進行測定，按10倍信噪比，確定該方法檢測定量限為O. 01mg/kg。實施例4陽性對照品準確稱取Ig (精確至O. OOOlg)三聚氰胺含量為113. 96mg/kg的奶粉樣品(河北省進出口檢驗檢疫局提供)於50mL具塞塑料離心管中，向離心管加SmL濃度為I %的三氯乙酸溶液和2mL乙腈,超聲提取IOmin,振蕩提取IOmin,以大於4500r/min的轉速離心IOmin,上清液經O. 2μπι濾膜過濾，室溫下進行HPLC測定。平行測定3次，用標準曲線法定量。測定結果為三聚氰胺的含量為117. 28mg/kg，相對誤差為2. 91%。 陽性對照品實驗表明本發明方法準確度高。實施例5方法的加標回收率和精密度準確稱取Ig (精確至O. OOOlg)奶粉陰性樣品三份於50mL具塞塑料離心管中，分別向其中定量加入20 μ L、0. 2mL和2. OmL濃度為50. O μ g/mL的三聚氰胺標準溶液，與樣品混勻。向離心管加SmL濃度為1%的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超聲提取lOmin，振蕩提取IOmin,以大於4500r/min的轉速離心IOmin,上清液經O. 2 μ m濾膜過濾,室溫下進行HPLC測定。先進行標準曲線繪製，然後進行樣品測定，每個樣品平行測定6次，用標準曲線法定量，測定lmg/kg, 10mg/kg和100mg/kg三個不同添加水平的回收率。實驗結果表明3個濃度水平下的平均加標回收率在93-105%之間。相對偏差均小於3%。實施例6與GB/T22388-2008國標方法對照(I)本發明方法取2g(精確至精確至O. Olg)奶粉陰性樣品於50mL具塞塑料離心管中，準確移取濃度為20. O μ g/mL的三聚氰胺標準溶液10 μ L於離心管中，與樣品混勻。向離心管加15mL濃度為I %的三氯乙酸溶液和5mL乙腈,超聲提取IOmin,振蕩提取IOmin,以4500r/min的轉速離心IOmin,以大於4500r/min的轉速離心IOmin,上清液經0. 2 μ m濾膜過濾,室溫下進行HPLC測定。色譜條件為HBSD-Zr/Si HILIC(100X4. 6mm)，流動相為0. 05M磷酸鹽緩衝液(pH = 3. O)乙腈=90 10，流速I. OmL/min,進樣量20 μ L，紫外檢測器，波長240nm。先進行標準曲線繪製，然後進行樣品測定，平行測定3次，用標準曲線法定量，測定結果為
O.103mg/kg。⑵GB方法取2g(精確至精確至O. Olg)奶粉陰性樣品於50mL具塞塑料離心管中，準確移取濃度為20. O μ g/mL的三聚氰胺標準溶液10 μ L於離心管中，與樣品混勻。向離心管加15ml濃度為I %的三氯乙酸溶液和5ml乙腈,超聲提取IOmin,再振蕩提取IOmin,以4500r/min的轉速離心5min。上清液經I %的三氯乙酸溶液溼潤的濾紙過濾、洗滌後，用三氯乙酸溶液定容至25mL。移取濾液5mL，加入5mL水混勻，做待淨化液。將淨化液轉移至固相萃取柱中。依次用3mL水和3mL甲醇洗滌，抽至近幹時，用6mL氨化甲醇溶液洗脫。洗脫液於50C°下用氮氣吹乾，殘留物用ImL流動相定容，渦旋混合lmin，過O. 2 μ m微孔濾膜後，進行HPLC測 定。色譜條件色譜柱C18柱(250X4. 6mm)，流動相=IOmmol辛烷磺酸鈉乙睛=90 10， 流速I. OmL/min,進樣量20 μ L，紫外檢測器，波長240nm，溫度室溫。先進行標準曲線繪製，然後進行樣品測定，平行測定3次，用標準曲線法定量。測定結果為未檢出。