低酸水溶性銀杏葉提取物的製備方法與流程
2023-06-03 21:48:26
本發明涉及銀杏葉提取物的製備方法，尤其涉及低酸水溶性銀杏葉提取物的製備方法。
背景技術：
銀杏(Ginkgo bilobal)是冰川時期存活在地球上的古老植物，素有「活化石」之稱。中國是銀杏的發源地，其資源佔世界總量的70％左右。近年來，銀杏葉提取物及其製劑對冠心病，心絞痛，大腦退行性病變及心血管疾病引起的腦動能障礙，老年痴呆症等療效確切，已成為治療心腦血管疾病的首選藥物。
中國是全球第一大銀杏葉提取物生產國，行業產能佔全球總產能的50％以上。2013年中國銀杏葉提取物產量達到了348.6噸。2014年為468.5噸，為全球總產量的48.52％。我國雖然是銀杏葉提取物產量大國，但在國際市場的佔有率大大落後於歐美與日本。其主要原因是我國的銀杏葉提取物及其製劑處於全球產業鏈的低端，抑制了我國企業議價能力的提升。
通過比較銀杏葉提取物在各國藥典現行質量標準的主要指標，說明《中國藥典》與歐美藥典存在明顯差距，最引人關注的有毒物質銀杏酸的含量在《中國藥典》限量為小於10ppm，歐美藥典為小於5ppm，高於歐美藥典限量的一倍。
銀杏酸具有潛在的致敏，致突變的作用及細胞毒性，可引起嚴重的過敏反應，基因突變。在國際市場上含量高低直接影響產品的質量和價格，因此降低銀杏葉提取物中的銀杏酸含量是迫切需要解決的問題。目前關於降低銀杏葉提取物中銀杏酸的方法從檢索的專利資料來看基本為溶劑萃取和大孔樹脂吸附法。現有技術中使用聚醯胺柱純化銀杏葉提取物，去銀杏酸，大多局限於粗提取，在經過柱子之後還需要繁瑣的步驟來對粗產品進一步純化，並且，在過柱子時，大多採用醇溶液體系，之後還涉及到去除有機溶劑的步驟，對製劑的安全性有一定的影響。
CN201310336439公開了一種以銀杏落葉為原料的銀杏葉精製提取物及其製備方法與應用。此專利中分別使用70％-85％的乙醇，90％-95％的乙醇，70％-75％的甲醇，還使用了大孔樹脂吸附柱和聚醯胺柱，均為醇溶液上柱。首先是步驟較為繁瑣，其次使用高濃度的有機溶劑增加了生產成本，最後，把加入的助溶劑去除，使產品達到國家標準也是很大的問題。此專利只公開了去除甲醇的方法為減壓濃縮，冷凍乾燥，而冷凍乾燥的方法對甲醇的去除效果並不明顯，而後續的檢測也並沒有給出甲醇的殘留量。
CN101194918B公開了一種銀杏酸脫除工藝，步驟比較簡單，然而對於實施時的溫度，用量公開均不充分，本行業技術人員無法實施，同時產物中的銀杏酸含量低於5ppm，還是比本發明中的含量高。
全球銀杏葉提取物(總黃酮)每年總產量為888.4噸，中國約佔450噸。上述提取物均以銀杏葉為原料提取所得，目前為止還沒有1噸提取物是從銀杏根皮中提取得到的，因此降低銀杏葉提取物中銀杏酸含量是當務之急，是銀杏產業升級的重要一環，只有降低銀杏葉提取物中的銀杏酸，而且大大低於歐盟標準的＜5ppm，在生產上才有實際意義，才會帶來巨大的經濟效益。
技術實現要素：
根據上述領域的不足，本發明提供一種銀杏酸含量極低的，高效、安全、簡捷、經濟、極易被人體組織吸收的低酸水溶性銀杏葉提取物的生產工藝。
本發明的技術方案如下：
低酸水溶性銀杏葉提取物的製備方法，包括以下步驟：
