水溶性sdz－rad酯的製作方法
2023-07-03 01:49:21
專利名稱：水溶性sdz－rad酯的製作方法
技術領域：
本發明涉及水溶性SDZ-RAD酯，它們的製備方法和它們用於誘導免疫抑制和在治療移植排斥、自身免疫疾病、固體腫瘤中的方法。更具體地說，本發明涉及SDZ-RAD的聚乙二醇酯、它們的製備方法和使用它們誘導免疫抑制和在治療移植排斥、移植到宿主疾病、自身免疫疾病、炎性疾病、成人T細胞白血病/淋巴瘤、固體腫瘤、真菌感染和高增生血管疾病中的應用。
SDZ-RAD是40-O-(2-羥基)乙基-雷怕黴素，其結構和合成在WO94/09010(Cottens等人)中公開。
作者Crowe和Lemaire在它們在Pharmaceutical Research，15卷，№11，1998的文章中描述了SDZ-RAD，具有如下結構的雷怕黴素的類似物的體外和就地吸收 雷怕黴素是由吸水鏈黴菌(Steoptomyces hyproscopicus)生產的大環三烯抗體，它被發現在體內和體外具有抗真菌活性，尤其對白色念珠菌(Candida albicans)[C.vezina等人，J.Antibiot.28，721(1975)；S.N.Sehgal等，J.Antibiot.28，727(1975)；H.A.Baker等人，J.Antibiot.31，539(1978)；US專利3929992和US專利3993749]。
單獨的雷怕黴素(US專利4885171)或與溶菌黴的結合(US專利4401653)已顯示具有抗腫瘤活性。R.Martel等人的[Can.J.Physiol.Pharmacol.55，48(1977)]公開了雷怕黴素在實驗變應性腦脊髓炎模型，一種用於多發性硬化的模型，在輔助關節炎模型，一種用於類風溼關節炎的模型中是有效的，並有效抑制Ig-E類抗體的形成。
雷怕黴素的免疫抑制作用在FASEB 3，3411(1989)中公開，環胞黴素A和FK-506，其它大環分子，也顯示作為免疫抑制劑是有效的，因而用於預防移植排斥[FASEB 3，3411(1989)；FASEB 3，5256(1989)；R.Y.Calne等，Lancet 1183(1978)和US專利5100899]。
雷怕黴素也顯示用於預防或治療系統紅斑狼瘡[US專利5078999]、肺炎[US專利508 0899]、胰島素依賴糖尿病[Fifth Int.Conf.Inflamm.Res.Assoc.121(摘要)，1990]、光滑肌細胞增生和內膜增厚引起的血管損傷[Morris，R.J.Heart Lung Transplant 11(pt.2)197(1992)]，成人T細胞白血病/淋巴瘤[EP專利525960 A1]和眼炎症[EP專利532862A1]。
雷怕黴素的單和二醯基化衍生物(在28和43位酯化)已顯示用作抗真菌劑(US專利4316885)並用於製備雷怕黴素的水溶性氨基醯基前藥(US專利4650803)。近年，對於雷怕黴素許多慣例已發生變化，因此，根據Chemical Abstracts命名法，上述酯將在31-和42-位。US專利5023263描述了42-氧代雷怕黴素的製備和應用，US專利5023264描述雷怕黴素的27-肟的製備和應用。
聚乙二醇(PEG)是以各種分子量獲得的直鏈或支鏈，中性聚合物，溶解於水和大多數有機溶劑中，分子量低於1000的PEG是粘稠的，無色液體；較高分子量的PEG是蠟狀白色固體。固體的熔點與分子量成正比，在67℃時接近穩定水平。分子量範圍從幾百到約20000通常用於生物學和生物工程學應用。在生物醫學範圍是感興趣的是PEG是無毒的，得到FDA的許可用於體內消耗。
SDZ-RAD是雷怕黴素衍生物，它在動物模型中具有免疫抑制活性(US專利5665772)。
