一種用於研究醋糟基質中微生物群落結構的總dna提取方法
2023-06-01 09:04:06 1
專利名稱：一種用於研究醋糟基質中微生物群落結構的總dna提取方法
技術領域：
本發明屬於農業微生物與生物技術領域，具體涉及一種用於研究醋糟無土栽培基質中微生物群落結構的總DNA提取方法。
背景技術：
微生物是無土栽培基質中非常重要的組成部分，因而對無土栽培基質中微生物的研究是無土栽培基質研究領域內一個重要的方向，對於促進無土基質栽培的發展具有十分重要的意義。常用的用於微生物群落研究的方法有培養分離法、磷脂脂肪酸法和BIOLOG板法等，但是上述方法都有各自的缺陷。培養分離法只適合可培養微生物的研究，由於環境中的微生物99%以上都是不可培養的，因而傳統培養分離法大大限制了對微生物資源的研究。磷脂脂肪酸法所依賴的針對個別脂肪酸標識物的細緻描述也是源於少數可被分離的微生物的純培養。因此，在研究無法培養的菌群佔絕大多數的微生物群落時，磷脂脂肪酸法也存在一定的局限性。另外，由於不同菌種相同脂肪酸的相互疊加，磷脂脂肪酸法也難於在種水平上辯明微生物群落的確切組成。不同的微生物對同一 C源的利用能力不同，微生物對不同單一 C源的代謝指紋差異並不能簡單地歸納為微生物群落數量和結構的差異，BIOLOG板法也不能準確的反應出環境中的微生物群落結構的差異。隨著分子生物學的發展，利用16S (18S) rRNA/rDNA序列分析技術，研究者可以在不對微生物進行純培養的情況下對環境中的微生物進行全面的研究，包括微生物的分離鑑定、群落結構和功能的分析。而利用分子生物學的手段對環境中的微生物進行研究，獲得高產量和高質量的DNA是應 用16S (18S) rRNA/rDNA序列分析技術進行環境微生物分子生態學研究的基礎，常用的用於土壤和堆肥DNA提取的方法有液氮研磨法，SDS-反覆凍融法、玻璃珠吸附法等。醋糟基質是以制醋過程中產生的殘渣醋糟為原料，通過堆制發酵形成的新型園藝有機基質，作為草炭的替代基質，醋糟基質在育苗和栽培中已經得到廣泛使用，並投入了商品化生產。但目前對醋糟無土栽培基質中微生物群落結構的變化尚不清楚。利用16S (18S)rRNA/rDNA序列分析技術可解決這方面的問題。醋糟基質作為一種堆肥產品，在堆制發酵的過程中會產生大量的腐殖酸，這些腐殖酸會對DNA的提取及PCR擴增產生強烈的影響。對腐殖酸的去除，常用的方法有硫酸鋁捕獲腐殖酸法、氯化銫密度梯度離心法，高效分子量排阻層析，試劑盒純化法。這些純化處理方法增加了複雜性，且費時費力。因而尋求一種有效的獲取高質量的DNA提取方法是利用分子生物學手段研究醋糟基質栽培過程中微生物群落結構變化所急需解決的問題。
發明內容
本發明針對醋糟基質含有大量腐殖酸這一特點，對傳統的土壤微生物基因組DNA提取方法進行了改進，通過在DNA提取buffer中添加O. 5%的β -巰基乙醇和O. 5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對醋糟基質中的腐殖酸和酚類物質進行了初步去除。用氯仿異戊醇(24: 1/v: V)抽提蛋白後，用2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對DNA中的腐殖酸和酚類物質再次進行去除。從而建立了一種高效、快速的可用於16S (18S) rDNA PCR擴增的高質量的醋糟基質總DNA提取方法。為利用分子生物學的手段研究醋糟基質中微生物的群落結構奠定了基礎。本發明的技術方案如下
一種用於研究醋糟基質中微生物群落結構的總DNA提取方法，其特徵在於按照下述步驟進行
(1)先在醋糟基質中加入DNA提取緩衝液和蛋白酶K，振搖，使醋糟基質中的微生物充分懸浮在DNA提取緩衝液中，優選DNA提取緩衝液的配方為10 mM Tris-Hcl (pH 8. O)，100mM Sodium EDTA(pH 8·O)，100 mM Sodium phosphate (pH 8.0)，1. 5 M Nacl，1% CTAB,
0.5% β-巰基乙醇和0.5% PVP，優選蛋白酶K用量為蛋白酶K的濃度為20 mg/ ml，加入量為 12. 5 μ I ；
(2)將步驟(I)製得的懸浮液用十二烷基磺酸鈉裂解醋糟基質中的微生物，離心後取上清，優選十二烷基磺酸鈉的質量分數為20% ；
(3)加入與步驟(2)取得的上清液等體積的氯仿-異戊醇混合液抽提蛋白，其中氯仿異戊醇體積比=24:1，離心後取上清；
(4)加入與步驟(3)取得的上清液等體積的聚乙烯吡咯烷酮水溶液，去除腐殖酸和酚類物質，離心後取上清，優選聚乙烯聚吡咯烷酮的質量分數為2% ；
(5)將裝有步驟(4)中取得 的上清液的離心管上下輕微的搖動，直至離心管中可見絮狀物質，將離心管置於-20 °C沉澱20 min ；
