HBV治療應答的生物標誌物的製作方法

2023-08-10 07:13:31 1

本發明涉及可用於預測B型肝炎病毒(hbv)感染的患者對藥理學治療應答的方法。發明背景在世界範圍內，B型肝炎病毒(hbv)感染3.5-4億人；每年記錄一百萬人死於感染導致的肝硬化、肝功能衰竭和肝細胞癌。感染物B型肝炎病毒(hbv)是一種dna病毒，其可以經皮膚、性和圍產期而傳播。在亞洲感染的流行率(≥8％)實質性高於在歐洲和北美洲(90％暴露的那些人中的慢性感染(2008年8月修訂的whofactsheetno.204)。另外,25％的在兒童期期間變成慢性感染的成人死於與hbv有關的肝癌或肝硬化(whofactsheetno.204；2008年8月修正)。幹擾素α(ifnα)是抗病毒途徑的有效活化劑並且另外介導許多免疫調節功能(mulleru.,steinhoffu.,reisl.f.等人,functionalroleoftypeiandtypeiiinterferonsinantiviraldefense,science1994；264:1918-21)。在兩種大規模的關鍵性研究中闡明了在hbv的治療中,在180μg/星期的劑量下(聚乙二醇化的ifnα2a40kd,peg-ifn)的效力。一種研究是在hbeag陰性的患者(wv16241)中而另一種研究是在hbeag陽性的患者(wv16240)中。wv16241是在2001年6月和2003年8月之間進行的；把552位hbeag陰性的chb患者隨機分配到三個治療臂中的一個中:peg-ifn單一療法、peg-ifn加拉米夫定或單獨的拉米夫定，持續48個星期。在停止治療後24個星期評估的病毒學反應(被定義為hbvdna＝24個星期時，hbeag血清轉化和hbvdna＝24個星期的hbeag血清轉化和hbvdna＝24個星期的對於被hbv感染的hbe陽性患者的治療跟蹤(應答者對比非應答者)時，針對幹擾素治療的hbeag血清轉化和hbvdna＝24個星期的對治療的跟蹤(應答者對比非應答者)時，hbeag血清轉化和hbvdna＝24個星期的對被hbv感染的hbe陽性患者的治療跟蹤(應答者對比非應答者)時，針對幹擾素治療的hbeag血清轉化和hbvdna＝24個星期的對於治療的跟蹤(應答者對比非應答者)時，hbeag血清轉化和hbvdna＝24個星期的對被hbv感染的hbe陽性患者的治療跟蹤(應答者對比非應答者)時，針對幹擾素治療的hbeag血清轉化和hbvdna＝24個星期的對於治療的跟蹤(應答者對比非應答者)時，hbeag血清轉化和hbvdna＝24個星期的對被hbv感染的hbe陽性患者的治療跟蹤(應答者對比非應答者)時，針對幹擾素治療的hbeag血清轉化和hbvdna＝24個星期的對於治療的跟蹤(應答者對比非應答者)時，hbeag血清轉化和hbvdna＝24個星期的對被hbv感染的hbe陽性患者的治療跟蹤(應答者對比非應答者)時，針對幹擾素治療的hbeag血清轉化和hbvdna＝24個星期的對治療的跟蹤(應答者對比非應答者)時，hbeag血清轉化和hbvdna＝24個星期的跟蹤時，e-血清轉化或s-損失2.hbe陽性的患者:在>＝24個星期的跟蹤時，(e-血清轉化加hbvdna＝24個星期的跟蹤時，hbvdna＝24個星期的跟蹤時，e-血清轉化或s-損失以及如果hbe是陰性的(1和3)，在>＝24個星期的跟蹤時，hbvdna＝24個星期的跟蹤時，(e-血清轉化加hbvdna＝24個星期的跟蹤時，hbvdna＝24個星期的跟蹤時，s-損失。對於所有的終點和所有的標誌,針對關聯性存在的雙邊替換，測試了所述基因型和所述終點之間沒有關聯性的零假設。研究設計對於來自公司資助的臨床試驗數據和來自普通實踐護理的患者數據的累積綜合分析在進行中。在最終分析時，合併後的數據將會包含至多1500位患者，其已經採用pegasys治療了至少24個星期,有或沒有核苷酸/核苷類似物，並且伴隨可利用的24個星期的跟蹤數據。考慮包括下列試驗/患者來源●rgt(ml22266)●s-collate(mv22009)●son(mv22430)●開關(ml22265)●combo●(ml27928)●need●peg.be.liver的義大利群組●teerha教授(泰國):臨床實踐患者和一些後遺ph3患者●zhanghongfei教授(中國北京):臨床實踐患者和一些後遺ph3患者●xieyao教授(中國北京):臨床實踐患者●chenxinyue教授(中國北京):臨床實踐患者患有慢性B型肝炎的成年患者(年齡≥18的男性或女性患者)必須滿足下列關於研究登記的標準:●以前加入過roche研究並且採用peg-ifn±核苷類似物(拉米夫定或恩替卡韋或peg-ifn±核苷酸類似物(阿德福韋)治療過慢性B型肝炎至少24個星期，伴隨≥24個星期的治療後跟蹤或；●根據護理標準在關於慢性B型肝炎的一般實踐中採用peg-ifn治療並且符合目前產物特徵的概述(spc)/局部標記，其根據局部標記對peg-ifn療法沒有反向指徵已經採用peg-ifn治療至少24個星期並且在採集血液的時候具有≥24個星期可利用的治療後應答。