(1)上樣：將水溶性銀杏葉提取物的水溶液上聚醯胺吸附柱；(2)待所述水溶性銀杏葉提取物的水溶液通過聚醯胺吸附柱後，再用純化水洗脫，收集上樣流出液和洗脫液，即得到低酸水溶性銀杏葉提取物。
所述步驟(1)中所述聚醯胺吸附柱裝填有粒度為100～300目的聚醯胺吸附劑，所述聚醯胺吸附劑質量與所述水溶性銀杏葉提取物的水溶液的質量比為1:1～1:3；所述上樣流出液和洗脫液的流速為2ml/min～5ml/min；同時動態監控所述上樣流出液和洗脫液中的銀杏酸含量；
所述步驟(2)中所述洗脫為用4～5倍柱體積的純化水洗脫。
所述水溶性銀杏葉提取物為銀杏酸含量小於10ppm的水溶性銀杏葉提取物。
所述水溶性銀杏葉提取物由如下方法製備得到：
採用脂溶性銀杏葉提取物為原料，20％～60％的熱乙醇為提取溶劑；用所述熱乙醇充分溶解脂溶性銀杏葉提取物後，冷卻並放置過夜以沉澱出不溶性雜質，濾去濾渣的濾液A；將所述濾液A減壓蒸餾除去提取劑乙醇，過濾得水溶性銀杏葉提取物，所述水溶性銀杏葉提取物中銀杏酸含量小於10ppm；所述脂溶性銀杏葉提取物的提取溶劑為70％稀乙醇。
所述水溶性銀杏葉提取物為銀杏酸含量小於5ppm的水溶性銀杏葉提取物。
所述水溶性銀杏葉提取物由如下方法製備得到：
採用脂溶性銀杏葉提取物為原料，22％～28％的熱乙醇為提取溶劑；用所述熱乙醇充分溶解脂溶性銀杏葉提取物後，冷卻並放置過夜以沉澱出不溶性雜質，濾去濾渣的濾液A；將所述濾液A減壓蒸餾除去提取劑乙醇的過程中要不斷添加熱水到所述濾液A中以使固體的重量含量佔溶劑的體積的分數控制在7～9％，放置室溫過夜，過濾得水溶性銀杏葉提取物；所述水溶性銀杏葉提取物中銀杏酸含量小於5ppm；所述脂溶性銀杏葉提取物的提取溶劑為70％稀乙醇。
所述低酸水溶性銀杏葉提取物為銀杏酸含量小於1ppm的水溶性銀杏葉提取物。
所述步驟(1)中的動態監控為進行薄層層析定性監控，防止流速過快帶出銀杏酸；所述洗脫液每10分鐘計作1流分；
所述步驟(2)收集洗脫液後，進行減壓濃縮，真空乾燥至變成粉末。
所述聚醯胺吸附柱裝填有粒度為300目的聚醯胺吸附劑；
所述聚醯胺吸附劑質量與所述水溶性銀杏葉提取物的水溶液的質量比為1:1；
所述洗脫液的流速為5ml/min，每10分鐘計作1流分，進行薄層層析定性監控，防止流速過快帶出銀杏酸，6～8小時完成25升水溶性銀杏葉提取物的水溶液通過聚醯胺吸附柱。
由上述方法製備得到的水溶性銀杏葉提取物，其銀杏酸含量小於1ppm。
本研究採用的銀杏酸含量測定方法見《中國藥典》2015版銀杏葉提取物的相關項目：高效液相分離的色譜法(通則0512)測定。
銀杏酸為6-烷基或烯基水楊酸，其結構中雖有芳羥基和羧基等極性基團，但因6位上的側鏈具有碳數為13至17的長鏈，使得銀杏酸為脂溶性成分，顯弱極性可溶於非極性溶劑，難溶於水。基於上述原理，本發明採用了將銀杏酸含量較低的水溶性銀杏葉提取物的水溶液用聚醯胺吸附柱吸附法脫酸，減少了後續去除助溶劑等的步驟，方法簡便，可操作性強，成本低，有效成分提高，有害成分銀杏酸可降低到小於1ppm。選擇粒度為100～300目的聚醯胺吸附劑吸附分離銀杏酸的效果最佳。吸附劑質量與投料質量為1:1～1:3，選擇其他比例會影響產品質量和生產成本。洗脫液的流速為2ml/min～5ml/min，流速太快會影響銀杏酸的吸附分離，流速太慢必然延長生產時間增加成本。