(6)用體積分數為75%的乙醇沉澱DNA後，用去離子無菌水溶解DNA，並用RNA酶去除DNA中的RNA。上述用於研究醋糟無土栽培基質中微生物群落結構的總DNA提取方法優選技術方案如下
(I)稱取0.5 g醋糟基質於10 ml無菌的離心管中，在離心管中加入2. 5 ml提取緩衝液，優選配方為10 mM Tris-Hcl pH 8. 0,100 mM Sodium EDTA pH 8. 0,100 mM Sodiumphosphate pH 8. 0，1. 5 M Nac1,1% CTAB,0. 5% β-巰基乙醇，0.5% PVP, 12. 5 μ I 蛋白酶K(20 mg/ ml)。(2)將上述離心管於37°C, 225 rpm的搖床搖30 min。(3)將從搖床取出的離心管中加入250 μ I質量分數為20%的十二烷基磺酸鈉(SDS)，用渦旋儀渦旋10 s後，將離心管於65°C水浴lh，期間每15-20 min搖動一次。水浴後將離心管於4°C、10 000 g的離心機中離心10 min，取上清於新的離心管中。(4)向沉澱中加入1. 25 ml提取緩衝液及125 μ I質量分數為20%的十二烷基磺酸鈉(SDS)，用渦旋儀渦旋10 s,65 °C水浴30 min後，4 V、10 000 g離心10 min，取上清於步驟(3)的新管中。將兩次提取的上清液混合到一起。(5)在混合後的上清液中加入等體積的氯仿異戊醇(24: l/ν: V)，用渦旋儀渦旋30 s充分混勻後，4 0CUO 000 g離心10 min。取上清於新管。(6)重複步驟(5) I次。
(7)在步驟(6)取得的上清液中加入等體積的質量分數為2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP), 4 °C > 10 000 g離心10 min,取上清於新管。(8)在上清液中加入等體積預冷的異丙醇，將離心管輕微的上下搖動，直至離心管中可見絮狀物質，將離心管置於-20 °C沉澱10 min。(9)取出離心管後12 000 g離心10 min，棄上清，在離心管中加入體積分數為75%的乙醇I ml,洗漆10 min後，12 000 g離心10 min,棄上清,得到DNA沉澱。(10)重複步驟(9) I次。(11)將沉澱冷凍乾燥30 min後，加入120 μ I去離子無菌水和20 μ I核糖核酸酶(RNA酶)溶解DNA沉澱。本發明的優點
本發明在DNA提取過程中，不需用液氮研磨樣品，不需對樣品進行反覆凍融，縮短了DNA提取時間。在提取過程中，DNA提取buffer中添加O. 5%的β -巰基乙醇和O. 5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對醋糟基質中的腐殖酸和酚類物質進行了初步去除。在DNA用氯仿異戊醇(24: 1/ν: V)抽提蛋白後，用2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對DNA中的腐殖酸和酚類物質再次進行了去除，從而獲得了高質量的，無需再用DNA試劑盒進行純化的，可直接用於16S (18S) rRNA/rDNA序列分析的DNA。建立了一套可用於醋糟基質中微生物分子生態學研究的快速、高質的DNA提取方法。
圖1本發明方法提取醋糟基質總DNA電泳圖，其中1-6為醋糟樣品，M為Markerλ DNA/Hind III。圖2以本發明方法提取醋糟基質總DNA為模板進行16S rDNA PCR擴增電泳圖，其中 1-24 為醋糟 16S rDNA PCR 擴增的 PCR 產物，M 為 Marker DL 2000。圖3以本發明方法提取醋糟基質總DNA為模板進行18S rDNA PCR擴增電泳圖，其中 1-24 為醋糟 18S rDNA PCR 擴增的 PCR 產物，M 為 Marker DL 2000。
具體實施例方式以下通過實施例說明本發明的具體步驟，但不受實施例限制。在本發明中所使用的術語，除非另有說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下面結合具體實施例並參照數據進一步詳細描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的範圍。在以下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。實施例1、醋糟基質中總DNA的提取