本發明的化合物是水溶性的，用作免疫抑制、消炎、抗真菌、抗增生和抗腫瘤藥物。在本發明的化合物中，優選n＝5-200；更優選n＝8-135。最優選的數值是其中n＝8-20的物質和其中n＝90-120的物質。本發明的化合物還基於用於生產它們的酯鏈的聚乙二醇鏈的平均分子量描述和理解。例如，SDZ-RAD-PEG-SH 5000酯涉及通式的化合物，其中42-O-(2-羥基)-乙基位置的酯使用平均分子量在或接近5000的平均分子量的聚乙二醇衍生物形成。
本發明的酯可現有技術中已知的聚乙二醇製備，例如如Handbook of Pharmaceutical Excipients，2nd Ed.，1994(Library ofCongress Catalog Card No.94-79492)中所述，它列為本文參考文獻。本發明的優選化合物可以描述成使用平均分子量約200-約200000的聚乙二醇酯化的通式化合物。本發明的PEG酯的優選範圍包括其中酯鏈的聚乙二醇部分的分子量具有約300-約20000，更優選約350-約6000的分子量的物質。本發明的化合物的非限制實例包括使用在Handbook of Pharmaceutical Excipients，2nd Ed.，1994中列出的各種PEG製備的通式化合物。
化合物用於治療、預防或抑制雷怕黴素、其類似物和前藥可使用的症狀。這些方法包括治療或抑制移植排斥，例如腎、心臟、肝、肺、骨髓、胰腺(胰島細胞)、角膜、小腸和皮膚同種移植物，和心瓣異種移植物；治療或抑制移植對宿主疾病；治療自身免疫疾病，例如狼瘡、類風溼性關節炎、糖尿病、重症肌無力和再狹窄；和炎性疾病，例如牛皮癬、皮炎、溼症、皮脂溢、炎性腸疾病和肺炎(包括哮喘、慢性阻塞性肺病、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合症、支氣管炎等)和眼色素層炎。
由於獲得的活性曲線，本發明的化合物還被認為有抗腫瘤、抗真菌活性和抗增生活性。本發明的化合物因此還用於治療固體腫瘤，包括肉瘤和癌，例如星形細胞瘤、前列腺癌、乳腺癌、小細胞肺癌和卵巢癌；成人T細胞白血病/淋巴瘤；真菌感染；和高增生血管疾病，例如再狹窄和粥樣硬化。當用於再狹窄時，優選本發明的化合物用於治療在血管成形術後出現的再狹窄。當用於該用途時，本發明的化合物可以在手術前、手術過程中、手術後或上述任何組合時給藥。
當用於預防或抑制上述疾病症狀給藥時，本發明的化合物可口服、腸胃外、鼻內、支氣管內、眼內、局部、陰道內或直腸內地向哺乳動物給藥。
本發明的化合物由於它們的水溶性，作為免疫抑制劑、消炎、抗真菌、抗增生和抗腫瘤藥物是尤其有利的。
當本發明的化合物用作免疫抑制或消炎藥物時，可嘗試將它們與一種或多種免疫調節藥物結合給藥。該其它免疫調節藥物包括，但不限於，硫噻嘌呤、皮質類甾醇，例如潑尼松和強的松龍甲酸酯、環磷醯胺、雷怕黴素、環胞菌素A、FK-506、OKT-3和ATG。通過結合本發明的化合物與該用於誘導免疫抑制或治療炎性症狀的其它藥物，為獲得所需效果需要較少量的每種藥物。該結合治療的基礎由Stepkowski確定，其結果顯示以亞治療劑量結合使用雷怕黴素和環胞菌素A明顯延長了心臟同種移植物的存活時間[Transplantation Proc.23507(1991)]。
本發明還包括藥物組合物，其含有本發明的一種或多種PEG酯和一種或多種可藥用的載體或賦形劑，藥物載體或賦形劑或以是固體或液體。
