酯化反應法
2023-06-01 07:06:46
酯化反應法
【專利摘要】本發明涉及脂肪酸進料在使用微生物酶的生物柴油製備中的使用。
【專利說明】酯化反應法
[0001]對序列表的引用
[0002]本申請包含一個計算機可讀形式的序列表,其通過引用的方式合併入本文。
【技術領域】
[0003]本發明涉及一種在生物柴油的製備中應用脂肪酸進料的新方法。
【背景技術】
[0004]由於日益增長的對可再生能源尤其是生物燃料的興趣，已開發出多種方法來製備脂肪酸與低碳醇的酯，這些酯也被稱為「生物柴油」。生物柴油可以以兩步酶促法進行製備，其中在第一脂肪酶催化的工序步驟(「酯交換步驟」)中，甘油三酯原料與低碳醇(例如甲醇或乙醇)反應，形成脂肪酸甲酯、游離脂肪酸和游離甘油。將脂肪酸甲酯與游離脂肪酸分離，然後在第二脂肪酶催化的工序步驟(「酯化步驟」)中與低碳醇(如例甲醇或乙醇)反應，形成具有非常低游離脂肪酸含量的脂肪酸甲酯組合物。
[0005]生物柴油的規格對於例如金屬離子和磷脂的含量日益嚴格。為滿足這些規格，需要蒸餾生物柴油產品。蒸餾通常作為酯化工序之後的最後工序步驟而進行。然而，還需要製備生物柴油的其他方法。
【發明內容】
[0006]令人驚訝的是，已經發現在上述兩步酶促生物柴油方法中，在酯化工序步驟前進行蒸餾是有利的。蒸餾所得的高純度原料確保酶在第二脂肪酶催化酯化步驟中的較長壽命，並促使例如在填充床柱中的固定化酶的使用。在傳統的生物柴油方法中，在填充床柱中使用固定化酶是不切實際的 ，因為柱會因原料中的雜質而堵塞。
[0007]因此，本發明提供一種由脂肪酸原料製備脂肪酸烷基酯(FAAE)的方法，包括以下步驟:(a)提供含有脂肪酸進料、低碳醇與水的反應混合物I ;(b)使反應混合物I與脂肪酶接觸；(c)使反應混合物I反應，形成脂肪酸烷基酯；(d)從反應混合物I的FAAE/FFA (游離脂肪酸)相中分離水/甘油相；(e)蒸餾反應混合物I的FAAE/FFA相，獲得所蒸餾的含有脂肪酸烷基酯和游離脂肪酸的脂肪酸進料；(f)提供含有所蒸餾的脂肪酸進料和低碳醇的反應混合物2 ; (g)使反應混合物2與脂肪酶接觸；以及(h)使反應混合物2反應，生成脂肪酸烷基酯；其中在步驟(e)、(f)和(g)的任意過程中，將水從反應混合物2中除去。
【具體實施方式】
[0008]牛物柴油
[0009]短鏈醇的脂肪酸烷基酯(FAAE)，例如脂肪酸甲酯(FAME)和脂肪酸乙酯(FAEE)，也稱為生物柴油，因為它們被用作化石柴油的添加劑或替代物。
[0010]需要強調的是，由本發明方法製備的脂肪酸烷基酯不是專門用於生物柴油，也能夠在油化學工業的更下遊方法中用作基本的油化學品。[0011]座
[0012]用在本發明方法中的醇優選為短鏈、支鏈或直鏈、碳原子為I至5個(Cp C2, C3、C4或C5)的醇及其混合物(「低碳醇」)。優選的低碳醇是甲醇、乙醇、丙醇及其混合物。相對於反應混合物(游離脂肪酸以及結合甘油的脂肪酸)中脂肪酸的量，醇的含量優選為小於4、3、
2、1.5或1.0摩爾當量。醇可以在反應全程或一部分時段中逐步(例如在I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多步驟中)和/或持續加入至反應混合物中。
[0013]脂肪酸進料
[0014]術語「脂肪酸進料」在本文中定義為包含甘油三酯的脂肪酸進料基質。該基質還可以包含脂肪酸烷基酯、甘油二酯、甘油單酯、游離脂肪酸或其任意組合。包含脂肪酸的任何植物或動物來源的油脂可以在本發明方法中用作製備脂肪酸烷基酯的基質。
[0015]脂肪酸進料可以是選自海藻油、芥花籽油、椰子油、蓖麻油、椰子油(椰子殼油)、玉米油、棉籽油、亞麻油、魚油、葡萄籽油、大麻油、麻瘋果油、荷荷巴油、芥子油、芥花籽油、棕櫚油、棕櫚油硬脂、軟棕櫚油、棕櫚仁油、花生油、油菜籽油、米糠油、紅花油、大豆油、葵花籽油、妥爾油、鹽生植物油、菥蓂油、亞麻薺油、荷荷巴油、芫荽籽油、白芒花籽油(meadowfoamoil)、海濱錦葵油、微生物油脂的油及其任意組合。
[0016]脂肪酸進料可以是選自動物脂肪(包括來自豬、牛、和羊的動物脂)、豬油、雞油、魚油、黃油脂(yellow grease)、褐色油脂(brown grease)的脂肪或其任意組合。
[0017]脂肪酸進料可以是粗製進料、精製進料、漂白進料、脫臭進料、脫膠進料或其任意組合。
