Glyt1轉基因小鼠的製作方法

2023-05-17 20:32:51 1

專利名稱：Glyt1轉基因小鼠的製作方法
背景技術：
甘氨酸是脊髓和腦幹主要的抑制性神經遞質，也是NMDA受體的輔助興奮劑。甘氨酸的細胞外濃度至少由兩個Na+/Cl+-依賴的甘氨酸轉運蛋白(GLYT1和GLYT2)調節，所述轉運蛋白通過將甘氨酸重吸收進突觸前神經末端及圍繞的纖細的神經膠質突起中，在終止突觸後甘氨酸能的作用以及保持甘氨酸的細胞外低濃度方面發揮著重要的作用。GLYT2在齧齒動物的脊髓、腦幹和小腦高水平表達，在這些部位，其表達與馬錢子鹼敏感的甘氨酸受體的存在緊密相關(Zafra，F.，等人，J Neurosci，1995.15(5 Pt2)p.3952-69；Luque，J.M.，N.Nelson和J.G.Richards，Neuroscience，1995.64(2)p.525-35和Jursky，F.和N.Nelson，J Neurochem，1995.64(3)p.1026-33)。免疫組織化學分析表明在推定的甘氨酸能突觸中主要定位於突觸前(Zafra，F.，等人，J Neurosci，1995.15(5 Pt 2)p.3952-69；Spike，R.C.，等人，Neuroscience，1997.77(2)p.543-51)，這強烈暗示了在甘氨酸能抑制性突觸傳遞的終止中的作用。人的GLYT2已經被克隆，並且似乎表現出相似的表達模式(Morrow，J.A.，等人，FEBS Lett，1998.439(3)p.334-40)。GLYT2具有一定程度的異質性。事實上已經在齧齒動物的腦中鑑定了兩種GLYT2同種型(2a和2b)。
通過對於肌氨酸和甘氨酸的N-甲基化衍生物阻斷的敏感性，可以從藥理學上區分GLYT1和GLYT2(Liu，Q.R.，等人，J Biol Chem，1993.268(30)p.22802-8，Kim，K.M.，等人，Mol Pharmacol，1994.45(4)p.608-17)。已經克隆了人glyt1基因，該基因編碼GLYT1a、1b、1c和1d 4個同種型(Kim，K.M.，等人，Mol Pharmacol，1994.45(4)p.608-17)，而已經鑑定的大鼠同種型只有GLYT1a和1b兩種(Guastella，J.，等人，Proc Natl Acad SciUSA，1992.89(15)p.7189-93；Smith，K.E.，等人，Neuron，1992.8(5)p.927-35；Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)p.851-63)。GLYT1似乎在大鼠CNS的神經膠質和神經元中都有表達(Zafra，F.，等人，J Neurosci，1995.15(5 Pt 2)p.3952-69；Smith，K.E.，等人，Neuron，1992.8(5)p.927-35；Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)p.851-63；Zafra，F.，等人，Eur J Neurosci，1995.7(6)p.1342-52)，GLYT1a在灰質和一些外周組織有明顯表達，而GLYT1b只在CNS的白質有表達(Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)p.851-63)。在人類中，針對所有GLYT1同種型的通用探針揭示出GLYT1在一些外周組織有表達，最顯著的是腎，而GLYT1c似乎是大腦特異的(Kim，K.M.，等人，Mol Pharmacol，1994.45(4)p.608-17)。GLYT1的同種型只在它們的氨基端和5』非編碼區存在差異(Kim，K.M.，等人，Mol Pharmacol，1994.45(4)p.608-17；Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)p.851-63)。GLYT1a和GLYT1b來源於從交替的啟動子指導進行的轉錄，而人GLYT1c則是GLYT1b轉錄物的剪接變體(Kim，K.M.，等人，Mol Pharmacol，1994.45(4)p.608-17；Adams，R.H.，等人，J Neurosci，1995.15(3 Pt 2)p.2524-32；Borowsky，B.和B.J.Hoffman，J Biol Chem，1998.273(44)p.29077-85)。由於在發表的研究之間明顯存在主要分歧，GLYT1的外周表達和同種型不同的CNS表達模式具有一定的爭議。GLYT1在脊髓、腦幹和間腦中與GLYT2一同表達。有趣的是，GLYT1在沒有發現功能抑制性甘氨酸能神經元的前腦區域(如腦皮層、海馬、嗅球)也有表達(Zafra，F.，等人，J Neurosci，1995.15(5 Pt 2)p.3952-69；Guastella，J.，等人，ProcNatl Acad Sci USA，1992.89(15)p.7189-93；Smith，K.E.，等人，Neuron，1992.8(5)p.927-35；Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993 Eur J Neurosci，1995.7(6)p.1342-52)，由此暗示GLYT1的其它作用，這些作用可能包括調節NMDA受體介導的神經傳遞(Smith，K.E.，等人，Neuron，1992.8(5)p.927-35)。