本發明人用水溶性銀杏葉提取物為原料，對其進行進一步提純，所得產品能直接進行調味，灌裝，極大地簡化了生產步驟，減少了生產成本；同時，在此精製過程中沒有用到任何有機溶劑，沒有了殘留溶劑的威脅；此外，在降低銀杏酸含量方面，把銀杏酸含量降低到1ppm以下，效果突出；最後，本發明得到的產品有效成分含量高，將洗脫液濃縮乾燥得到粉末，總黃酮質量分數大於24％，內酯含量大於6％，冷水溶解度大於5g/100ml。
專利的價值不僅僅在於理論，而且需要體現出在生產實踐中的可操作性、可重複性和適合規模化生產，同時整個工藝過程還要確保符合國家食品藥品監督局的質量標準。
在有關降低銀杏酸專利的檢索中發現，很多文獻中的生產流程只顧及降低銀杏酸的指標，沒有考慮國家食品藥品監督局對產品的質量標準要求。中國藥典2015版規定銀杏提取物(總黃酮)的提取溶劑為70％稀乙醇，其它如用鹽酸或水等提取方法都存在質量風險。
本申請整個工藝流程充分考慮了上述因素和風險，在生產實踐中工人易學，操作簡便，得到的產品安全有效，符合國內國際標準的要求。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發明做進一步的詳細說明，需要聲明的是，下述實施例僅作為解釋和說明，不構成對本發明保護範圍的限制。
試劑來源：
脂溶性銀杏葉提取物：購於山東仁和藥業商家，規格型號總黃酮佔24％，內酯6％。該脂溶性銀杏葉提取物是按照中國藥典2015版規定的方法製備得到的，即該脂溶性銀杏葉提取物(總黃酮)的提取溶劑為70％稀乙醇，其它如用鹽酸、水提取等方法都存在質量風險。
25％的乙醇為自行配製，25％乙醇是指其中所含乙醇體積百分比。
實施例1、製備低酸水溶性銀杏葉提取物
取脂溶性銀杏葉提取物2000克，加50℃的22％的乙醇15立升(1500ml)充分攪拌使其溶解，放冷後放置過夜，過濾得濾液A，濾渣烘乾保留。
將濾液A放置於減壓罐內減壓，回收乙醇至無醇味，在回收乙醇過程中要不斷向濾液A中添加52℃熱水10立升(10000毫升)，使固體的重量含量佔溶劑的體積分數控制在7％，放置室溫過夜，過濾得濾液B，即水溶性銀杏葉提取物。取樣檢測其總黃酮含量、內脂含量以及銀杏酸含量，檢測方法均按中國藥典2015版銀杏葉提取物項下的規定，高效液相色譜法(通則0512)。結果：總黃酮含量25.5％，內脂含量7％，銀杏酸含量小於5ppm。
向上述的濾液B中直接添加純淨水至400立升，得水溶性銀杏葉提取物溶液，其質量百分比濃度為8％。
將得到的水溶性銀杏葉提取物溶液上300目聚醯胺吸附柱，該聚醯胺吸附柱規格為5cm×120cm，層析柱裝填有粒度300目的聚醯胺吸附劑2000克(購自國藥集團化學試劑有限公司，Q/CYDZ 2305-2009)，吸附劑質量與投料質量為1:1，洗脫液流速為5ml/min，每10分鐘計作1流分，進行薄層層析定性監控，防止流速過快帶出銀杏酸，約6至8小時完成25升溶液通過聚醯胺吸附柱，再用4-5倍柱體積的純化水洗脫，收集上樣流出液、柱內的殘液和洗脫液，減壓濃縮，真空乾燥至變成粉末。