[0018]食品級質量的油脂較為昂貴，因此處理它們所得的廢物和副產物、以及非食品級的油脂，已經逐漸演變為用於製備脂肪酸烷基酯的有吸引力的進料。皂腳是煉油廠中通過用鹼處理油而將游離脂肪酸轉化為肥皂(例如鈉皂)而得到的油組分。皂腳除肥皂外，通常包含甘油酯組分。酸化油是煉油廠中通過酸化皂腳以溶解肥皂而得到的副產物。其主要包含游離脂肪酸(FFA)和醯基甘油。餾分例如棕櫚脂肪酸餾分(PFAD)是油精煉的副產物，來自於從油中消除游離脂肪酸的蒸餾工序。
[0019]進料可以是油脂精煉的中間產物、廢產物或副產物，選自皂腳；酸化油；脂肪酸餾分例如PFAD、大豆脂肪酸餾分、油菜籽脂肪酸餾分、米糠脂肪酸餾分、家禽脂肪脂肪酸餾分、牛脂脂肪酸餾分等；脫膠所得的膠；由魚油製備ω-3脂肪酸衍生物的副產物；隔油池油脂；黃油脂和棕色油脂、游離脂肪酸例如油酸；或通過物理分離得到的油組分；或其任意組合。
[0020]酶的固定
[0021]由於新技術的發展，固定化酶在油處理中的應用經歷了顯著增長，提供成本有效的方法。固定化酶的根本性優點是，它們可以通過簡單的過濾從批量製備中進行回收和再利用。
[0022]固定脂肪酶的多種方法在本領域熟知。關於脂肪酶固定的綜述可以在「Immobilized lipase reactors for modification of fats and oils - a review (用於脂肪和油的修飾的固定化脂肪酶反應器-綜述)」Malcata, FX.，等(1990) J.Am.0il Chem.Soc.Vol.67p.890-910中找到，其中示出了代表性的脂肪酶固定載體的實例，包括無機載體例如硅藻土、二氧化矽、多孔玻璃等；多種合成樹脂和合成樹脂離子交換劑；以及天然多糖載體例如引入離子交換基團的纖維素和交聯糊精。[0023]在一些實施方式中，本發明涉及一種方法，其中脂肪酶固定在載體上；通過誘捕在天然基質或合成基質例如溶膠-凝膠、藻酸鹽、和角叉菜膠中；通過交聯法，例如在交聯酶晶體(CLEC)和交聯酶聚集體(CLEA)中；或通過沉澱在鹽晶體例如蛋白包被的微晶(PCMC)上。
[0024]在一些實施方式中，本發明涉及一種方法，其中載體是選自包含以下物質的組的親水性載體:由氧化鋁、二氧化矽或矽酸鹽構成的多孔無機顆粒，例如多孔玻璃、沸石、硅藻土、膨潤土、蛭石、水滑石；以及由糖類聚合物例如瓊脂糖或纖維素構成的多孔有機顆粒。
[0025]在一些實施方式中，本發明涉及一種方法，其中載體是選在包含以下物質的組的疏水性載體:合成的聚合物例如尼龍、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯；以及活性炭。
[0026]塵
[0027]用於本發明的合適脂肪酶是具有分類在E.C.3.1.1.3的酶活性的脂肪酶。脂肪酶可以具有其他活性，例如選自磷脂酶活性、角質酶活性、和醯基轉移酶活性的活性。脂肪酶可以選自W088/02775中公 開的南極假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶A (CALA)、W088/02775中公開並在本文SEQ ID NO:1中示出的南極假絲酵母脂肪酶B (CALB)、在EP258068中公開的疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces Ianuginosus)(以前稱為柔毛腐質黴(Humicola Ianuginosus))脂肪酶、在 W02000/60063 或 W01995/22615 中公開的疏棉狀嗜熱絲孢菌變體特別是在W095/22615的SEQ ID NO:2的I-269位示出的脂肪酶、Hyphozyma sp.脂肪酶(W098/018912)和米黑根毛黴(Rhizomucor miehei)脂肪酶(W02004/099400中的SEQ ID NO:5);來自產鹼假單胞菌(P.alcaligenes)或類產鹼假單胞菌(P.pseudoalcaligenes) (EP218272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia) (EP331376)、穎殼假單胞菌(P.glumae)、斯氏假單胞菌(P.stutzeri) (GB1，372，034)、螢光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌(Pseudomonas sp.)