NMDA受體的激活需要穀氨酸和甘氨酸的結合。儘管穀氨酸以活性依賴的方式從突觸前末端釋放，但甘氨酸明顯以更穩定的水平存在，表明具有更多的調節功能。對細胞外和腦脊液中甘氨酸濃度的測量表明甘氨酸以較低的微摩爾水平存在(Westergren，I.等人，J Neurochem，1994.62(1)p.159-65)。然而，甘氨酸轉運蛋白可以在NMDA受體的局部微環境顯著降低甘氨酸濃度。事實上，GLYT1b在非洲爪蟾(Xenopus)卵母細胞中的表達已經被證明可以在共表達的NMDA受體位置降低甘氨酸濃度(Supplisson，S.和C.Bergman，J Neurosci，1997.17(12)p.4580-90)。此外，最進的研究表明甘氨酸攝取機制可以調節突觸NMDA受體活性(Berger，A.J.，S.Dieudonne，和P.Ascher，J Neurophysiol，1998.80(6)p.3336-40；Bergeron，R.，等人，Proc Natl Acad Sci USA，1998.95(26)p.15730-4)。NMDA受體NR2亞基的性質影響受體對甘氨酸的親和力，並且在重組系統中，含有NR2A的受體相對於含有NR2B、C或D的受體表現出明顯降低的甘氨酸親和力(Ikeda，K.，等人，FEBS Lett，1992.313(1)p.34-8；Kutsuwada，T.，等人，Nature，1992.358(6381)p.36-41；Priestley，T.，等人，Mol Pharmacol，1995.48(5)p.841-8)。在成熟過程中產生一組具有明顯較低甘氨酸親和力的NMDA受體，表明在正常生理條件下存在一組不被甘氨酸所飽和的NMDA受體，此組受體的產生與發育中NR2A表達的增加相平行(Kew，J.N.，等人，J Neurosci，1998.18(6)p.1935-43)。
穀氨酸神經傳遞(特別是NMDA受體活性)在突觸可塑性、學習和記憶方面具有關鍵作用，如表現為門控突觸可塑性和記憶形成閾值的分級開關(graded switch)的NMDA受體(Hebb，D.，The organization of behavior.1949，New YorkWiley；Bliss，T.V.和G.L.Collingridge，Nature，1993.361(6407)p.31-9)。過表達NMDA NR2B亞基的轉基因小鼠表現出增強的突觸可塑性和優越的學習及記憶能力(Tang，Y.P.，等人，Nature，1999.401(6748)p.63-9)。
NMDA受體的機能減退與精神分裂症的病理生理學有關(Olney，J.W.和N.B.Farber，Arch Gen Psychiatry，1995.52(12)p.998-1007；Hirsch，S.R.，等人，Pharmacol Biochem Behav，1997.56(4)p.797-802)。非競爭性NMDA受體拮抗劑(如PCP和氯胺酮(ketamine))能夠誘導精神分裂症-樣精神病(schizophrenia-like psychosis)(Allen，R.M.和S.J.Young，Am JPsychiatry，1978.135(9)p.1081-4；Javitt，D.C.和S.R.Zukin，Am JPsychiatry，1991.148(10)p.1301-8；Krystal，J.H.，等人，Arch GenPsychiatry，1994.51(3)p.199-214)，所述精神病整合了陽性和陰性症狀以及認知功能障礙，因此與患者的精神分裂症非常相似(Javitt，D.C.，等人，Biol Psychiatry，1999.45(6)p.668-79)。NMDAR1亞基表達水平有所降低的轉基因小鼠表現出相似於在藥理學誘導的精神分裂症模型上觀察到的行為異常，這支持了NMDA受體活性降低導致精神分裂症-樣行為的模型(Mohn，A.R.，等人，Cell，1999.98(4)p.427-36)。此外，缺乏NMDA受體2A亞基的小鼠在新環境中表現出自發運動性增強，並且除海馬LTP和空間學習方面的缺陷外，在覓水任務(water-finding task)中還表現出潛在的學習受損(Miyamoto Y，Yamada K，Noda Y，Mori H，Mishina M和Nabeshima T，J Neurosci.2001 21(2)750-757)。
過度產生GLYT1的小鼠為評估GLYT1的生理功能提供了一種有用的工具。這些小鼠應該在前腦表現出降低的甘氨酸水平，並且可以將它們用於研究NMDA受體甘氨酸位點佔據的活性調節對於NMDA受體的生理功能是否重要這一問題。
發明概述本發明提供用於產生非人類轉基因動物的遺傳構建體和方法，所述轉基因動物的基因組中含有編碼GLYT1的轉基因DNA。還可以使用這些轉基因動物來產生過表達活性GLYT1的轉基因動物。此外，也提供所述過表達GLYT1蛋白質的轉基因動物和產生它們的方法。本發明也涉及這些動物作為模型在分析抑制突觸NMDA受體功能的效果和研究化合物減輕精神病行為症狀的能力中的用途。
因此，本發明提供含有編碼GLYT1的DNA序列的遺傳構建體，所述DNA序列與啟動子有效連接。glyt1基因的序列可能編碼GLYT1的同種型。優選glyt1基因序列編碼GLYT1b。
優選glyt1基因序列是cDNA序列。更優選此cDNA整合至少一個內含子序列。最優選的是，所述至少一個內含子序列含有聚腺苷酸化位點。
glyt1基因的序列可以來源於任何動物，優選glyt1序列來源於哺乳動物，更優選glyt1基因序列是人的序列。
啟動子可以是神經元啟動子。在一個實施方案中，啟動子是組織特異的啟動子。組織特異的啟動子可以是任何以組織特異的方式(如在腦組織中、肌肉組織中、肝臟組織中、腎臟組織中等等)控制和指導基因表達的啟動子。優選在前腦中提供特異表達的啟動子。最優選的啟動子是小鼠CamKαII啟動子。
