一種用改良stela法測細胞中最短端粒長度的方法

2023-06-12 08:40:56 2

專利名稱：一種用改良stela法測細胞中最短端粒長度的方法
技術領域：
本發明涉及一種用改良STELA法測細胞中最短端粒長度的方法。
背景技術：
端粒(Telomere)是一段DNA重複序列，位於染色體末端，可以保持染色體的完整性。1990年，Harley等證實端粒的長度可以隨著細胞分裂次數的增多而逐漸變短。這一發現在端粒和細胞衰老之間建立了緊密的聯繫。端粒重複序列的長度可能起著一種分子鐘(molecular clock)的作用。不同年齡的人的體細胞的壽命明顯不同,其端粒的長度也不相同。是隨著年齡的增長而縮短。來自新生兒的體細胞可在體外傳代培養80—90代，來自70歲老人的體細胞在體外只能傳代培養20 30代，而且端粒的重複序列長度也縮短很多。端粒酶(Telomerase)是細胞中負責端粒延長的一種酶,是基本的核蛋白逆轉錄酶，可將端粒DNA加至真核細胞染色體末端。端粒在不同物種細胞中對於保持染色體穩定性和細胞活性有重要作用，端粒酶能延長縮短的端粒(縮短的端粒其細胞複製能力受限)，從而增強體外細胞的增殖能力。但是，在正常人體細胞中，端粒酶的活性受到相當嚴密的調控。實驗證明，體細胞裡沒有端粒酶的活性，所以體細胞每分裂一次，端粒也就縮短一些。隨著細胞不斷地進行分裂，端粒的長度將越來越短，當達到一個臨界長度時，細胞染色體會失去穩定性，使細胞不能再進行分裂而進入凋亡(apoptosis)。端粒的長度決定了細胞的壽命，因此可用丟失的端粒重複序列的長度來推測細胞有絲分裂的次數，所以端粒被稱為分子鐘或有絲分裂鍾(mitotic clock)。端粒除了涉及到染色體穩定性,細胞的衰老和死亡外,還與腫瘤的發生密切相關。在人體內的各種細胞中，生殖細胞和幹細胞染色體的末端比體細胞染色體的末端長出幾千個鹼基對，並且在這兩類細胞裡能檢測到端粒酶的活性。除此之外，其他所有體細胞裡都未測得端粒酶的活性。惟一的例外是來源於體細胞的惡性腫瘤細胞卻又重新出現了端粒酶活性，發揮其合成端粒重複序列的功能，以補償正常的端粒序列丟失，使端粒的重複序列不會達到導致細胞死亡的臨界長度，從而獲得細胞的「永生性」(immortality)。這樣，惡性腫瘤細胞在體內或體外都能無限制地分裂增殖。上文提到的端粒長度縮短指的是所有染色體末端端粒的平均長度。近年來，很多實驗觀察開始質疑端粒的平均長度與衰老之間的聯繫。一些研究小組提出了於端粒相關的細胞衰老是由單一或某幾個短端粒引起的觀點。這一觀點的正確性也被越來越多的實驗數據所證明。目前，研究端粒長度主要是應用TRF法(mean length of telomere restrictionfragments)。但是，這個方法測量的是細胞內端粒的平均長度，而無法測量其中短端粒所佔的比例，因此有很大的局限性。單個端粒長度分析(STELA, single telomere length analysis)是在單個染色體水平上基於PCR的端粒測量方法。第I步是「telorette」 (在與端粒G懸突不配對的20個核苷酸後有7個同源的TTAGGG接頭)的退火.第2步是將「telorette」連接到富C鏈5末端.此後用識別telorette尾巴的teltail引物同亞端粒上遊引物進行PCR擴增。在研究這個區域的多態現象時，上遊引物可以是特異的等位基因。STELA最先被用於分析人類X染色體短臂。最近對秀麗隱杆線蟲的端粒和沃納症候群的成纖維細胞的端粒的研究表明，在單個染色體水平上STELA的分析有很高的可靠性。STELA的PCR擴增具有高度的端粒特異性，用STELA測量人類成纖維細胞的XpYp端粒長度始終比TRF的平均值小，且這兩者成線性關係，說明STELA沒有包括亞端粒長度。另外，有一些手段可以比較精確的研究染色體中短端粒的情況，例如基於螢光原位雜交(Q-FISH)的技術。但是這些技術手段都或多或少存在一些不足之處，無法作為高效精確地研究或檢測最短端粒的合適手段。

發明內容
發明目的
本專利涉及一種改良的STELA法，可以有效快速地檢測研究細胞染色體短端粒長度和所佔的比例。技術方案
一種用改良STELA法測細胞中最短端粒長度的方法，其特徵在於按步驟實現
A、限制性內切酶消化細胞中提取的gDNA經過MseI和NdeI兩種限制性內切酶酶切(摩爾比I :1)；
B、Linker寡核苷酸連接Linker通過互補配對連接到各個gDNA片斷的5』-TA-3』 ；其中 linker 為 11+2-mer oligo 和 42-mer oligo ；ll+2-mer oligo 的序列為 5，_TAC CCGCGT CCG C-3，；42-mer oligo 的序列為 5，-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG GCG TGGTGC GGA CGC GGG-3 ；
C、Telorette片斷的連接telorette被連接到端粒的5，端；其中Telorette序列如下，可任選擇其中一個序列