菌株 SD705 (W095/06720 和 W096/27002)、P.wisconsinensis (W096/12012)的脂肪酶；芽孢桿菌(Bacillus)脂肪酶，例如來自枯草芽抱桿菌(B.subtilis) (Dartois 等人(1993)，Biochemica et BiophysicaActa, 1131, 253-360) > 嗜熱脂肪芽胞桿菌(B.stearothermophiIus) (JP64/744992)或短小芽孢桿菌(B.pumilus) (W091/16422)。還優選自來自任何下列微生物的脂肪酶:尖刀鐮孢菌(Fusarium oxysporum)、反射犁頭黴(Absidia reflexa)、傘枝犁頭黴(Absidia corymbefera)、米黑根毛黴、德式根黴(米根黴)(Rhizopus delemar (oryzae))、黑麴黴(Aspergillus niger)、塔賓麴黴(Aspergillus tubingensis)、異孢鐮刀黴(Fusarium heterosporum)、米麴黴(Aspergillus oryzae)、沙門柏乾酪青黴(Peniciliumcamembertii)、臭麴黴(Aspergillus foetidus)、黑麴黴、米麴黴和疏棉狀嗜熱絲孢菌,例如選自W02004/099400中SEQ ID NOs:1-15的任意脂肪酶。
[0028]優選地，脂肪酶是與任意上述脂肪酶具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%同一性的酶。
[0029]更優選地，脂肪酶與本文SEQ ID NO:1的I-342位示出的胺基酸序列具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%的同一'I"生。
[0030]適合用在本發明方法中的固定化脂肪酶以及市售可得的固定化脂肪酶的實例包括以商品名 Novozym435、Lipozyme RM IM 或 Lipozyme TL IM、Lipozyme TL100L、LipozymeTL HC (以上來自 Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)、或 Amano PS (來自 Amano, Japan)進行售賣的那些。
[0031]通常情況下，酶以lLU/g脂肪酸進料至1000LU/g脂肪酸進料的濃度進行使用。優選地，酶以5LU/g脂肪酸進料至500LU/g脂肪酸進料的濃度使用，更優選為10LU/g脂肪酸進料至100LU/g脂肪酸進料。
[0032]通常情況下，酶以lPLU/g脂肪酸進料至1000PLU/g脂肪酸進料的濃度進行使用。優選地，酶以5PLU/g脂肪酸進料至500PLU/g脂肪酸進料的濃度使用，更優選為10PLU/g脂肪酸進料至100PLU/g脂肪酸進料。
[0033]酶的來源
[0034]用在本發明方法中的脂肪酶可以源自或得自任何本文所提及的來源。術語「源自」在上下文中表示，酶可以已經從其天然所處的有機體中分離出，即該酶的胺基酸序列的識別(identity)與天然酶相同。術語「源自」也指，酶可以在宿主有機體中重組製備，重組產生的酶具有與天然酶相同的識別或具有修飾的胺基酸序列，例如具有一個或多個胺基酸缺失、插入和/或取代，即重組產生的酶為天然胺基酸序列的突變體和/或片段。天然酶的含義包含天然變體。此外，術語「源自」包括通過例如肽合成而合成性產生的酶。術語「源自」也包括在體內或體外經由例如糖基化、磷酸化等修飾的酶。術語「得自」在上下文中表示，酶具有與天然酶相同的胺基酸序列。該術語包括已經從其天然所處的有機體中分離出的酶、或是已經在相同種類有機體或其他有機 體中重組表達的酶、或是通過例如肽合成而合成性製備的酶。對於重組產生的酶，術語「得自」和「源自」是指酶的識別特徵，而不是指其重組製備的宿主有機體的識別特徵。
[0035]因此，脂肪酶可以通過使用任何合適的技術從微生物中獲得。例如，酶製劑的獲得可以通過合適微生物的發酵，隨後通過本領域已知的方法從所得的發酵液或微生物中分離出酶製劑。酶也可以通過使用重組DNA技術而獲得。這些方法通常包括對轉化有重組DNA載體的宿主細胞進行培養，其中重組DNA載體包含編碼目的酶的DNA序列以及與合適的表達信號可操作連接的DNA序列，從而載體能夠在使得酶表達的條件下於培養基中進行酶表達並能夠從培養物中回收酶。DNA序列也可以整合到宿主細胞的基因組中。DNA序列可以是基因組DNA、cDNA或合成來源的DNA或其任意組合，並且可以根據本領域已知的方法進行分離或合成。