啟動子也可以是可控制的啟動子。可控制的啟動子可以是任何以可調節和/或可誘導的方式(如通過添加特異的誘導物或阻遏物物質)來控制轉基因表達的啟動子。本領域已知若干可誘導的細菌啟動子(Schultze N，Burki Y，Lang Y，Certa U，Bluethmann H；Nat Biotechnol 1996；14(4)499-503；van der Neut R；Targeted gene disruptionapplications inneurobiology；Neurosci Methods 1997；71(1)19-27；Liu HS，Lee CH，LeeCF，Su IJ，Chang TY；Lac/Tet dual-inducible system functions inmammalian cell lines.Biotechniques.1998；24(4)624-8，630-2)。
優選的遺傳構建體是如

圖1所描述的遺傳構建體。
這裡使用的術語「轉基因DNA」描述人工引入並整合進生物的DNA。
這裡使用的術語「glyt1基因序列」描述編碼GLYT1的DNA序列。
本發明還提供產生非人類轉基因動物的方法，所述轉基因動物基因組中含有編碼GLYT1的轉基因DNA，所述方法包括a)向非人類受精卵或非人類胚胎幹細胞引入如上描述的遺傳構建體，b)從所述受精卵或胚胎幹細胞製備非人類轉基因動物，並由此，c)產生基因組中含有編碼GLYT1的轉基因DNA的非人類轉基因動物。
本發明的另一實施方案提供產生表達轉基因GLYT1的非人類轉基因動物的方法，包括a)向非人類動物來源的非人類受精卵或非人類胚胎幹細胞引入如上描述的遺傳構建體，b)從所述受精卵或胚胎幹細胞製備轉基因動物，並由此，c)產生表達轉基因GLYT1的非人類轉基因動物。
優選的用於如上描述的方法的受精卵是C57BL/6J受精卵。也可用於本發明方法中的本領域所使用的受精卵包括(但不限於)FVB/N受精卵、BALB/c受精卵、DBA/1受精卵和DBA/2受精卵。
優選的用於如上描述的方法的胚胎幹細胞是C57BL/6J胚胎幹細胞。也可用於本發明方法中的本領域所使用的幹細胞包括(但不限於)BALB/c胚胎幹細胞、DBA/2J胚胎幹細胞、CBA/J胚胎幹細胞和129系小鼠的胚胎幹細胞系。
受精卵或胚胎幹細胞可以來源於任何非人類動物。優選受精卵或胚胎幹細胞來源於嚙齒類。更優選受精卵或胚胎幹細胞來源於小鼠。
可以通過DNA的微注射來向受精卵引入遺傳構建體。可以通過病毒感染來向胚胎幹細胞引入遺傳構建體。
例如，可以通過微注射後培養受精卵、將培養的受精卵轉移到假孕的非人類動物中並生育非人類轉基因動物來產生上文所述方法的非人類轉基因動物。
這裡使用的術語「轉基因GLYT1」描述人工引入並整合進生物的DNA產生的GLYT1蛋白質。
這裡使用的術語「轉基因動物」描述基因組中含有轉基因DNA的動物。此轉基因DNA可能整合在基因組的某處。
本發明還提供由以上描述的任何方法所產生的非人類轉基因動物。
在本發明的一個實施方案中，提供非人類轉基因動物，所述轉基因動物基因組中含有編碼GLYT1的轉基因DNA。在一個優選的實施方案中，非人類轉基因動物含有如圖1所描述的遺傳構建體。
在另一實施方案中，提供表達轉基因GLYT1的非人類轉基因動物。在一個優選的實施方案中，組織特異性(即在大腦中)表達轉基因GLYT1。在一個更優選的實施方案中，轉基因GLYT1在非人類轉基因動物的前腦特異表達。在另一實施方案中，轉基因GLYT1的表達是可控的，如通過加入特異的誘導物或阻遏物物質。
在描述的過度產生GLYT1蛋白質的非人類轉基因動物中，預期可以通過改變內源甘氨酸的水平體內調整NMDA受體活性。由於在海馬和大腦皮層區缺乏GLYT2受體，這些區域的GLYT1過表達導致穀氨酸能突觸中甘氨酸水平的下降，並因此抑制NMDA受體的功能。因此，預期過表達GLYT1的突變小鼠會發展出與精神分裂症或認知缺損有關的行為改變和異常。
非人類轉基因動物可以是任何本領域已知的、可以用於本發明方法的非人類動物。優選的非人類轉基因動物是哺乳動物，更優選的非人類轉基因動物是齧齒動物。本發明最優選的轉基因動物是小鼠。
可以對上文描述的非人類轉基因動物進行遺傳、分子和行為分析。
本發明也涉及本發明提供的非人類轉基因動物與相同或其它基因型交配後產生的後代。
本發明還提供來源於本發明提供的非人類轉基因動物或其後代的細胞系或原代細胞培養物、組織及器官型腦片培養物(organotypic brain sliceculture)。
可以通過兩種方法製備基於細胞培養的模型。可以從非人類轉基因動物中分離細胞培養物，或從使用同樣的構建體、經標準的細胞轉染技術建立的細胞培養物中製備細胞培養物。
可以通過多種方法檢測含有轉基因DNA(編碼GLYT1)的遺傳構建體的整合，包括使用從兩到3周齡小鼠尾部活檢組織中分離的DNA進行基因組Southern印跡和PCR分析。
對於本領域技術人員而言，顯然存在許多可以用來檢測轉基因DNA表達的分析方法，包括在RNA水平的方法(包括通過逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)或通過Northern印跡、原位雜交的mRNA定量)和在蛋白質水平的方法(包括組織化學、免疫印跡分析和體外結合研究)。此外，可以通過本領域技術人員眾所周知的ELISA技術來定量目的基因的表達水平。