●患者沒有被hav、hcv或hiv感染●患者應該具有下列可利用的病歷(來自歷史的/正在進行的研究資料庫或來自醫療實踐記錄):●人口統計學(例如年齡、性別、人種來源)●治療前的hbeag狀態、知道或不知道hbv基因型●通過pcr試驗定量的隨著時間變化的hbvdna，以iu/ml表示(例如基線、正在治療中:12和24個星期,治療後:24個星期)●定量的hbsag試驗(如果不能利用,則用定性的hbsag試驗)和隨著時間變化的抗hbs(例如基線、正在治療中:12和24個星期,治療後:24個星期)●隨著時間變化的血清alt(例如基線，正在治療中:12和24個星期,治療後:24個星期)注意所有的患者將已經接受了主動的方案。分析人群大多數患者將會來自中國。為了統計分析的目的,把四個分析人群定義如下。●pgx-fas是具有至少一種基因型的所有患者●pgx-gt是其基因數據通過了質量檢查的pgx-fas的亞組●pgx-cn是在它們與來自hapmap版本3(見下文)的chb和chd參比受試者聚類的意義上具有共同的遺傳背景的pgx-gt的亞組●pgx-non-cn是沒有落入pgx-cn內的剩餘的pgx-gt如hbepos或hbeneg分別地用於hbe陽性的和hbe陰性的子集那樣，附加另外的後綴，以及正如interim1、...interim3和最後的那樣，根據分析的階段附加另外的後綴。遺傳標誌gwas標誌組是illuminaomniexpressexome微陣列(www.illumina.com),由大於750,000個snp標誌和大於250,000個外顯子標誌組成。通過了質量檢查的標誌組被稱為gwas標誌組。數據分析的總體考慮gwas是不含假設的。具有未調整的p<5x10-8的標誌被認為在全基因組是顯著性的。為了統計能力起見，沒有對多個分析終點或多個分析輪進行調整。人口統計學特徵和基線特徵下列表1分開地顯示了在pgx-fas-interim1中的137位患者和在當前的pgx-fas-interim2中的653位患者的基線和人口統計學特徵的概要。注意到當前的臨時成員傾向於是年齡更大的,並且更不可能自我報告為『東方人』,然而相當多數目的人目前自我報告為『亞洲人』。表1:pgx-fas-interim1和pgx-fas-interim2的基線和人口統計學特徵遺傳數據的分析經由患者的質量檢查方法基於未過濾的gwas數據,在653位任何自我報告的種族(pgx-fas-interim2)的患者中評估了下列標準。●<30％雜合性全基因組●<5％丟失了基因型數據●報告的性別與x染色體數據一致●<30％基因型與另一個樣品一致結果所有的患者展示了<30％的雜合性全基因組。三位患者即4360、8529和8076具有5％或更多丟失的基因型。預期歸屬於5076和8554的兩個樣品是女性的,但是顯示了高水平的x染色體純合性。看到兩對即6454和9850以及9114和9180是第一級的關係對，因此針對每一對,具有較高水平的丟失的基因型數據的患者不在考慮範圍之內。以這種方式,有七位患者被排除在進一步分析之外；在下列的表2中提供了他們的詳情。其餘的646位患者被插入pgx-gt-interim2組中,其遺傳數據滿足上述標準。表2:遺傳數據未能通過質量檢查的七位患者；na代表丟失通過標誌的質量檢查方法針對丟失的數據，評估了標誌。具有大於5％丟失數據的那些標誌被排除在進一步分析之外。結果注意到所有的第一臨時數據以及第二臨時數據的一個子集源自於人omniexpressexome8v1b,而大多數的第二臨時數據源自於人omniexpressexome8v1.2a。為了進行綜合分析,把總體具有＝24個星期的跟蹤時，e-血清轉化或s-損失2.hbe陽性的患者:在>＝24個星期的跟蹤時，(e-血清轉化加hbvdna＝24個星期的跟蹤時，hbvdna＝24個星期的跟蹤時，e-血清轉化或s-損失以及如果hbe是陰性的(1和3)，在>＝24個星期的跟蹤時，hbvdna＝24個星期的跟蹤時，(e-血清轉化加hbvdna＝24個星期的跟蹤時，hbvdna＝24個星期的跟蹤時，s-損失注意到24位患者沒有hbe數據,因此,正如由終點1-5所定義的那樣,他們的應答不能被確定。此外,所述分析中的六個(每一個要在兩個假定的遺傳方式下進行)包含至少一個具有少於30位患者的組,因此不期望它們是能提供信息的。