(I)稱取O. 5 g醋糟基質於10 ml無菌的離心管中，在離心管中加入2. 5 ml提取buffer再加12. 5 4 1蛋白酶1((20 mg/ ml)。其中DNA提取buffer的配方為10 mMTris-Hcl(pH 8. O), 100 mM Sodium EDTA( pH 8. O), 100 mM Sodium phosphate (pH 8.0),1.5 M Nacl，1% CTAB，0. 5% β -巰基乙醇，0. 5% PVP。(2)將上述離心管於37°C, 225 rpm的搖床搖30 min。
(3)將從搖床取出的離心管中加入250 μ I質量分數為20%的SDS，用渦旋儀渦旋10 S混勻後，將離心管於65°C水浴lh，期間每15-20 min搖動一次。水浴後將離心管於4°C, 10 000 g離心10 min,取上清於新的離心管中。(4)向沉澱中再加入1. 25 ml提取buffer及125 μ I質量分數為20%的SDS。用渦旋儀渦旋10 s混勻，65°C水浴30 min後，4 °C, 10 000 g離心10 min，取上清於步驟
(3)的新管中。將兩次提取的上清液混合到一起。(5)在混合後的上清液中加入等體積的氯仿異戊醇(24: Ι/v: V)，用渦旋儀渦旋30 s充分混勻後，於4°C, 10 000 g離心10 min。取上清於新管。(6)重複步驟(5) I次。(7)在步驟(6)取得的上清液中加入等體積的質量分數為2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP),4 °C, 10 000 g離心10 min,取上清於新管。(8)在上清液中加入等體積預冷的異丙醇，將離心管輕微的上下搖動，直至離心管中出現絮狀物質，將離心管置於-20 °C沉澱20 min。(9) 12000 g離心10 min，棄上清，在離心管中加入體積分數為75%的乙醇I ml，洗漆10 min後，12000 g離心10 min,棄上清,得到DNA沉澱。(10)重複步驟(9) I次。(11)將沉澱冷凍乾燥30 min後，加入120 μ I去離子無菌水和20 μ I核糖核酸酶(RNA酶)溶解沉澱。實施例2、DNA的電泳檢測和PCR擴增
將實施例1得到的總DNA，用質量分數為1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，所用的分子量標記(Marker )為λ DNA/Hind III，電泳緩衝液為I X TAE，所用電壓為10 V/cm，電泳30min後，將瓊脂糖凝膠在凝聚成像系統中拍照，得到DNA的電泳圖(如圖1所示)。DNA條帶
單一，沒有拖尾。用細菌的16S rDNA和真菌的18S rDNA進行PCR擴增和產物檢測。其具體步驟如下
(I)選擇細菌 16S rDNA 擴增的常用引物對 F341 :5』- CCT ACG GGA GGC AGC AG -3』(SEQ ID No. 1)，907R :5，-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3，(SEQ ID No. 2)，作為擴增引物。
50μ I PCR 反應體系為10 X PCR Buffer (含 mg2+ )溶液 5 μ l,dNTP 10 mM Ιμ ，上遊引物10 PM I μ 1，下遊引物10 PM I 「1，了&9酶5~4 1 O. 5 yl，DNA模板I μ ，無菌/K 40. 5 μ I。PCR 運行程序預變性94 °C，5 min ;變性94 °C,45 s ;退火56 °C,40 S，延伸72 °C,40 s ;共35個循環；總延伸72 V, 7 min。將擴增的PCR產物用質量分數為2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，所用的分子量標記(Marker)為DL2000，電泳緩衝液為I X TAE，所用電壓為10 V/cm， 電泳30 min後，將瓊脂糖凝膠在凝聚成像系統中拍照，得到PCR產物電泳圖如圖2所示。(2)選擇真菌 18S rDNA 擴增的常用引物對 NSl :5』-GTA GTC ATA TGC TTG TCTC-3』 (SEQ ID No. 3), FUNG 5' -ATT CCC CGT TAC CCG TTG -3』 (SEQ ID No. 4)，作為擴增的引物。50 μ I 的反應體系10 X PCR Buffer (含mg2+)溶液5 μ l,dNTP 10 mM 1μ I,上遊引物10 ρΜ I μ 1，下遊引物10 ρΜ I 「1，了&9酶5~4 1 O. 5 yl，DNA模板I μ ，無菌水 40. 5 μ I。PCR 運行程序預變性94 °C，5 min ;變性94 °C, 30 s ;退火57 °C,60S，;延伸72 °C,60 S，共 35 個循環；總延伸72 °C, 10 min。將擴增出的PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，所用的分子量標記(Marker)為DL2000，電泳緩衝液為1XTAE，所用電壓為10 V/cm,電泳30 min後，將瓊脂糖凝膠在凝聚成像系統中拍照，得到PCR產物電泳圖如圖3所示。從圖2和圖3可見，用16S rDNA和18S rDNA均能成功的從醋糟基質中提取的DNA中擴增出各自的目的條帶，且條帶明亮、單一，擴增特異性強，條帶長度分別為500多bp和300多bp。這充分說明本發明非常適合用於從醋糟基質中獲得高質量的DNA，可供研究者用分子生物學手段研究醋糟基質中的微生物群落 結構。序列表