固體載體可包括一種或多種可用作矯味劑、潤滑劑、增溶劑、懸浮劑、填料、滑動劑、壓制助劑、粘結劑或片劑崩解劑的物質；它還可以是包膠囊物質。在粉末中，載體是細粉碎的固體，這是與細粉碎的活性組分的混合物。在片劑中，活性組分與具有所需壓制性質的載體以合適比例混合，壓製成所需形狀和尺寸。粉末和片劑優選含有至多99％的活性組分。合適的固體載體包括，例如磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、蔗糖、乳糖、糊精、澱粉、明膠、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯基吡咯烷酮、低熔點蠟和離子交換樹脂。
液體載體用於製備溶液、懸浮液、乳液、糖漿、酏劑和加壓組合物。活性組分可溶解或懸浮在可藥用的液體載體，例如水、有機溶劑、兩者的混合物或可藥用的油或脂肪中。液體載體可含有其它合適的藥物添加劑，例如增溶劑、乳化劑、緩衝劑、防腐劑、甜味劑、矯味劑、懸浮劑、增稠劑、著色劑、粘度調節劑、穩定劑或嗅覺調節劑。用於口服和腸胃外給藥的液體載體的合適實例包括水(部分含有上述添加劑，例如纖維素衍生物，優選羧甲基纖維素鈉溶液)、醇(包括單羥基醇和多羥基醇，例如甘油)和它們的衍生物、卵磷脂和油(例如分餾的椰子油和花生油)。用於腸胃外給藥時，載體還可以是油質酯，例如油酸乙酯和肉豆蔻酸異丙基酯。無菌液體載體用於腸胃外給藥的無菌液體形式的組合物。用於加壓組合物的液體載體可以是滷代烴或其它可藥用的推進劑。
作為無菌溶液或懸浮液的液體藥物組合物可通過使用肌內、腹膜內或皮下注射使用，無菌溶液還可以靜脈內給藥，化合物還可以液體或固體形式口服給藥。
本發明的化合物可以常規栓劑形式直腸給藥，對於鼻內或支氣管內吸入或吹入給藥，本發明的化合物可配製成含水或部分含水溶液，它隨後以氣溶膠形式使用。本發明的化合物還皮埋給藥，使用含有活性化合物和對活性化合物惰性、對皮膚無毒和能夠提供經經皮膚系統地吸收入血液的載體的皮埋斑。載體可以採用許多形式，例如乳液和軟膏、糊劑、凝膠和閉合裝置。乳液和軟膏可以水包油或油包水類型的粘稠液體或半固體乳液。由分散在含有活性組分的石油或烴石油中的吸收粉末組成的糊劑也是合適的。各種閉合裝置可使用向血液中釋放活性組分，如覆蓋含有帶有或不帶載體的活性組分或含有活性組分的基質的容器的半滲透膜，其它閉合裝置在文獻中是已知的。
另外，本發明的化合物可以與含有0.1-5％，優選2％的活性化合物的賦形劑製成溶液、膏或洗劑的製劑施用於真菌侵襲範圍。
劑量要求隨著所使用的具體化合物、給藥途徑、所存在的症狀的嚴重程度和所治療的具體受體變化。基於在標準藥理學試驗方法中得到的結果，所計劃的活性化合物的日劑量將是0.1μg/kg-100mg/kg，優選0.001-25mg/kg，更優選0.01-5mg/kg。治療通常將用小於化合物的最佳劑量的小劑量開始，隨後增加劑量直至在狀況下達到最佳效果；用於口服、腸胃外、鼻內或支氣管內給藥的精確劑量將由執行的臨床醫生基於所治療的各個受體的經歷決定。優選藥物組合物是單位劑量形式，例如片劑或膠囊。在該形式中，組合物細分為含有合適數量的活性組分的單位劑量；單位劑量形式可以是包裝的組合物，例如包裝的粉末、小瓶、安瓿、預裝料的注射器或含有液體的小藥囊。單位劑量形式可以是例如膠囊或其片劑或它可以是包裝形式的合適數量的任何該組合物。
本發明的42-O-(2-羥基)乙基的SDZ-RAD酯化化合物可通過在偶聯劑，例如二環己基碳化二亞胺(DCC)和鹼性催化劑，例如二甲基氨基吡啶(DMAP)存在下用一般結構式為X-CH2CO2H的醯基化試劑，其中X是合適的離去基團，例如碘或溴，醯基化SDZ-RAD的42-O-(2-羥基)乙基或31-位或兩者位置上的羥基以得到具有如下結構(II)的42-O-(2-羥基)乙基和/或31-羥基醯基化的SDZ-RAD製備，其中R1和R2分別是-H和-COCH2X。 每個可能的化合物可通過色譜法分離。醯基化的SDZ-RAD用單甲氧基聚(乙二醇)硫醇在鹼，例如碳酸氫鈉存在下還原得到本發明的在SDZ-RAD的42-O-(2-羥基)乙基上的所需酯。新的方法可應用於在US專利5665772中的雷怕黴素的任何羥基烷基、二羥基烷基、氫烷基芳基烷基、二氫烷基芳基烷基、二羥基烷基烯丙基衍生物。