表4:在每一種計劃的分析中患者的數目協變量的評估為了確定全基因組關聯性分析的協變量,使用向後逐步回歸法測試了一系列變量與每一個終點的關聯性。根據所計劃的關聯性分析,用於終點1和2的受試者組是pgx-gt-hbe-pos-interim2(n＝391)；用於終點3的受試者組是pgx-gt-hbe-neg-interim2(n＝231)以及用於終點4、5和6的受試者組是pgx-gt-interim2的所有成員(n＝646)。基於akaike信息準則(aic)採取向後步驟。在完全模型中的協變量如下:年齡、性別、基線hbvdna、基線alt、hbv基因型、伴隨使用核苷酸/核苷類似物以及研究。對於終點4和5,包括了主要的祖先組分，這是由於把hbe-陽性的組和hbe-陰性的組這兩者與合理的應答者計數一起包括在內所致。為了改善對稱性，對基線hbv和基線alt這兩者都作了對數變換。表5-10顯示了針對終點1-6挑選的協變量。能夠看出基線hbvdna和基線alt每一個都是在六個模型中的5個中挑選的。表5:通過向後逐步回歸法針對終點1挑選的協變量表6:通過向後逐步回歸法針對終點2挑選的協變量表7:通過向後逐步回歸法針對終點3挑選的協變量表8:通過向後逐步回歸法針對終點4挑選的協變量表9:通過向後逐步回歸法針對終點5挑選的協變量表10:通過向後逐步回歸法針對終點6挑選的協變量單變量關聯性分析方法由於在當前的臨時分析中適度的組計數,如果標誌具有小於5％的頻度，則它們被排除在單點關聯性分析之外。以如下兩種方式將其餘的601,589個標誌編碼。首先根據加和性模型給它們編碼，通過小的等位基因數目的計數提供。其次根據優勢的遺傳模型,基於攜帶次要等位基因給它們編碼。有三個患者組和六個終點，進行了三十六輪關聯性分析，每一個處於兩種遺傳模式之下。使用多變量邏輯回歸法擬合了下列模型:終點＝截距+[協變量]+標誌如上面挑選的應用協變量(第8.4節)，。此外,在所有的分析中，針對研究應用調整,並且在對pgx-gt-interim2和pgx–非cn-interim2的子集的分析中，針對前兩種主要的祖先組分應用調整。使用t檢驗測定了每一個標誌的顯著性。針對每一種gwas分析計算了基因組對照λ並且檢查了qq圖,但是沒有發現明顯的檢驗-統計膨脹的證據(devlin和roeder1999)。最大λ是1.06。使用卡方檢驗，檢驗了在pgx-gt-interim2、pgx–非cn-interim2和pgx-cn-interim2中，所有的標誌從哈迪-溫伯格平衡的偏離(hwe)。使用所述結果來幫助解釋關聯性分析輸出。在下面列表的結果中,針對相關的、祖先確定的患者組，顯示了次要的等位基因頻度(maf)和hardy-weinberg結果這兩者。終點1的結果圖5和6分別地顯示了關於終點1的曼哈頓圖和qq圖。看到前四個qq圖循著45度線,這指示p-值分布與由於偶然所預期的近似。關於pgx-非cn-hbe-pos-interim2的qq圖都降至45度線以下,這指示減小的統計學能力；最後的兩種曼哈頓圖相應地是平坦的。注意到在這些最後的二種分析中僅僅有12位應答者。在表11-14中提供了具有p<10-5的標誌的詳情。在pgx-非cn-hbe-pos-interim2中,在任何一種遺傳模式下都沒有具有p<10-5的標誌。表11:在pgx-cn-hbe-pos-interim2加和性模型中關於終點1具有p<10-5的關聯性結果表12:在pgx-cn-hbe-pos-interim2優勢模型中，關於終點1的具有p<10-5的關聯性結果表13:在pgx-gt-hbe-pos-interim2加和性模型中，關於終點1的具有p<10-5的關聯性結果表14:在pgx-gt-hbe-pos-interim2優勢模型中，關於終點1的具有p<10-5的關聯性結果關於終點2的結果圖7和8分別地顯示了關於終點2的曼哈頓圖和qq圖。在表15-18中提供了具有p<10-5的標誌的詳情。在pgx-非cn-hbe-pos-interim2中,在任何一種遺傳模式下都沒有具有p<10-5的標誌，然而,在這個組中僅僅有11位應答者。看到qq圖向下彎曲而曼哈頓圖是中間凹下的。表15:在pgx-cn-hbe-pos-interim2加和性模型中，關於終點2的具有p<10-5的關聯性結果表16:在pgx-cn-hbe-pos-interim2優勢模型中，關於終點2的具有p<10-5的關聯性結果表17:在pgx-gt-hbe-pos-interim2加和性模型中，關於終點2的具有p<10-5的關聯性結果表18:在pgx-gt-hbe-pos-interim2優勢模型中，關於終點2的具有p<10-5的關聯性結果關於終點3的結果圖9和10分別地顯示了關於終點3的曼哈頓圖和qq圖。在表19-22中提供了具有p<10-5的標誌的詳情。