[0036]酶活性的最佳參數將根據所用的酶而變化。酶降解的速率依賴於本領域已知的因素，包括酶濃度、底物濃度、溫度、抑制劑的存在與否以及水的存在。這些參數可以調整，以優化酯化反應。
[0037]在酶處理步驟中，混懸液的溫度應該調整成提供有效的酶活性。基本而言，使用溫度為約30°C至約90°C，特別是約35°C至約60°C。
[0038]方法設計
[0039]在當前用於酶促製備生物柴油的方法中，包含甘油三酯進料、低碳醇(例如甲醇或乙醇)和水的反應混合物1，在第一脂肪酶催化的酯交換工序步驟中，形成脂肪酸烷基酯、游離脂肪酸和游離甘油。此外，甘油可以加至反應混合物I。
[0040]應用在第一脂肪酶催化的工序步驟(酯交換反應步驟)中的脂肪酶可以是載體上的固定化脂肪酶；固定化脂肪酶可以通過攪拌在反應混合物中保持為混懸液。使用固定化脂肪酶，水含量優選為約0.5%。
[0041]應用在第一脂肪酶催化的工序步驟中的脂肪酶也可以是非固定化的脂肪酶，即液體配方的脂肪酶。在這種情況下，第一脂肪酶催化的工序步驟優選在反應混合物I中水含量為10%至50%、15%至40%、或甚至20%至30%的條件下進行；在第一脂肪酶催化的工序步驟後，反應混合物I中含有非固定化脂肪酶的水/甘油相從反應混合物I中分離，並可以再循環至新批次的甘油三酯進料中。反應混合物I的油相通過蒸餾來分離，得到非常純的脂肪酸烷基酯和游離脂肪酸餾分，其中水含量不多於500ppm的水、300ppm的水、或甚至200ppm的水。術語「蒸餾」旨在包括任何類型的蒸餾方法，例如蒸汽蒸餾、真空汽提和除臭(Lipid Handbook s245.3ed ed.Gunstone 等人，CRC Press2007)。反應混合物 2 由脂肪酸烷基酯和游離脂肪酸餾分以及低碳醇(例如甲醇或乙醇)形成。在第二脂肪酶催化的工序步驟(酯化步驟衝，剩餘的游離脂肪酸與低碳醇反應，形成FFA含量非常低的脂肪酸烷基酯組分。第二脂肪酶催化的工序步驟優選使用固定化酶來進行，例如通過使反應混合物2經過填充床柱中的固定化酶。水是反應產物，需要在整個反應期間從反應混合物2中去除，在多個步驟(例如實施例1中通過真空處理)中進行或持續進行(例如US2010/167360中通過惰性氣流的汽提)，以將反應驅動向酯的那側。在第二脂肪酶催化的工序步驟後的終產物是非常純的脂肪酸烷基酯組分，具有少於0.25%的FFA、少於0.20%的FFA、少於0.15%的FFA、或甚至少於0.10%的FFAJP /或少於300ppm的水、少於200ppm的水、少於IOOppm的水、或甚至少於50ppm的水。應用於甘油三酯酯交換反應的第一脂肪酶催化工序步驟中的低碳醇可以是任何低碳醇，優選甲醇、乙醇和/或丙醇。
[0042]應用於FFA酯化反應的第二脂肪酶催化工序步驟中的低碳醇可以是任何低碳醇，優選甲醇、乙醇和/或丙醇。不同的低碳醇可以應用於第一和第二脂肪酶催化的工序步驟中(即應用在反應混合物I和2中)。在一個優選實施方式中，乙醇應用於第一脂肪酶催化的工序步驟中，甲醇應用於第二脂肪酶催化的工序步驟中。
[0043]材料與方法
[0044]同一件稈度
[0045]對於本發明的目的，可以根據在Needleman, S.B.andWunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45 中描述的方法，適當地確定同一性程度，且應用如下的設置進行多肽序列比較:空位(GAP)產生罰分為3.0，GAP擴展罰分為0.1。可以通過已知電腦程式的方式，例如在GCG程序包中提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package,版本 8，Augustl994, Genetics ComputerGroup, 575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711)，來實現確定。
[0046]可以根據Needleman和Wunsch (同上)記載的方法,使用相同的參數來對兩個給定的序列進行比對。這也可以通過GAP程序(同上)的方式來實現。
[0047]脂肪分解活性
