一種基於微流控晶片的細胞非接觸培養方法與流程

2023-06-17 01:52:22

本申請屬於細胞培養技術領域，特別是涉及一種基於微流控晶片的細胞非接觸培養方法。

背景技術：

細胞是生物體結構和功能的基本單位，細胞與細胞之間相互交流從而構成了完整的個體，研究細胞間相互作用，是當今醫學和生物界的研究熱點，是探索生命奧秘和治療疾病的關鍵。

細胞共培養是研究細胞間相互作用的重要方法，傳統的細胞共培養方法可以分為直接接觸式(混合)共培養和非直接接觸式共培養。直接接觸式共培養將兩種及兩種以上細胞按照一定比例混合培養，但是兩種細胞分離較困難，不便於觀察和後續檢測。非直接接觸式共培養是指將兩種及兩種以上細胞分別接種於不同的載體上，然後將這些載體置於同一個培養環境之中，如Transwell小室共培養方法，然而這種方法無法動態觀察細胞行為變化，細胞用量多，無法實施流體控制。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種基於微流控晶片的細胞非接觸培養方法，以克服現有技術中的不足。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

本申請實施例公開一種基於微流控晶片的細胞非接觸培養方法，包括步驟：

(1)、提供一微流控晶片，該晶片包括基材以及形成於所述基材內的溝 道，所述溝道包括培養主通道、以及連通於所述培養主通道一端的至少3個分支通道，每個所述分支通道分別形成有一與外部連通的進樣口，所述培養主通道的另一端形成有與外部連通的出樣口和細胞代謝物收集口，所述進樣口和出樣口之間形成有高度差，所述至少3個分支通道由1個培養基通道和至少2個細胞通道組成，其中所述細胞通道與所述培養基通道相鄰並分設於所述培養基通道的四周；

(2)、從培養基通道的進樣口加入空白培養基，同時在細胞通道的進樣口分別加入不同種細胞懸液，控制微流體的層流速度，不同種細胞緩慢且平行植入微流控晶片中培養主通道中不同區域，中間形成空白區域；

(3)、細胞培養；

(4)、細胞活性驗證。

優選的，在上述的基於微流控晶片的細胞非接觸培養方法中，所述步驟(3)中，將微流控晶片置於37℃的5％CO2環境中進行細胞培養。

優選的，在上述的基於微流控晶片的細胞非接觸培養方法中，所述步驟(4)中，形成細胞單層後，用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)雙染法檢測細胞活性。

優選的，在上述的基於微流控晶片的細胞非接觸培養方法中，所述培養方法的應用包括：

通過顯微鏡實時觀察細胞遷移行為，評價細胞間互相作用；

細胞形成細胞單層後，通過顯微鏡觀察細胞形態變化，評價細胞間互相作用；

細胞形成細胞單層後，共培養一段時間，原位檢測細胞蛋白表達的變化；

細胞形成細胞單層後，共培養一段時間，收集晶片內細胞培養液，分析培養液內細胞因子等分泌水平，評價細胞間相互作用。

優選的，在上述的基於微流控晶片的細胞非接觸培養方法中，所述不同種細胞懸液包括肺癌細胞A549和人肺成纖維細胞HLF。

優選的，在上述的基於微流控晶片的細胞非接觸培養方法中，所述基材包括上下封接的上層和下層，所述上層的材質為PDMS，所述下層的材質為玻璃或培養皿。

優選的，在上述的基於微流控晶片的細胞非接觸培養方法中，所述主通道和分支通道位於同一平面，各分支通道的寬度和長度相同。

本發明可在一塊幾平方釐米的晶片上進行異種細胞非接觸式共培養。相對於傳統的研究方法，本發明具有操作簡單、製作簡單和樣品用量少等特點，避免了劃痕或胰酶消化形成創口過程中對細胞造成的傷害，並且在顯微鏡下可以直觀區分不同種細胞並觀察細胞在生長過程中的形態、遷移、轉分化等生物學行為，進而分析細胞間互相作用，在細胞生物學和藥物篩選等相關領域中具有良好的應用前景。

附圖說明

為了更清楚地說明本申請實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本申請中記載的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1所示為本發明具體實施例中微流控晶片的結構示意圖；

圖2所示為本發明具體實施例中不同種細胞植入後的顯微鏡實時拍攝照片；

圖3所示為本發明具體實施例中顯微鏡下細胞的生長狀態，觀察細胞形態、增殖、遷移等生物學行為的記錄照片。

具體實施方式

微流控晶片作為一種新型的分析檢測平臺，具有小型化、集成化、高通量、低能耗、分析快速等特性，已在眾多領域獲得了廣泛應用。藉助微流控晶片的微結構模擬細胞生存環境、實現多細胞快速、高效共培養，將成為細胞生物學研究的重要平臺。本發明以微流控晶片為平臺，建立了異種細胞非接觸式共培養平臺，與顯微鏡等電子設備相結合，無需染色等操作即可區分不同種細胞並實時監控細胞在相互作用條件下的生物學行為變化。其微米級的通道，能經濟合理地利用細胞和試劑等資源，非常適合進行細胞功能研究。