在pgx-cn-hbe-neg-interim2中,在任何一種遺傳模式下都沒有標誌具有p<10-5，然而,在這個組中僅僅有16位應答者。看到qq圖向下彎曲而曼哈頓圖是中間凹下的。表19:在pgx-gt-hbe-neg-interim2加和性模型中，關於終點3的具有p<10-5的關聯性結果表20:在pgx-gt-hbe-neg-interim2優勢模型中，關於終點3的具有p<10-5的關聯性結果表21:在pgx-非cn-hbe-neg-interim2加和性模型中，關於終點3的具有p<10-5的關聯性結果表22:在pgx-非cn-hbe-neg-interim2優勢模型中，關於終點3的具有p<10-5的關聯性結果關於終點4的結果圖11和12分別地顯示了關於終點4的曼哈頓圖和qq圖。在表23-28中提供了具有p<10-5的標誌的詳情。表23:在pgx-cn-interim2加和性模型中，關於終點4的具有p<10-5的關聯性結果表24:在pgx-cn-interim2優勢模型中，關於終點4的具有p<10-5的關聯性結果表25:在pgx-gt-interim2加和性模型中，關於終點4的具有p<10-5的關聯性結果表26:在pgx-gt-interim2優勢模型中，關於終點4的具有p<10-5的關聯性結果表27:在pgx-非cn-interim2加和性模型中，關於終點4的具有p<10-5的關聯性結果表28:在pgx-非cn-interim2優勢模型中，關於終點4的具有p<10-5的關聯性結果關於終點5的結果圖13和14分別地顯示了關於終點5的曼哈頓圖和qq圖。在表29-33中提供了具有p<10-5的標誌的詳情。表29:在pgx-cn-interim2優勢模型中，關於終點5的具有p<10-5的關聯性結果表30:在pgx-gt-interim2加和性模型中，關於終點5的具有p<10-5的關聯性結果表31:在pgx-gt-interim2優勢模型中，關於終點5的具有p<10-5的關聯性結果表32:在pgx-非cn-interim2加和性模型中，關於終點5的具有p<10-5的關聯性結果表33:在pgx-非cn-interim2優勢模型中，關於終點5的具有p<10-5的關聯性結果關於終點6的結果圖15和16分別地顯示了關於終點6的曼哈頓圖和qq圖。在表34-37中提供了具有p<10-5的標誌的詳情。表34:在pgx-cn-interim2加和性模型中，關於終點6的具有p<10-5的關聯性結果表35:在pgx-cn-interim2優勢模型中，關於終點6的具有p<10-5的關聯性結果表36:在pgx-gt-interim2加和性模型中，關於終點6的具有p<10-5的關聯性結果表37:在pgx-非cn-interim2加和性模型中，關於終點6的具有p<10-5的關聯性結果在所述提示性水平(p<10-5)上涉及總共23種基因。在這些中,有五種彼此之間以及與鳥嘌呤緊密地相互作用(圖17)。所討論的基因是arhgef7(rho鳥嘌呤核苷酸交換因子7))、dock1(胞質分裂的奉獻者1)、hspg2(硫酸乙醯肝素蛋白多糖2)、synj1(突觸小泡磷酸酶1)和egfr(表皮生長因子)。注意到在B型肝炎的治療中，研究中的鳥嘌呤核苷類似物(rivkin,2007)和egfr已經顯示與B型肝炎病毒相互作用(menzo等人,1993)。軟體使用常規書寫的perlscripts(wall等人,1996)來重新格式化數據、選擇用於祖先分析的標誌以及產生表格。使用plink版本1.07(purcell等人,2007)來進行遺傳qc分析,來合併研究數據與hapmap數據,以及用於關聯性分析。使用eigensoft4.0(patterson等人,2006；price等人,2006)用於pca。使用r版本2.15.2(rcoreteam,2012)用於圖形的產生。參考文獻devlinb,roederk(1999).genomiccontrolforassociationstudies.biometrics55(4):997-1004.dienstagejl(2008).hepatitisbvirusinfection.nengljmed359:1486-1500.duntemangh(1989).principalcomponentsanalysis.sageuniversitypapers:quantitativeapplicationsinthesocialsciences.serieseditor:mslewis-beck.sagepublicationsinc.ged,fellayj,thompsonaj,simonjs,shiannakv,urbantj,heinzenel,qiup,bertelsenah,muiraj,sulkowskim,mchutchisonjg,goldsteindb(2009).geneticvariationinil28bpredictshepatitisctreatment-inducedviralclearance.nature161:399-401.guox,zhangy,lijetal(2011).stronginfluenceofhumanleukocyteantigen(hla)-dpgenevariantsondevelopmentofpersistentchronichepatitisbviruscarriesinthehanchinesepopulation.hepatology53:422-8.theinternationalhapmapconsortium(2003).theinternationalhapmapproject.nature426:789-796.theinternationalhapmapconsortium(2005).ahaplotypemapofthehumangenome.nature437:1299-1320.theinternationalhapmapconsortium(2007).asecondgenerationhumanhaplotypemapofover3.1millionsnps.nature449:851-861.kamataniy,wattanapokayakitx,ochihetal(2009).agenome-wideassociationstudyidentifiesvariantsinthehla-dplocusassociatedwithchronichepatitisbinasians.natgenet41:591-595.menzos,clementim,alfanie,bagnarellip,iacovaccis,manzina,ddandrim,natolig,levrerom,carlonig(1993).trans-activationofepidermalgrowthfactorreceptorgenebythehepatitisbvirusx-geneproduct.virology196(2):878-82.mulleru,steinhoffu,reislf,etal(1994).functionalroleoftypeiandtypeiiinterferonsinantiviraldefence.science264:1918-21.pattersonn,priceal,reichd.populationstructureandeigenanalysis(2006).plosgenet.2:e190.priceal,pattersonnj,plengerm,weinblattme,shadickna,reichd(2006).principalcomponentsanalysiscorrectsforstratificationingenome-wideassociationstudies.natgenet.38:904.purcells,nealeb,todd-brownk,thomasl,ferreiramar,benderd,mallerj,sklarp,debakkerpiw,dalymj,shampc(2007).plink:atoolsetforwhole-genomeassociationandpopulation-basedlinkageanalysis.amjhumgenet81(3):559-575.rcoreteam(2012).r:alanguageandenvironmentforstatisticalcomputing.rfoundationforstatisticalcomputing,vienna,austria.isbn3-900051-07-0,urlhttp://www.r-project.org/)rivkina(2007).entecavir:anewnucleosideanalogueforthetreatmentofchronichepatitisb.drugstoday(barc)43(4):201-20.tanakay,nishidan,sugiyamam,kurosakim,matsuurak,sakamoton,nakagawam,korenagam,hinok,higes,itoy,mitae,,tanakae,mochidas,murawakiy,hondam,s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