5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CCT AAC-3，；
5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCT AAC CCT-3，；
5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CTA ACC-3』 ；
5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC TAA CCC-3』 ；
5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA ACC CTA-3』 ；
5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA CCC TAA-3，。D、PCR 擴增端粒片段，其中引物為 5，-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA-3，，5，-TGCTCC GTG CAT CTG GCA TC-3，-標記物。作為一種優化方式，其步驟為
A、培養人皮膚成纖維細胞BJ和人肺成纖維細胞MR-90，並分離上述兩種細胞的生長期細胞和衰老細胞的gDNA ；
B、取步驟A中的gDNAI ug,加入Msel/Ndel雙酶切(摩爾比I :1),同時加入IxNEBuf fer2 和 Ix BSA, 37 1反應過夜；
C、10ng 消化後的 gDNA 片斷於 65 °C加入 50 uM 42-mer oligo 和 50 uM ll+2-meroligo，反應體積為7 ul ;之後將反應溫度由65 °〇於I h內降至16 V ;加入20 U T4 DNA連接酶，Ix NEBuffer2和Ix ATP,於16 1反應過夜；其中 11+2-mer oligo 的序列為 5』 -TAC CCG CGT CCG C-3』 ；
42-mer oligo 的序列為 5，-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG GCG TGG TGC GGA CGCGGG-3 ；
D、在步驟(C)中反應體系中補加20 U T4 DNA連接酶和I(T3 uM Telorette，並補充相應的Ix NEBuffer2和Ix ATP，使反應體積達到25 ul，35 1反應過夜，然後於65 °C反應20 min,滅活T4 DNA連接酶,獲得DNA ;其中Telorette序列如下,可任選擇其中一個序列5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CCT AAC-3，；
5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCT AAC CCT-3，；
5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CTA ACC-3』 ；
5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC TAA CCC-3』 ；
5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA ACC CTA-3』 ；
5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA CCC TAA-3，。E、PCR反應體積為 12 ul，模板DNA 50 pg(步驟(3)獲得)，Ix FailSafe PCR PreMixH, 0. I uM teltail 引物和 Adaptor 引物，I. 25 U FailSafe enzyme ;PCR 條件為
權利要求
1.一種用改良STELA法測細胞中最短端粒長度的方法，其特徵在於按步驟實現 A、限制性內切酶消化細胞中提取的gDNA經過MseI和NdeI兩種限制性內切酶酶切摩爾比1:1; B、Linker寡核苷酸連接Linker通過互補配對連接到各個gDNA片斷的5』-TA-3』 ；其中 linker 為 11+2-mer oligo 和 42-mer oligo ;ll+2_mer oligo 的序列為 5，_TAC CCGCGT CCG C-3，；42-mer oligo 的序列為 5，-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG GCG TGGTGC GGA CGC GGG-3 ； C、Telorette片斷的連接telorette被連接到端粒的5，端；其中Telorette序列如下，可任選擇其中ー個序列5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CCT AAC-3』 ；5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCT AAC CCT-3』 ；5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CTA ACC-3』 ；5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC TAA CCC-3』 ；5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA ACC CTA-3』 ；5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA CCC TAA-3』 ； D、PCR擴增端粒片段，其中引物為 5』-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA-3，，5，-TGC TCCGTG CAT CTG GCA TC-3，-標記物。
2.根據權利要求I所述的ー種用改良STELA法測細胞中最短端粒長度的方法，其特徵在於按步驟實現A、提取gDNA ； B、取步驟A中的gDNAI ug,加入Msel/Ndel摩爾比1:1雙酶切，同時加入IxNEBuf fer2 和 Ix BSA, 37 °C 反應過夜； C、10ng 消化後的 gDNA 片斷於 65 °C加入 50 uM 42-mer oligo 和 50 uM ll+2-meroligo，反應體積為7 ul ;之後將反應溫度由65で於I h內降至16 V ;加入20 U T4 DNA連接酶，Ix NEBuffer2和Ix ATP,於16 °C反應過夜； 其中 11+2-mer oligo 的序列為 5，-TAC CCG CGT CCG C-3，；42-mer oligo 的序列為 5，-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG GCG TGG TGC GGA CGCGGG-3 ； D、在步驟(C)中反應體系中補加20U T4 DNA連接酶和I(T3 uM Telorette，並補充相應的Ix NEBuffer2和Ix ATP，使反應體積達到25 ul，35で反應過夜，然後於65で反應20 min,滅活T4 DNA連接酶,獲得DNA ;其中Telorette序列如下,可任選擇其中ー個序列5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CCT AAC-3』 ；5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCT AAC CCT-3』 ；5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CTA ACC-3』 ；5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC TAA CCC-3』 ；5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA ACC CTA-3』 ；5』 -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA CCC TAA-3』 ； E、PCR反應體積為 12 ul，模板 DNA 50 pg (步驟(3)獲得)，1x FailSafe PCR PreMixH, 0.1uM teltail 引物和 Adaptor 引物，1.25 U FailSafe enzyme ;PCR 條件為
3.根據權利要求2所述的ー種用改良STELA法測細胞中最短端粒長度的方法，其特徵在於步驟(E)中所述的標記物包括放射性標記物和非放射性標記物，放射性標記物包括同位素32P或35S ;非放射性標記物包括生物素、地高辛、異硫氰酸螢光素、羅丹明、金或銀。
4.根據權利要求2所述的ー種用改良STELA法測細胞中最短端粒長度的方法，其特徵在於其中步驟(A)中gDNA來自於人皮膚成纖維細胞BJ和人肺成纖維細胞MR-90的生長期細胞和衰老細胞的gDNA。
5.根據權利要求2所述的ー種用改良STELA法測細胞中最短端粒長度的方法，其特徵在於步驟(E)獲得PCR結束後，以免疫印跡法檢測。
全文摘要
本發明涉及一種用改良STELA法測細胞中最短端粒長度的方法。本發明涉及一種改良的STELA法，可以有效快速地檢測研究細胞染色體短端粒長度和所佔的比例。該改良STELA法與傳統的STELA法相比，在連接telorette之前多了一步連接反應。其可以檢測最短端粒長度，而現有技術只能檢測平均端粒長度，擴大應用範圍，同時更加準確可以簡便，快速，直觀的測量樣品中最短端粒的長度以及其所佔的比例。
文檔編號C12Q1/68GK102618633SQ20121002370
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月3日 優先權日2012年2月3日
發明者葉亞東, 葉汝章, 夏琰, 張娟, 朱文華, 楊紫俊, 滕凌, 潘鸝, 胡芳, 路易斯伊格納羅, 霍世元 申請人:常州亞當生物技術有限公司