可以使用許多標準分析來完成定量測量。例如，可使用RT-PCR和包括RNA酶保護、Northern印跡分析、RNA斑點(RNA dot)分析在內的雜交方法測量轉錄水平。也可以使用免疫組織化學染色和Western印跡分析來評估是否存在轉基因GLYT1蛋白質。
還可通過本領域已知的方法(包括免疫組織化學、電子顯微鏡、磁共振成像(MRI))和關於神經學及認知功能的行為研究來描述本發明轉基因動物的特徵。行為測試的例子有自主行為(spontaneons behavior)測試、與認知功能有關的行為測試、藥理學幹擾的行為測試(pharmacologically-disrupted behavior)、握力測試、線操縱測試(wiremanoeuvre)、遊泳測試、旋轉杆測試(rotarod)、走動測試(locomotoractivity)、Morris水迷宮測試(Morris water maze)、Y-迷宮測試、明暗偏好測試(light-dark preference)、被動和主動迴避測試(avoidance test)。
本發明另一目的是所述非人類轉基因動物，或來自其的細胞系或組織或器官型腦片培養物，作為模型在研究化合物減輕精神病行為的能力中的用途。此外，這些轉基因動物，或來自它們的細胞或組織或器官型腦片培養物可以作為模型用於研究抑制突觸NMDA受體功能的效果。
在另一實施方案中，提供了用於評估GLYT1功能對NMDA受體活化的體內影響的方法，包括確定非人類轉基因動物中NMDA受體活性、突觸可塑性和行為(包括學習和記憶)，並將此NMDA受體活性、突觸可塑性和行為與對照的相比較，其中所述非人類轉基因動物的基因組中含有轉基因glyt1基因序列，從而過表達活性GLYT1蛋白質的。
對照可以包括任何非人類動物，其中沒有引入編碼GLYT1的轉基因DNA來過表達活性GLYT1蛋白質，或其中動物僅含有天然glyt7基因。評估的行為可以包括自主行為、與認知功能有關的行為(包括空間的短期和長期記憶、物體識別記憶、聯想情緒記憶、條件性恐懼消退(conditionedfear extinction))和藥理學幹擾的行為(包括藥物誘導的過多走動(hyperlocomotion)、藥物誘導的社交退縮(Social withdrawal)、藥物誘導的前脈衝抑制(prepulse inhibition)缺陷、和藥物誘導的記憶喪失)。
在另一實施方案中，提供測試GLYT1抑制劑化合物增強NMDA受體功能的能力的方法，所述方法包括向基因組中含有轉基因glyt1基因序列從而過表達活性GLYT1蛋白質的非人類轉基因動物，或來自它們的細胞系或原代細胞培養物或器官型腦片培養物施予GLYT1抑制劑化合物，並確定化合物的效果(包括行為、電生理學和組織學的評估)，及與對照的行為、電生理學和組織學相比較。
可以被用於本發明方法的GLYT1抑制劑化合物有本領域已知的任何GLYT1抑制劑化合物，包括(但不限於)ALX-5407(NPS Pharmaceuticals)和ORG-24598(Organon)。
對照可以包括任何動物、細胞系或原代細胞培養物或器官型腦片培養物或組織，其中沒有引入編碼GLYT1的轉基因DNA來過表達活性GLYT1蛋白質，或其中動物、細胞系或原代細胞培養物或器官型腦片培養物僅含有天然glyt1基因。評估的行為可以包括自主行為、與認知功能有關的行為(包括空間的短期和長期記憶、物體識別記憶、聯想情緒記憶、條件性恐懼消退)和藥理學幹擾的行為(包括藥物誘導的過多走動、藥物誘導的社交退縮、藥物誘導的前脈衝抑制缺陷、和藥物誘導的記憶喪失)。
本發明還涉及測試化合物增強NMDA受體活性的能力的試劑盒，所述試劑盒包括基因組中含有轉基因glyt1基因序列從而過表達活性GLYT1蛋白質的非人類轉基因動物，或來自它們的細胞系或原代細胞培養物或組織或器官型腦片培養物或組織，以及確定化合物是否表現出增強NMDA受體活性的能力的手段。
此外，本發明提供基因組中含有轉基因glyt1基因序列以致過表達活性GLYT1蛋白質的非人類轉基因動物、或來自它們的細胞系或原代細胞培養物或組織或器官型腦片培養物或組織作為模型在研究化合物對精神病行為的作用和測試化合物的GLYT1特異性抑制效果中的用途。
本發明還提供基本如這裡所描述的，在特別是在參考前述實施例之前所述的轉基因動物、方法、組合物、試劑盒和用途。
對本發明進行一般性的描述之後，結合以下附圖，參考具體的實施例，將會更好的理解本發明，這裡包含實施例只是為了舉例說明，而無限制的意圖(除非另有說明)。
附圖簡述圖1顯示遺傳構建體的示意圖，所述遺傳構建體含有小鼠CamKαII啟動子、整合內含子(I)的編碼人GLYT1b(hGlyt1b)的cDNA，其中有一個內含子含有多聚腺苷酸化位點(pA)。圖中給出了限制性位點。
圖2用於克隆glyt1b-cDNA的引物對(SEQ.ID NOs3至8)和用於驗證重組事件的引物對(SEQ.ID NOs9和10)的示意圖。
圖3轉基因盒CamKaII啟動子3』到glyt1b基因5』的PCR結果(SEQ.ID NOs9和10)。來自遺傳構建體的擴增子大小為1600bp。內源基因不產生擴增子。17-22F1小鼠，M標記。
實施例除非另有說明，實施例中涉及的商業獲得的試劑按照製造商的說明書使用。
實施例1小鼠的產生A)人GLYT1b cDNA的克隆基於發表的人glyt1b-cDNA序列信息(注GLYT1b序列作為1c序列被發表；SEQ.ID NOs1)設計引物(SEQ.ID NOs3至6)，通過嵌套PCR從全人腦的pACT2-cDNA文庫(Clontech)中克隆glyt1b-cDNA。將擴增的cDNA亞克隆進克隆載體pCI的NheI和EcoRI限制性位點(Promega；SEQ.ID NOs10)。