洗脫液經濃縮乾燥，得到水溶性銀杏葉提取物粉末。測定銀杏酸、銀杏總黃酮、銀杏總內酯含量，其檢測方法均按中國藥典2015版銀杏葉提取物項下的規定，高效液相色譜法(通則0512)。
結果：銀杏酸含量為0.65ppm；冷水溶解度大於5g/100ml；總黃酮含量25％，內脂含量6.5％。
實施例2、製備低酸水溶性銀杏葉提取物
取脂溶性銀杏葉提取物2000克，加50℃的28％的乙醇15立升(1500ml)充分攪拌使其溶解，放冷後放置過夜，過濾得濾液A，濾渣烘乾保留。
將濾液A放置於減壓罐內減壓，回收乙醇至無醇味，在回收乙醇過程中要不斷向濾液A中添加52℃熱水10立升(10000毫升)，使固體的重量含量佔溶劑的體積分數控制在9％，放置室溫過夜，過濾得濾液B，即水溶性銀杏葉提取物。取樣檢測其總黃酮含量、內脂含量以及銀杏酸含量，檢測方法均按中國藥典2015版銀杏葉提取物項下的規定，高效液相色譜法(通則0512)。結果：總黃酮含量26％，內脂含量6.2％，銀杏酸含量小於5ppm。
向上述的濾液B中直接添加純淨水至400立升，得水溶性銀杏葉提取物溶液，其質量百分比濃度為8％。
將得到的水溶性銀杏葉提取物溶液上200目聚醯胺吸附柱，吸附劑質量與投料質量為1:1，洗脫液流速為3ml/min，其他條件與實施例1相同。
結果：銀杏酸含量為0.85ppm；冷水溶解度大於5g/100ml；總黃酮含量25.8％，內脂含量6.0％。
實施例3、製備低酸水溶性銀杏葉提取物
取脂溶性銀杏葉提取物2000克，加50℃的20％的乙醇15立升(1500ml)充分攪拌使其溶解，放冷後放置過夜，過濾得濾液A，濾渣烘乾保留。
將濾液A放置於減壓罐內減壓，回收乙醇至無醇味，過濾得濾液B，即水溶性銀杏葉提取物。取樣檢測其總黃酮含量、內脂含量以及銀杏酸含量，檢測方法均按中國藥典2015版銀杏葉提取物項下的規定，高效液相色譜法(通則0512)。結果：總黃酮含量25％，內脂含量6.5％，銀杏酸含量小於10ppm。
將得到的水溶性銀杏葉提取物溶液上100目聚醯胺吸附柱，吸附劑質量與投料質量為1:3，洗脫液流速為2ml/min，其他條件與實施例1相同。
結果：銀杏酸含量為1.2ppm；冷水溶解度大於5g/100ml；總黃酮含量24.6％，內脂含量6.1％。
實施例4、製備低酸水溶性銀杏葉提取物
取脂溶性銀杏葉提取物2000克，加50℃的60％的乙醇15立升(1500ml)充分攪拌使其溶解，放冷後放置過夜，過濾得濾液A，濾渣烘乾保留。
將濾液A放置於減壓罐內減壓，回收乙醇至無醇味，過濾得濾液B，即水溶性銀杏葉提取物。取樣檢測其總黃酮含量、內脂含量以及銀杏酸含量，檢測方法均按中國藥典2015版銀杏葉提取物項下的規定，高效液相色譜法(通則0512)。結果：總黃酮含量24.2％，內脂含量5.8％，銀杏酸含量小於10ppm。
將得到的水溶性銀杏葉提取物溶液上100目聚醯胺吸附柱，吸附劑質量與投料質量為1:3，洗脫液流速為2ml/min，其他條件與實施例1相同。
結果：銀杏酸含量為1.1ppm；冷水溶解度大於5g/100ml；總黃酮含量24％，內脂含量5.5％。
實施例5、製備低酸水溶性銀杏葉提取物
取乾燥銀杏葉提取物1kg，以65℃熱水攪拌溶解，濾過，濾渣再以熱水溶解3次，濾過，合併濾液。濾液加純化水稀釋至15L，相對密度1.01，得到水溶性銀杏葉提取物水溶液。