因此，本發明提供了製備如上的式I化合物的方法，其包括使如上所述的式II化合物，其中R1是COCH2X，其中X是合適離去基團，例如碘或溴，和R2是氫，與式(III)化合物反應HSCH2CH2(OCH2CH2)nOCH3(III)其中n是如式I中所定義的。
雷怕黴素42-甲矽烷基醚的製備方法在US專利B15120842中描述，它列為本文參考文獻。在叔丁基二甲基甲矽烷基保護基團的情況下，脫保護可在弱酸性條件下，例如乙酸/水/THF，完成。脫保護方法在US專利5118678的實施例15中描述，列為本文參考文獻。
本發明還包括在本領域中已知的其它雷怕黴素的類似酯，例如但不限於，29-去甲氧基雷怕黴素[US專利4375464，根據C.A.命名法32-去甲氧基雷怕黴素]；其中在1-、3-和/或5-位的雙健被還原的雷怕黴素衍生物[US專利5023262]；29-去甲雷怕黴素[US專利5093339，根據C.A.命名法32-去甲雷怕黴素]；7，29-二去甲雷怕黴素[US專利5093338，根據C.A.命名法7，32-二去甲雷怕黴素]；27-羥基雷怕黴素[US專利5256790]和15-羥基雷怕黴素[US專利5102876]。本發明還包括在42-氧代雷怕黴素的31位上的酯[US專利5023263]，上述引用的US專利中公開的內容列為本文參考文獻。
用於製備本發明化合物的試劑是商業可獲得的或可通過文獻中描述的標準方法製備。
如下實施例舉例說明本發明的代表性化合物的製備和生物活性。
實驗部分材料和設備1，3-二環己基碳化二亞胺(DCC)和4-二甲基氨基吡啶由AldrichChemical Co.(Milwaukee，WI)購買，平均分子量5000的甲氧基-PEG-SH(mPEG-SH 5000)由Shearwater Polymers，Inc.(Huntsville，Al)購買。SDZ-RAD由Chemical Development Wyeth-Ayerst Research，pearl River，NY購買。所有溶劑是HPLC級，所有其它化學品是分析試劑或相等物。製備HPLC由兩個Dynamax溶劑輸送系統(型號SD-1)和一個Dynamax吸收檢測器(型號UV-1)組成，由RaininInstrument Inc.(Woburn，MA)獲得。自動速度真空濃縮器(Savant，型號AS 160)來自Savant Instruments，Inc.(Holbrook，NY)和BUCHI旋轉蒸發系統(RE 260和R124)來自Buchi(Flawil，Switzerlant)。1H-NMR譜用使用CDCl3作為溶劑的400MHzNMR分光光度儀記錄。質譜由API 365質譜儀或來自PE Sciex的MALDI/TOF質譜儀得到，所有樣品在室溫下製備和試驗。HPLC方法分析HPLC系統由帶有1040二極體陣列檢測器系統的Hewlett-Packard型1090 LC組成，使用來自Waters的μ-Bondapak C-18(300×3.9mm)柱。移動相A是10％乙腈，90％pH4.5的0.1M 0.1M三乙基乙酸銨(TEAA)緩衝液，移動相B是90％乙腈，10％pH4.5的0.1M三乙基乙酸銨(TEAA)緩衝液。梯度是在30分鐘內由50％B至100％B，隨後保持100％B5分鐘，隨後返回最初的50％B。柱在下一次注射前在50％B平衡15分鐘，柱溫是40℃，流速為1mL/分鐘。