B)hGlyt1b轉基因的克隆使用引物huGlyt1b-2147FLAG-PvuII-rev(SEQ.ID NOs7)和huGlyt1b-234c(SEQ.ID NOs8)，從上述載體中再擴增人glyt1b cDNA。用PvuII切割擴增子，純化擴增子後將其克隆進pNN265載體(M.Mayford，E.Kandel，Columbia Universlty，New York，USA；Choi，T.，等人，Mol CellBiol，1991.11(6)p.3070-4)的EcoRV位點，以便加入內含子和pdyA序列，產生pNN265-hGlyt1b-FLAG載體。對cDNA部分進行測序並與發表的序列相比較，以確證使用Pwo-聚合酶擴增的正確性。沒有發現突變。
為了產生轉基因的前腦特異性神經元表達模式，將hGlyt1b-cDNA隨後克隆進含有小鼠CamKαII啟動子的載體(Mayford，M.，等人，Science，1996.274(5293)p.1678-83)。為此，用僅含有KpnI、HindIII和NotI限制性位點的最小克隆位點取代pBluescript II SK+質粒(Stratagene)的多克隆位點。此後，通過NotI和HindIII從pNN279載體(Mayford，M.，等人，Science，1996.274(5293)p.1678-83)移出啟動子-盒(SEQ ID NO2)，並克隆進修飾的pBluescript II SK+載體。通過NotI消化，從pNN265-hGlyt1b-FLAG中將hGlyt1b-cDNA連同周圍的內含子一同取走，並克隆進mCamKαII啟動子後唯一的NotI位點(圖1)。
C)轉基因小鼠的產生通過BssHII消化，從載體骨架上切下轉基因盒，並純化。以3ng/μl的濃度將DNA注入C57BL/6J受精卵(獲得自Jackson實驗室，600MainStreet，Bar Harbor，Maine 04609 USA)從而根據已確立的方法(Hogan，B.C.，F；Lacy，E，1986，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press)獲得轉基因小鼠。通過使用引物對pNN279-7431c(SEQ.ID NOs9)和huGlyt1b-786nc(SEQ.ID NOs10)，以PCR篩選後代的基因組DNA，所述PCR會因為轉基因的存在而擴增出1600bp的轉基因盒片段(圖2和圖3)。將這一篩選鑑定的建立者(founders)與C57BL/6J小鼠交配，以建立品系。
實施例2GLYT1b轉基因小鼠的分子分析
A)GLYT1b突變小鼠的組織學分析使用在兔和豚鼠體內激起的GLYT1特異的抗體，通過免疫組織化學和Western印跡分析確證GLYT1b在突變小鼠腦中的過表達。
B)GLYT1b突變小鼠的電生理分析誘導一定形式的長時程增強(LTP)需要NMDA受體的激活(Bliss，T.V.和G.L.Collingridge，Nature，1993.361(6407)p.31-9)。如先前所描述的(Kew，J.N.，等人，J Neurosci，2000.20(11)p.4037-49)，在整個強直後時期，比較GLYT1b轉基因小鼠與野生型對照的海馬切片中θ強直刺激(Burst Stimulation)誘導的增強。確定是否GLYT1b轉基因小鼠相比於野生型對照表現出不同水平的LTP增強。
C)前腦和腦幹突觸小體的製備處死小鼠，並在冰上解剖腦組織，在4℃進行隨後的操作。使用玻璃/特氟隆勻漿器(800rpm 10次)，在10vol(w/v)的10mM Tris-HCl(pH7.4，含有0.32M蔗糖)和1mM Pefabloc(蛋白酶抑制劑的混合物)(緩衝液A)中勻漿組織。將勻漿物在1300xg離心5分鐘。小心的傾析出上清液，並置於冰上，然後用5vol(依據原始重量)的緩衝液A懸浮沉澱，如描述的進行勻漿和離心。將第二次的上清液加入第一次的上清液，並在17000xg離心20分鐘。用5vol(依據原始重量)的Krebs-Ringer溶液(pH7.4，含有10mM葡萄糖)(KRB)懸浮產生的沉澱(突觸小體粗組分)。
D)甘氨酸攝取在96孔平板中進行分析。將小鼠前腦(0.1mg)和腦幹(0.05mg)突觸小體製備品的等分試樣在含有120nM[3H]甘氨酸、總體積為250μl的KRB中於22℃孵育30分鐘。通過迅速過濾到96孔Packard GF/B unifilter板上而終止孵育，隨後用冰冷卻的KRB洗滌3次。加入閃爍液後測量孔的放射性含量。
E)MK801的飽和結合在96孔深平板(deep plates)中進行分析。將小鼠前腦和腦幹突觸前小體製備品的等分試樣(0.07mg)在含有遞增濃度(0.03nM-300nM)的[3HMK801、總體積為0.5ml的20mM Hepes-KOH(pH7.4，含有100μM穀氨酸和30μM甘氨酸)中於22℃孵育1小時。用10μM MK801確定非特異性結合。通過迅速過濾到96孔Packard GF/C unifilter平板上而終止孵育，隨後用冰冷卻的20mM Hepes-KOH(pH7.4)洗滌3次。加入閃爍液後測量孔的放射性含量。
F)體內的胞外甘氨酸水平為了評估GLYT1b表達的增加對細胞外甘氨酸水平的影響，進行了微量透析研究。使用異氟烷(isoflurane)麻醉成年野生型和突變小鼠，並在它們的紋狀體(Cpu，前囟點A+0.9；L-1.8；V-4.6)插入微量透析垂直探針(CMA7 4/2，銅紡-膜定製)。在實驗之前允許動物恢復3到4天。根據Smith和Sharp的方法(經較小的改動)定量透析液的甘氨酸水平。