將得到的水溶性銀杏葉提取物水溶液上300目聚醯胺吸附柱，吸附劑質量與投料質量為1:1，洗脫液流速為5ml/min，其他條件與實施例1相同。
取樣檢測其總黃酮含量、內脂含量以及銀杏酸含量，檢測方法均按中國藥典2015版銀杏葉提取物項下的規定，高效液相色譜法(通則0512)。結果：總黃酮含量20％，內脂含量5.9％，銀杏酸含量1.5ppm。
實施例6、溶劑萃取法
依據申請號為02113531.2的名稱為「用萃取法從銀杏葉提取物中脫銀杏酸的工藝」的發明專利，按照其中實施例1中的步驟，將銀杏葉去雜，溶解，過濾，萃取，乾燥，其中去雜工序是將粉碎後的銀杏葉提取物加入乙醇攪拌，溶解，過濾，乾燥後完成的，溶解工序是取銀杏葉提取物加入甲醇後在室溫——攝氏60度的夾層鍋中內加熱溶解，過濾，收集甲醇溶液，萃取工藝是這樣進行的：取甲醇濾液加入萃取器中，加入石油醚，震搖後靜置分層，去除上層後，取下層物質繼續在加入石油醚，震搖後靜置分層，如此重複3-7次，將下層物質放在乾燥設備中進行乾燥程序。
取樣檢測其總黃酮含量、內脂含量以及銀杏酸含量，檢測方法均按中國藥典2015版銀杏葉提取物項下的規定，高效液相色譜法(通則0512)。結果：總黃酮含量24％，內脂含量6％，銀杏酸含量小於10ppm。
實施例7、大孔樹脂吸附法
依據申請號為201110026813.4，名稱為「超聲提取製備低酸值銀杏提取物的方法」的發明專利，按照其中實施例1中的步驟：
(1)將銀杏葉在60℃的條件下烘乾24h，並粉碎得到100目的銀杏葉粉末；
(2)將步驟(1)得到的銀杏葉粉末與濃度為10％的乙醇溶液混合，銀杏粉末與乙醇溶液的比例為1g:5ml，在30℃的條件下超聲提取15分鐘得到提取液，超聲頻率為20Hz；
(3)將步驟(2)得到的提取液減壓濃縮除去乙醇後，得到濃縮液，減壓濃縮的真空度為0.05MPa；向濃縮液中加入沉澱劑MgCl2的飽和溶液，直至濃縮液的pH值為5；經抽濾後得到清夜；
(4)將步驟(3)得到的清夜經AB-8大孔樹脂柱富集，以使清夜中的銀杏提取物成分富集在樹脂上，清夜與樹脂的體積比是5:1，清夜的流速是0.5ml/min；用洗脫劑對大孔樹脂進行洗脫，將樹脂上富集的銀杏提取物成分洗脫下來，洗脫機的流速是1ml/min，洗脫劑與樹脂的體積比是2:1；收集過柱液，即經洗脫劑洗脫下來的液體；所使用的AB-8打孔樹脂的廠家為上海摩速科學器材有限公司；所述洗脫劑為濃度為50％的乙醇溶液；
(5)將步驟(4)收集的過柱液減壓濃縮後再經高壓噴霧乾燥，即得到所述的銀杏提取物；減壓濃縮的真空度為0.05MPa，乾燥溫度為300℃，高壓噴霧乾燥的壓力為2MPa，乾燥時間為10秒。銀杏提取物的產品得率為1.17％，經檢測其中銀杏黃酮含量為21.53％，銀杏內脂含量為5.32％，銀杏酚酸含量大於10ppm。
以上詳細描述了本發明的較佳的具體的實施例。應當理解，本領域普通技術人員無需付出創造性的勞動就可以根據本發明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡是本領域技術人員依照本發明的構思在現有技術的基礎之上通過邏輯分析、推理或者是有限次的實驗可以得到的技術方案，皆應在本發明權利要求書所確定的保護範圍之內。