[0048]脂肪分解活性可以使用三丁酸甘油酯作為底物來確定。這種方法基於酶對三丁酸甘油酯的水解，並且水解過程中保持PH恆定的鹼消耗記錄為時間函數。一個脂肪酶單位(LU)定義為，在標準條件下(即，在30°C，pH7.0，含0.1% w/v阿拉伯樹膠作為乳化劑以及0.16M三丁酸甘油酯作為底物)每分鐘釋放I微摩爾可滴定丁酸的酶量。一個KLU是1000LU。[0049]固定化脂肪酶的酯合成活性可以確定為每克產物的月桂酸丙酯單位:PLU/g。固定化脂肪酶酯化月桂酸與1-丙醇，形成月桂酸丙酯。活性(μπιο?/g/min)通過所形成的月桂酸丙酯和所消耗的月桂酸的GC量化來確定。
[0050]一個PLU單位定義為，在標準條件下(即，在60°C，反應時間20分鐘)每分鐘形成I微摩爾月桂酸丙酯的酶量。
[0051]塵
[0052]Novozym435是Novozymes A/S的商業酶產品，含有南極假絲酵母(本文的SEQ IDNO:1)的固定化脂肪酶B。該產品具有10000PLU/g的活性。
[0053]LipexlOOL是Novozymes A/S的商業酶產品,含有疏棉狀嗜熱絲孢菌(本文的SEQID NO:2)的固定化脂肪酶。該產品具有100KLU/g的活性。
[0054]Lipozyme TLlOOL是Novozymes A/S的商業酶產品,含有疏棉狀嗜熱絲孢菌(本文的SEQ ID NO:2)的液體配方脂肪酶。該產品具有100KLU/g的活性。
[0055]實施例1
[0056]本發明的方法可以包括:
[0057]1.酯交換，使用
[0058]a.液體配方脂肪酶，或
[0059]b.固定化脂肪酶，
[0060]2.將FAME/FFA酯相與水/甘油相分離，
[0061 ] 3.從FAME/FFA相蒸餾出FAME和FFA，以及
[0062]4.餾出物中FFA的酯化。
[0063]Ia.[0064]大豆油與水和甘油以80:10:10w/w比例進行混合，調節至40°C。將液體配方的酶(Lipozyme TL100L, Novozymes Denmark)以油的0.5%的劑量加入。將反應混合物於40°C在攪拌下孵育22小時。甲醇以相對於油中脂肪酸的1.3摩爾當量加入(14.1克甲醇對應100克油)。甲醇在孵育的最初5小時內逐漸加入。當反應完成時，FAME和FFA在FAME/FFA相中的含量預計分別為約92%及6%。
[0065]Ib.[0066]大豆油與水和甘油以80:10:10w/w比例進行混合，調節至40°C。將固定化酶(Lipozyme TL HC, Novozymes Denmark)以油的5%的劑量加入。將反應混合物於40°C在攪拌下孵育22小時。甲醇以相對於油中脂肪酸的1.3摩爾當量加入(14.1克甲醇對應100克油)。甲醇在孵育的最初5小時內逐漸加入。當反應完成時，FAME和FFA在FAME/FFA相中的預計含量分別為約92%及6%。
[0067]2.[0068]通過除去水/甘油相來獲得FAME/FFA相。當使用液體酶時，水/甘油相包含酶並且能夠再利用於其他批次的FAME製備。
[0069]3.[0070]蒸餾FAME/FFA相，獲得蒸餾的脂肪酸進料，預計由6 %油酸和94% FAME構成。
[0071]4.[0072]所蒸餾的脂肪酸進料(a)通過在50°C下的真空處理乾燥成水含量<200ppm，(b)加入4%的甲醇，以及(c)將反應混合物泵送經過保持在40°C的含固定化脂肪酶(Novozym435, Novozymes Denmark)的填充床柱。此處理(a、b和c)進行三次,將最終的反應產物真空乾燥至含水量<200pm。通過三次經過柱，FFA含量預計減少到〈0.25%，且產物可以用作生物柴油。在反應混合物的真空乾燥過程中收集的溼甲醇可以在步驟I (a或b)的酯交換反應中再利用， 因為該反應耐受於水。
【權利要求】
1.一種由脂肪酸進料製備脂肪酸烷基酯(FAAE)的方法，包括以下步驟: Ca)提供包含脂肪酸進料、低碳醇和水的反應混合物I ; (b)使所述反應混合物I與脂肪酶接觸； (c)使所述反應混合物I反應，形成脂肪酸烷基酯； Cd)從所述反應混合物I的FAAE/FFA相中分離出水/甘油相； Ce)蒸餾所述反應混合物I的FAAE/FFA相，獲得蒸餾的含有脂肪酸烷基酯和游離脂肪酸的脂肪酸進料； Cf)提供包含蒸餾的脂肪酸進料和低碳醇的反應混合物2 ； (g)使所述反應混合物2與脂肪酶接觸；以及 (h)使所述反應混合物2反應，形成脂肪酸烷基酯； 其中在步驟(e)、(f)和(g)的任意步驟中，從所述反應混合物2中除去水。