實施例3GLYT1突變小鼠的行為分析A)神經學評估(neurological assessment)神經學評估包括若干神經學測試，如屈反射、握力(g)和花在16和32rpm的旋轉杆上的時間(sec)以及體重。
B)自主行為觀察GLYT1b轉基因小鼠自然探究行為的跡象，包括身體姿勢、步態、感覺反應(Irwin，S.，Psychopharmacologia，1968.13(3)p.222-57)。此外，還分析了它們的自發走動活動(spontaneous locomotor activity)(活動箱activity box)。另外，通過將動物暴露於天然的厭惡刺激(高架十字迷宮測試和明/暗選擇測試)，評估了它們的焦慮狀態。
C)聽覺驚跳和聽覺驚跳反射的前脈衝抑制(prepulse inhibition)(精神分裂症相關行為)在8個驚跳裝置中進行測試，每個裝置由裝在有機玻璃平臺上的有機玻璃圓柱組成(直徑5cm)，所述有機玻璃平臺被置於通風、弱音的小室中，以高頻的擴音器產生所有聽覺刺激。每個小室的背景噪音為68dB。檢測圓柱內的運動，並通過附在樹脂有機玻璃底部的壓電式加速計轉換，並使用計算機數位化和存儲。在刺激開始時，記錄65×1msec的讀數，以獲得動物的驚跳幅度。
每一部分起始於5分鐘的適應期，之後是不包括在分析中的5個連續的110dB試驗。然後進行10個不同類型的試驗單獨的驚跳脈衝(ST110、110dB/40msec)；8個不同的前脈衝試驗，其中20msec長的，72、78、84和90dB的刺激(P72、P78、P84、P90)或者是單獨給予或在110dB脈衝之前100msec給予(PP72、PP78、PP84、PP90)；及最後一個只給予背景噪音的試驗(NST)，以測量圓柱中的基線運動。所有的實驗以偽隨機的順序給出，平均試驗間隔期(ITI)為15msec。使用雙因素ANOVA分析驚跳數據和前脈衝抑制(PPI)百分數。
D)築巢為了量化突變小鼠將綿紙撕碎來築巢的能力，在每個籠中放入幾張摺疊的綿紙，24小時後對巢進行評定。
E)腦室內NMDA誘導的驚厥。
通過向有知覺小鼠的側腦室注射NMDA(含5nM的1μl)來誘導抽搐。注射後立即將動物置於樹脂玻璃盒內，並觀察5分鐘。記錄每隻小鼠表現出狂跑期和陣攣性驚厥的潛伏期(以秒計)，以便將突變小鼠和野生型小鼠進行比較。
F)認知功能相關的行為短期和長期的空間記憶如Durkin(Durkin，T.P.，等人，Behav Brain Res，2000.116(1)p.39-53)的描述進行延遲匹配空間工作記憶任務(delayed matching spatial workingmemory task)。基於在5臂迷宮中獲得的延遲匹配規則評估工作記憶。基本學習任務包括兩個階段。每個試驗開始於呈現階段(presentation phase)，在這一階段，動物被強迫光顧準隨機選擇的一個臂，並得到獎勵，其餘4個臂被關閉。一旦被獎勵後，將動物放置於等待的籠子中。經歷持續時間不同的保留間隔期(對於工作記憶為延遲2-sec、20-sec和40-sec；對於短期和長期記憶為延遲5-min、1-hr、4-hr、24-hr)之後，進入尋回測試階段(retrieval test phase)，在此階段，將動物暴露於對5個開放的臂進行選擇的位置。獎勵正確的選擇(選擇之前光顧過的臂)。以保留間隔期的函數，通過在試驗間隔固定為10秒的連續試驗中正確命中選擇的平均百分數來表示工作記憶保留能力。通過自動視頻跟蹤系統監控記憶任務。
可替代的是，在Morris描述的水迷宮範例(Morris，R.G.，等人，Nature，1982.297(5868)p.681-3；Morris，R.G.，等人，Nature，1986.319(6056)p.774-6)中評估空間學習和記憶。將小鼠置於圓形水池(直徑120cm，高30cm)，在水池中它們通過尋找隱藏的平臺而學習躲避乳白色的水(20cm深，20±1℃)。此目標平臺(直徑7cm，處於水面以下1cm)被置於水池特定四分之一區的中心，並沿水池安置了外部的視覺提示物，以便利於導航動物。在4天的測試期中，於隨機選擇的4個固定起始位點之一面向水池壁將小鼠置於水中(每天3個回合，每回合3次試驗)。使用自動視頻運動系統測量小鼠尋找目標所需的時間(逃跑潛伏期)以及遊泳路徑和速度。如果動物在60秒內未能找到目標，用手將其置於平臺並允許其停留在那一個試驗間隔期(10到20秒)。每一回合的間隔為1.5到兩小時。在第4天的最終試驗之後，將平臺移走，並允許小鼠自由遊泳60秒。記錄小鼠在每一個四分之一區所花的時間以及它們的遊泳路徑。
聯想情緒記憶在兩種行為任務(behavioral task)中評估依賴NMDA受體的聯想情緒記憶i.恐懼加強的驚跳反射使小鼠條件性對與足擊(footshock)(aversive US)配對的光(CS)產生反應。在延遲24小時之後，通過在具有或不具有條件性光刺激情況下由不同聽覺刺激(90-110dB)所引起的驚跳反射的幅度來評估情緒記憶。條件性光刺激的給予導致聽覺驚跳反射增強(Davis，M.，Psychopharmacology(Berl)，1979.62(1)p.1-7)。
ii.情景恐懼條件反射(contextual fear conditioning)情景恐懼條件反射是一種暗示性厭惡相關的學習過程，通過這一過程，原本中性的情景在與非條件性厭惡刺激(US)反覆聯繫後獲得了引起厭惡的特性。將動物暴露於新的小室，幾分鐘後在此小室內用連續的足電擊(US)處理小鼠，以引起非條件的恐懼反應(木僵行為)(Phillips，R.G.和J.E.LeDoux，BehavNeurosci，1992.106(2)p.274-85)。通過對再次暴露於此情景而反應產生的木僵數量來衡量情景恐懼條件反射。在訓練後的不同時期測試條件性木僵反應，以評估短期(1到3小時)和長期(1到10天)的情景記憶。