Organization Applicant
Street :江蘇鎮江市京口區學府路301號
City :鎮江市
State :江蘇省
Country :中國
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Application Project
〈120〉Title : 一種用於研究醋糟基質中微生物群落結構的總DNA提取方法〈130〉AppFileReference :
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Sequence
〈210〉SEQ ID No.1〈213 > OrganismName :
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CCT ACG GGA GGC AGC AG〈212〉 Type : DNA〈211〉 Length : 17
SequenceName: F341 SequenceDescription :
Sequence
〈210〉SEQ ID No. 2〈213 > OrganismName :
PreSequenceString :
CCGTCAATTCCTTTGAGTTT〈212〉 Type : DNA
權利要求
1.一種用於研究醋糟基質中微生物群落結構的總DNA提取方法，其特徵在於按照下述步驟進行(1)先在醋糟基質中加入DNA提取緩衝液，並加入蛋白酶K，振搖，使醋糟基質中的微生物充分懸浮在DNA提取緩衝液中；(2)將步驟(I)製得的懸浮液用十二烷基磺酸鈉裂解醋糟基質中的微生物，離心後取上清；(3)加入與步驟(2)取得的上清液等體積的氯仿-異戊醇混合液抽提蛋白，其中氯仿 異戊醇體積比為24: 1，離心後取上清；(4)加入與步驟(3)取得的上清液等體積的聚乙烯吡咯烷酮水溶液，去除腐殖酸和酚類物質，離心後取上清；(5)將裝有步驟(4)中取得的上清液的離心管上下輕微的搖動，直至離心管中可見絮狀物質，將離心管置於-20 °C沉澱20 min ；(6)用體積分數為75%的乙醇沉澱DNA後，用去離子無菌水溶解DNA，並用RNA酶去除DNA中的RNA。
2.根據權利要求1所述的提取方法，其特徵在於所述DNA提取緩衝液的配方為10 mM Tris-Hcl (pH 8.0),100 mM Sodium EDTA(pH 8.0),100 mM Sodium phosphate (pH8.0)，1. 5 M Nacl，1% CTAB，0. 5% β -巰基乙醇和 0. 5% PVP。
3.根據權利要求1所述的提取方法，其特徵在於所述蛋白酶K的濃度為20mg/ ml, 加入量為12. 5 μ I。
4.根據權利要求1所述的提取方，其特徵在於所述十二烷基磺酸鈉的質量分數為20%。
5.根據權利要求1所述的提取方法，其特徵在於所述聚乙烯聚吡咯烷酮的質量分數為2%。
全文摘要
本發明涉及到一種用於研究醋糟基質中微生物群落結構的總DNA提取方法。本發明先在醋糟基質中加入含有0.5%的β-巰基乙醇和0.5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的DNA提取緩衝液，並加入蛋白酶K，放置37℃搖床搖30min，使基質中的微生物充分溶解在DNA提取緩衝液中後，用質量分數為20%的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液裂解醋糟基質中的微生物細胞，用氯仿:異戊醇(24:1)抽提去除蛋白，用質量分數為2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)去除腐殖酸、酚類物質後，用預冷的異丙醇沉澱，最後得到高質量的可直接用於PCR擴增的DNA。
文檔編號C12N15/10GK103045585SQ20121057128
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月26日 優先權日2012年12月26日
發明者李萍萍, 林英, 趙青松, 杜道林, 王紀章 申請人:江蘇大學