檢測波長設定為280nm，注射體積為10μl。SDZ-RAD-碘乙酸酯的製備 在150ml圓底燒瓶中，將SDZ-RAD(0.50g，5.2×10-4mol)、4-二甲基氨基吡啶(3.0mg)和1，3-二異丙基碳化二亞胺(0.136g，6.6×10-4mol)溶解在20ml無水二氯甲烷中，將碘乙酸(0.116g，6.3×10-4mol)溶解在10ml無水二氯甲烷中。在磁性棒攪拌下，碘乙酸溶液在10分鐘內加入反應混合物中。隨後反應混合物在室溫下再攪拌2.5小時。隨後通過多孔玻璃濾器過濾，濾液轉移到分離漏鬥，用50ml碳酸氫鈉溶液(5.5g/100ml)洗滌，隨後用2×50ml水洗滌。用5g無水硫酸鈉乾燥二氯甲烷層4小時，隨後過濾出硫酸鈉，通過旋轉蒸發除去二氯甲烷，得到總共0.60g淺黃色固體。用來自Waters的Prep Nova-pak HRC18(300×19mm)柱通過製備HPLC分離純SAZ-RAD-碘乙酸酯。使用梯度(30％A，70％B 5分鐘，隨後至100％B 30分鐘)在18.4分鐘洗脫SDZ-RAD碘乙酸酯。A是90％A，10％乙腈；B是10％水，90％乙腈。收集餾分，用2×50ml二氯甲烷提取，合併有機層，用無水硫酸鈉乾燥4小時，通過旋轉蒸發除去有機溶劑至幹，得到黃色固體(0.102g)。
1H NMR(CDCL3，400MHz)d 3.72(s，2H，I-CH2-CO2-)，4.28(m，2H，-CO2-CH2-).
MS m/z 1134.6(M+NH4)+；m/z 1184.6(M+OAC).MS/MS 213.0(ICH2CO2CH2CH2)+SDZ-RAD-PEG SH 5000共軛物的製備 其中X1是-(CH2OCH2)n』-，其中平均n』＝104。
將SDZ-RAD碘乙酸酯(76mg，6.8×10-5mol)溶解在30ml含有50％乙腈和50％碳酸氫鈉(0.1M)溶液的溶液中，溶液用氮氣清洗10分鐘，取10μL原始樣品用於HPLC分析。隨後在反應溶液中加入mPEG-SH 5000(337mg，6.8×10-5mol)，反應混合物在室溫下再攪拌30分鐘，再次通過取樣10μL用於HPLC分析。色譜圖顯示SDZ-RAD碘乙酸酯100％轉化為SDZ-RAD-PEG共軛物。反應混合物用2×150ml二氯甲烷提取，有機層用無水硫酸鈉乾燥並過濾。通過旋轉蒸發，濾液濃縮至20ml的體積，粗產物在加入200ml乙醚後沉澱出來。在通過多孔玻璃漏鬥過濾和真空乾燥後得到總共340mg淺黃色粉末。用來自Waters的Prep Nova-pak HR C18(300×19mm)柱通過製備HPLC分離純SAZ-RAD-PEG共軛物，也稱為聚乙二醇化的SDZ-RAD。使用梯度(60％A，40％B 5分鐘，隨後至20％A，80％B 30分鐘)在15分鐘洗脫SDZ-RAD碘乙酸酯。收集餾分，用2×100ml二氯甲烷提取，合併有機層，用無水硫酸鈉乾燥4小時，通過旋轉蒸發除去有機溶劑至幹。殘餘物溶解在5ml二氯甲烷中，在加入150ml乙醚後沉澱出來，在通過多孔玻璃漏鬥過濾和真空乾燥後得到淺黃色粉末。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ2.84(t，2H，S-CH2-CH2)，3.31(s，2H，CO-CH2-S)，3.38(s，3H，-OCH3)，4.26(m，2H，-CO2-CH2-). MS(MALD/TOF)m/z 5795.5.U87MG Human Glioblastoma(ATCC # HTB-14)3H Tbymidine Incorporation Protocol生長培養基含有Earle Salts的BRL基本必需培養基(500ml)+5mL BRL MEN非必需胺基酸(10mM)+5mL BRL青黴素和鏈黴素(10000μg/ml，10000μg/ml)+5mL BRL丙酮酸鈉溶液(100mM)+5mL BRL L-穀氨酸鹽200mM+50mL胎牛血清(合格)試驗1.