條件性恐懼消退學會的恐懼反應的消失代表行為可塑性的一種形式，行為可塑性被認為依賴於新記憶形式的形成，而不是抹掉原來學會的聯繫(Falls，W.A.，M.J.Miserendino，和M.Davis，J Neurosci，1992.12(3)p.854-63)。最近已證明條件性恐懼消退與NMDA受體依賴的過程有關(Tang，Y.P.，等人，Nature，1999.401(6748)p.63-9)。訓練後延遲24小時之後，可通過連續5天內重複暴露於情景出現的木僵反應數量隨時間的減少來評估條件性木僵的消失。
G)藥理學幹擾的行為可以通過施用脫水嗎啡、D-苯異丙胺或非競爭性NMDA受體拮抗劑PCP來誘導一系列明顯的精神分裂症-型症狀，包括過多走動、前脈衝抑制(PPI)缺陷和記憶缺陷。使用了在野生型小鼠中幹擾行為的最低有效劑量。然後測試了是否GLYT1b轉基因小鼠表現出對於行為的藥理學幹擾具有不同的敏感性。
藥物誘導的過多走動通過記錄水平走動、垂直活動、刻板動作(stereotypic movement)以及花在開放場所中心的時間，在開放場所(活動盒)中評估D-苯異丙胺對走動和刻板行為的影響。
藥物誘導的社交退縮為了評估GLYT1b過表達對D-苯異丙胺或PCP在社會行為方面造成的行為反應的影響，使用了社會探究測試(social exploration test)(Crestani，F.，F.Seguy，和R.Dantzer，Brain Res，1991.542(2)p.330-5)。將單室飼養的雄性小鼠暴露於年青雌性小鼠5分鐘。在施用藥物前後經由視頻跟蹤系統記錄社會性互動，包括肛殖和嗅聞頸、給對方梳毛(heterogrooming)和追趕。施用藥物後，在不同的時間間隔(30分鐘、兩小時、4小時和24小時)檢查藥物誘導的社會探究衰退(social exploration deterioration)。
藥物誘導的前脈衝抑制缺陷脫水嗎啡或PCP對前脈衝抑制(PPI)的幹擾是常用的感覺運動門控缺陷(sensorimotor gating deficits)模型(Kretschmer，B.D.，等人，Eur JPharmacol，1997.331(2-3)p.109-16；Bakshi，V.P.和M.A.Geyer，JNeurosci，1998.18(20)p.8394-401；Bakshi，V.P.，等人，J Pharmacol ExpTher，1999.288(2)p.643-52)，通過這種模型可以評估注意力和感覺運動門控。PPI是在呈遞非誘導驚跳的前脈衝刺激後聽覺或觸覺驚跳反應的減弱。對聽覺刺激之後動物的驚跳反應進行了評估。
藥物誘導的記憶喪失在上文描述的延遲匹配空間記憶任務中評估PCP或脫水嗎啡誘導的記憶功能損傷。
H)GLYT1b突變小鼠中特異的GLYT1抑制劑逆轉體外和體內缺陷/損傷。
研究人員測定了是否特異的GLYT1抑制劑能夠逆轉體外(見實施例2的B、D和E段落)和體內(見實施例2的F段落、實施例3的A到F段落)觀察到的損傷/缺陷。
I)藥理學攻擊的GLYT1b突變小鼠中特異的GLYT1抑制劑逆轉體外和體內缺陷/損傷。
研究人員測定了是否特異的GLYT1抑制劑能夠在GLYT1b突變小鼠中逆轉它們發生改變的對行為的藥理學幹擾的敏感性(見實施例3段落G)。
序列表110弗·哈夫曼-拉羅切有限公司(F.Hoffman-La Roche)120Glyt1轉基因小鼠1302251116011170PatentIn version 3.321012112202212DNA213智人(Homo sapiens)220
2211c型甘氨酸轉運蛋白(可變剪接)222(1)..(2202)223UniGene ID Hs.442590下的基因的代表性cDNA(s70612，自2004年2月18日起)，4001gcccacacac cccactccag ctccggagca cccgtgctgg gctgcatggg gactggccgg60aggggcaggg ccaggggagc gggtaggcag agcttcggga ggagatgagg tgaaagtaat120tgacgctgcc cagcccggca gtgggagagg caggggatgc gtcagtgtcg cgctggagct180ggcagaggtg atgagcggcg gagacacgcg gggctgcgat cgctcgcccc aggatggccg240cggctcatgg acctgtggcc ccctcttccc cagaacagaa tggtgctgtg cccagcgagg300ccaccaagag ggaccagaac ctcaaacggg gcaactgggg caaccagatc gagtttgtac360tgacgagcgt gggctatgcc gtgggcctgg gcaatgtctg gcgcttccca tacctctgct420atcgcaacgg gggaggcgcc ttcatgttcc cctacttcat catgctcatc ttctgcggga480tccccctctt cttcatggag ctctccttcg gccagtttgc aagccagggg tgcctggggg540tctggaggat cagccccatg ttcaaaggag tgggctatgg tatgatggtg gtgtccacct600acatcggcat ctactacaat gtggtcatct