結論與國標方法相比，本發明方法更簡便、快速、靈敏、準確。實施例7LC-MS/MS取lg(精確至O. OOOlg)三聚氰胺含量為113. 96mg/kg的奶粉樣品(河北省進出口檢驗檢疫局提供)於50mL具塞塑料離心管中，向離心管加SmL濃度為I %的三氯乙酸溶液和2mL乙腈,超聲提取IOmin,振蕩提取IOmin,以大於4500r/min的轉速離心IOmin,上清液經0.2μπι濾膜過濾。室溫下進行LC-MS/MS測定。色譜條件為色譜柱Zr/Si HILIC (120 X 4. 6mm)，流動相pH =
4.5，IOmmoI/L乙酸銨緩衝溶液與乙腈比例為90 10，流速為O. 4ml/min,柱溫為室溫，進樣量dOyL。質譜條件為乾燥氣溫度350°C，流速5L/min、噴霧器氣壓30psi，碰撞能量20V。以豐度最強的碎片離子85. I為定量離子，以豐度次強的碎片離子68. I為定性離子。平行測定3次，測定結果為116. 39mg/kg。實驗結果表明本發明的鋯基親水作用色譜柱和本發明的樣品預處理操作能夠滿足 GB/T22388-2008 第二法 LC-MS/MS 的應用。實施例8含乳製品，固體準確稱取艾詩濃酸奶巧克力(生產批號6933186201593)樣品lg(精確至
O.OOOlg)於研缽中，加入5g海砂研磨成乾粉狀，定量轉移至50mL具塞塑料離心管中。於離心管中加8mL濃度為I %的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超聲提取lOmin，振蕩提取lOmin，以大於4500r/min的轉速離心IOmin,上清液經O. 2 μ m濾膜過濾,室溫下進行HPLC測定,外標法定量。檢測結果未檢出三聚氰胺。實施例9液態奶準確稱取伊利純牛奶(生產批號20101011NW21C1)樣品Ig (精確至O. OOOlg)於50mL具塞塑料離心管中，向離心管加SmL濃度為I %的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超聲提取IOmin,振蕩提取IOmin,以大於4500r/min的轉速離心IOmin,上清液經O. 2 μ m濾膜過濾，室溫下進行HPLC測定，外標法定量。平行測定3次。測定結果為未檢出。本發明並不限於上述的實施例。
本發明所建立的方法測定了液態奶、奶粉、酸奶、奶糖、雪糕、豆奶、奶酪和煉奶等多種產品。可廣泛用於原料乳、乳製品以及含乳製品中三聚氰胺的檢測。實驗結果表明在各個可量化的指標上本發明方法都展現出國標方法GB/T22388-2008不可比擬的優勢。·
權利要求
1.一種鋯基親水色譜柱的製備方法，其特徵在於包括以下步驟 (1)將顆粒分布均勻、直徑3 5μ m的矽膠微米球顆粒置於6mol/L的鹽酸溶液中超聲O. 5 2h，進行活化預處理，過濾，用蒸餾水充分洗滌至無氯離子存在，乾燥； (2)將步驟(I)處理過的矽膠微米球放入濃度為O.OOl O. 12mol/L十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液中，磁力攪拌或超聲O. 5 3h,過濾、洗漆、乾燥,得到在娃球表面被膜一層表面活性劑的複合物(SiO2-SDS)； (3)將步驟(2)得到的複合物(SiO2-SDS)置入鋯溶液或鋯溶膠中，磁力攪拌或超聲O. 5 3h，靜置、過濾、洗滌、乾燥，得到組裝一層納米氧化鋯的複合物(SiO2-SDS-ZrO2)； (4)將上述複合物(SiO2-SDS-ZrO2)重複步驟(2)、(3)操作4 8次，得到組裝多層納米氧化鋯的複合物微米球； (5)將步驟(4)得到的在矽球表面組裝了多層氧化鋯的複合物微米球在500 600°C灼燒，得到表面多層納米氧化鋯包覆微米矽球，經進一步浮選得到顆粒均勻的核殼型鋯基親水作用色譜填料，即為Zr/Si HILIC ； (6)將步驟(5)製備的Zr02/Si0j^t，以四氯化碳為勻漿液、甲醇為頂替液，勻漿法裝入色譜柱中，色譜柱標記為HBSD-Zr/Si HILIC柱。