細胞受胰蛋白酶作用，以200μl生長培養基的最終體積以104細胞/孔的濃度放入96孔平底板中，在37℃下粘連24小時。2.用移液管仔細除去培養基以不擾亂細胞單層。在每個孔中加入200μl新鮮生長培養基，允許有足夠的樣品孔以使試驗重複三次，加入在10μlPBS中的化合物，在37℃下再培養48小時。3.在培養的最後5小時，板用每孔1μCi 3H胸腺嘧啶脫氧核甙標定。(NEN胸腺嘧啶核甙，目錄#NET-027，6.7Ci/mmol)。加入在10μlPBS中的1μCi(在收穫日)，板放回培養器中培養最後5小時。4.用移液管仔細除去放射性培養基以不擾亂細胞單層。在每個孔中加入50μlBRL 10X胰蛋白酶，隨後在37℃下培養10分鐘或直至單層由孔底脫落。使用Skatron 96孔收穫器在玻璃纖維過濾墊上收穫樣品，在Wallac Betaplate計數器上計數墊。結果化合物IC50雷怕黴素 0.5ng/mLSDZ-RAD 2.0ng/mLSDZ-RAD-PEG 5000共軛物0.5ng/mL**與SDZ-RAD的摩爾等價物
權利要求
1.結構(I)的化合物 其中n是5-450的整數；
2.權利要求1的化合物，其中n＝5-200。
3.權利要求1的化合物，其中n＝8-135。
4.權利要求1的化合物，其中n＝8-20。
5.權利要求1的化合物，其中n＝90-120。
6.權利要求1的化合物，它是SDZ-RAD-PEG SH 5000共軛物。
7.製備權利要求1中式(I)化合物的方法，其包括使式(II)化合物 其中R1是COCH2X，其中X是合適離去基團，和R2是氫，與下式化合物反應HSCH2CH2(OCH2CH2)nOCH3其中n是如式I中所定義的。
8.在需要的哺乳動物中治療移植排斥或移植對宿主疾病的方法，其包括向所述哺乳動物給藥抗排斥有效量的權利要求1-6的任何之一的式(I)化合物。
9.在需要的哺乳動物中治療真菌感染的方法，其包括向所述哺乳動物給藥抗真菌有效量的權利要求1-6的任何之一的式(I)化合物。
10.在需要的哺乳動物中治療類風溼性關節炎的方法，其包括向所述哺乳動物給藥抗關節炎有效量的權利要求1-6的任何之一的式(I)化合物。
11.在需要的哺乳動物中治療再狹窄的方法，其包括向所述哺乳動物給藥抗增生有效量的權利要求1-6的任何之一的式(I)化合物。
12.在需要的哺乳動物中治療肺炎的方法，其包括向所述哺乳動物給藥消炎有效量的權利要求1-6的任何之一的式(I)化合物。
13.在需要的哺乳動物中治療固體腫瘤的方法，其包括向所述哺乳動物給藥抗腫瘤有效量的權利要求1-6的任何之一的式(I)化合物。
14.權利要求13的方法，其中固體腫瘤是癌或肉瘤。
15.藥物組合物，其含有權利要求1-4的任何之一的式(I)化合物和可藥用的載體或賦形劑。
16.權利要求15的藥物組合物，其中式(I)化合物是SDZ-RAD-PEG SH5000共軛物。
全文摘要
本發明提供了具有一般結構(I)的新的雷怕黴素的水溶性聚乙二醇酯類,其中n是約5－約450的整數,和含有這些化合物的藥物組合物和它們用作免疫抑制、消炎、抗真菌、抗增生和抗腫瘤的方法。
文檔編號A61P21/04GK1367787SQ00811219
公開日2002年9月4日 申請日期2000年8月16日 優先權日1999年8月18日
發明者朱天民, S·M·沙, R·W·桑德斯 申請人:美國家用產品公司