為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面結合附圖對本發明的具體實施方式進行詳細說明。這些優選實施方式的示例在附圖中進行了例示。附圖中所示和根據附圖描述的本發明的實施方式僅僅是示例性的，並且本發明並不限於這些實施方式。

結合圖1所示，微流控晶片，包括基材以及形成於基材內的溝道，基材包括上下封接的上層1和下層2，上層的材質優選為PDMS，下層的材質優選為玻璃或培養皿，上層材料經等離子體處理後與玻璃材料或培養皿等材料不可逆封接，保持PDMS表面親水性。溝道包括培養主通道3、以及連通於培養主通道一端的至少3個分支通道8，每個分支通道分別形成有一與外部連通的進樣口4、5和6，培養主通道的另一端形成有與外部連通的出樣口和細胞代謝物收集口7，進樣口和出樣口之間形成有高度差，至少3個分支通道由1個培養基通道和至少2個細胞通道組成，其中細胞通道與培養基通道相鄰並分設於培養基通道的四周。

進一步地，主通道和分支通道位於同一平面，各分支通道的寬度和長度相同。

微流控晶片的製作方法包括步驟：

(1)用計算機輔助設計軟體(CAD)設計微流控晶片的微通道與微結構；

(2)通過軟光刻法、模塑法在PDMS材料表面製備微通道、進樣口以及出樣口結構；

(3)將PDMS高壓滅菌後，上下兩層材料分別進行紫外照射滅菌處理，最後用等離子體活化PDMS晶片表面30-45s，並與玻璃或培養皿等材料不可逆封接。

利用微流控晶片進行不同細胞共培養的方法包括(以3個分支通道為例)：

(1)用PBS潤洗微通道，排除微通道中氣泡。

(2)向晶片中加入與培養細胞相同的培養基預處理1-2h。

(3)分別從進樣口4、進樣口6加入等量的不同種細胞懸液(肺癌細胞A549、人肺成纖維細胞HLF)，同時從中間進樣口5加入空白培養基，控制左、中、右三個樣品與出樣口的液面高度差，驅動樣品平行進入主通道，控制層流速度，使兩種細胞懸液緩慢且平行流入細胞培養主通道，從而完成不同種 細胞的同時植入，兩種細胞植入時不混合，中間形成空白區域，如圖2所示。

(4)將晶片放入37℃的5％CO2培養環境中培養細胞，在顯微鏡下實時觀察記錄細胞的生長狀態，觀察細胞形態、增殖、遷移等生物學行為，結合圖3所示。

(5)將晶片放入37℃的5％CO2培養環境中培養細胞，採用Hoechst33342和PI雙染法檢測兩種細胞(A549、HLF)的活性，結果顯示兩種細胞在該晶片上的成活率均大於90％。

在其他實施例中，細胞活性檢測方法如DAPI/PI,Calcein-AM/PI等活細胞、死細胞原位雙染法也可以。確認細胞有活性後，再進行研究。

基於上述晶片和培養方法，本案具有如下優點：

1、異種細胞通過微流體層流特性平行植入到主通道，中間形成空白區域，不用染色等操作就能夠直接區分不同種細胞。

2、可通過顯微鏡實時觀測細胞形態變化及遷移過程，且進行轉分化研究。

3、細胞在晶片內能保持良好活性，可培養到生長對數期狀態。

4、異種細胞在主通道內固定在各自特定培養區域，沒有物理接觸，但是處在相同培養環境，可以通過旁分泌信號相互影響。

5、在加入細胞時，細胞不會串流到空白區域；待細胞貼壁後才進入遷移區域。

6、形成的空白區域用於細胞遷移運動，空白區域與細胞培養區域界線明顯，沒有細胞碎片或其他雜質，避免了物理劃痕、胰酶消化等方法對細胞造成的傷害。細胞之間空白區域的寬度可以通過樣品的加入量調控。

7、以不同液面高度產生的壓力差作為微流體流動的驅動力，無需外部驅動裝置，設備簡單、便於操作、樣品及試劑消耗量少且可直觀、真實反映人體細胞間相互作用。

8、可以通過增加晶片分支通道的數量進而增加層流的微流體股數，完成多種細胞在晶片上非接觸共培養。

在此，還需要說明的是，為了避免因不必要的細節而模糊了本發明，在附圖中僅僅示出了與根據本發明的方案密切相關的結構和/或處理步驟，而省略了與本發明關係不大的其他細節。

最後，還需要說明的是，術語「包括」、「包含」或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設備所固有的要素。