2.如權利要求I所述的鋯基親水色譜柱在測定原料乳及乳製品中三聚氰胺含量中的應用，其特徵在於包括以下步驟 (1)樣品預處理 取Ig液態奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖中的一種試樣置於50mL具有塞子的塑料離心管中，向離心管內加入SmL質量濃度為I %的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超聲提取lOmin，振蕩提取IOmin,以大於4500r/min的轉速離心IOmin,取ImL上清液用O. 2 μ m濾膜過濾,待HPLC測定； 或取奶酪、奶油和巧克力其中一種試樣Ig置於研缽中，加入5g海砂研磨成乾粉狀，定量轉移至50mL具塞塑料離心管中，向離心管內加入SmL質量濃度為I %的三氯乙酸溶液和2mL乙腈,超聲提取IOmin,振蕩提取IOmin,以大於4500r/min的轉速離心IOmin,取ImL上清液用O. 2 μ m濾膜過濾，待HPLC測定； (2)高效液相色譜分離分析 色譜條件如下 色譜柱HBSD-Zr/Si HILIC 柱 100X4. 6mm 流動相0. 05M磷酸鹽緩衝液乙腈=90 10流速 I. OmT,/miη 檢測器紫外檢測器或二極體陣列檢測器 波長240nm 進樣量20yL 柱溫室溫 (3)三聚氰胺標準曲線的繪製 準確稱取IOOmg三聚氰胺標準品置於IOOmL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解並定容至刻度，搖勻，配製成濃度為lmg/mL的標準儲備液，於4° C避光保存； 準確移取標準儲備液，用流動相稀釋定容，得到濃度為O. 2,0. 8,2. 0,20. 0,40. 0,80. O,.120. 0,150. Og/mL的標準溶液系列，按濃度由低到高依次進樣進行HPLC分離測定，以峰面積A對濃度C作圖，得一條直線，為三聚氰胺的標準曲線； (4)樣品定量測定 待測樣品經步驟(I)程序進行樣品預處 理後，在與繪製標準曲線完全相同的色譜條件下進行HPLC分析，待測樣液中三聚氰胺的響應值在標準曲線線性範圍內，超過線性範圍必須稀釋後再進樣分析。
全文摘要
本發明公開了一種鋯基親水作用色譜柱及其在測定原料乳及乳製品中三聚氰胺含量中的應用。通過用1％三氯乙酸-乙睛溶液超聲、振蕩、離心提取樣品中的三聚氰胺，然後用鋯基親水作用色譜對經0.2μm濾膜過濾的樣品液進行HPLC或LC-MS/MS分離分析。利用該色譜柱測定原料乳及乳製品中三聚氰胺含量，方法簡便、快速、靈敏、準確、重複性好，檢測成本低；該分離模式有利於樣品製備，使樣品預處理操作簡便、快速、回收率高、對分析測定無幹擾，樣品可以大批量處理，節省時間和測定成本；色譜柱使用壽命長。各項指標均優於GB/T22388-2008方法。本發明可廣泛用於原料乳、乳製品以及含乳製品中三聚氰胺的檢測。
文檔編號G01N30/02GK102914599SQ201210208230
公開日2013年2月6日 申請日期2012年6月21日 優先權日2012年6月21日
發明者敦惠娟, 魏雨, 薛樹科, 宋秀芹, 譚金標 申請人:河北師範大學