2.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(e)、(f)和(g)重複一次或多次。
3.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中在步驟(f)、(g)和(h)的任意步驟中，通過惰性氣體的氣提、閃蒸或持續蒸發，從所述反應混合物2中除去水。
4.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中在步驟(f)、(g)和(h)的任意步驟中的水量保持在300ppm以下。
5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述脂肪酸進料得自海藻油、芥花籽油、椰子油、蓖麻油、椰子油(椰子殼油)、玉米油、棉籽油、亞麻油、魚油、葡萄籽油、大麻油、麻瘋果油、荷荷巴油、芥子油、芥花籽油、棕櫚油、棕櫚油硬脂、軟棕櫚油、棕櫚仁油、花生油、油菜籽油、米糠油、紅花油、大豆油、葵花籽油、妥爾油、鹽生植物油、菥蓂油、亞麻薺油、荷荷巴油、芫荽籽油、白芒花籽油、海濱錦葵油、微生物油脂中的任一種，或其組合。
6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中， 在步驟(a)和/或步驟(f)中的醇選自甲醇、乙醇和丙醇，包括其混合物。
7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(b)中的脂肪酶是液體配方的脂肪酶和/或固定化脂肪酶。
8.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(b)中的脂肪酶是液體配方的脂肪酶且所述反應混合物I中的水含量為10%至50%。
9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中使用固定化脂肪酶進行步驟(f)。
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述脂肪酶固定在載體上，例如是選自包含以下物質的組的親水性載體:由氧化鋁、二氧化矽或矽酸鹽構成的多孔無機顆粒，例如多孔玻璃、沸石、硅藻土、膨潤土、蛭石、水滑石，以及由糖類聚合物例如瓊脂糖或纖維素構成的多孔有機顆粒；或例如選自包含以下物質的組的疏水性載體:合成的聚合物例如尼龍、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯，以及活性炭。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中在填充床柱中進行步驟(g)。
12.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(e)和/或步驟(f)中的脂肪酶是南極假絲酵母脂肪酶B和/或與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%同一性的酶。
13.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(e)和/或步驟(f)中的脂肪酶是疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶和/或與SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%同一性的酶。
14.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中將所述反應混合物I中含有酶的水/甘油相在酯交換反應中進行再利用。
15.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中在所述反應混合物I中應用的低碳醇是乙醇，在所 述反應混合物2中應用的低碳醇是甲醇。
【文檔編號】C12P7/64GK103459607SQ201280016597
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年3月29日 優先權日:2011年3月30日
【發明者】P·M·尼爾森, H·C·霍爾姆 申請人:諾維信公司