gcatcgcctt ctactacttc ttctcgtcca660tgacgcacgt gctgccctgg gcctactgca ataacccctg gaacacgcat gactgcgccg720gtgtactgga cgcctccaac ctcaccaatg gctctcggcc agccgccttg cccagcaacc780tctcccacct gctcaaccac agcctccaga ggaccagccc cagcgaggag tactggaggc840tgtacgtgct gaagctgtca gatgacattg ggaactttgg ggaggtgcgg ctgcccctcc900ttggctgcct cggtgtctcc tggttggtcg tcttcctctg cctcatccga ggggtcaagt960cttcagggaa agtggtgtac ttcacggcca cgttccccta cgtggtgctg accattctgt1020ttgtccgcgg agtgaccctg gagggagcct ttgacggcat catgtactac ctaaccccgc1080
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221小鼠鈣/鈣調蛋白依賴的蛋白激酶IIα亞基基因5』側翼序列222(1)..(7988)223代表性cDNA(AJ222796，自2004年2月18日起)4002cgatcttttt tccgtaaact caataccagg ctgatgtccc accggatctg atggcttagg60gtggcaggga atctcagttc ccctcagaca ctctcccttt gctggttctc agggaggagg120caaggtcaag tcttcatctg taggcacgtg gagggagggc acagaagccc tcagctgaat180agggtgggac ttggggaagg gcagcaacca ggctgggttg cctgggtcac aatcctgcct240ctttcctgat gagtttcctt tttgccctca ggttacctat agcagcattc tgcctcaatc300
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221引物222(1)..(21)40010gaggctgtgg ttgagcaggt g21210112114006212DNA213人工序列220
223人工序列的描述哺乳動物表達載體220
221克隆載體pCI222(1)..(4006)223DNA序列(U47119，自2004年2月18日起)40011tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta60ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc120aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg180gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc240gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat300agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc360ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga420cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg480gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac540caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt600caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc660cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc720tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat780tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc840
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1.含有編碼GLYT1的DNA序列的遺傳構建體，所述DNA序列與啟動子有效連接。
2.根據權利要求1的遺傳構建體，其中DNA序列編碼GLYT1的同種型。
3.根據權利要求1的遺傳構建體，其中DNA序列編碼GLYT1b。
4.根據權利要求1到3中任一項的遺傳構建體，其中編碼序列是人的序列。
5.根據權利要求1到4中任一項的遺傳構建體，其中啟動子是組織特異的啟動子。
6.根據權利要求1到4中任一項的遺傳構建體，其中啟動子是前腦特異的啟動子。
7.根據權利要求1到4中任一項的遺傳構建體，其中啟動子是可控制的啟動子。
8.產生非人類轉基因動物的方法，所述轉基因動物的基因組含有編碼GLYT1的轉基因DNA，所述方法包括a)向非人類受精卵或非人類胚胎幹細胞引入根據權利要求1到7中任一項的遺傳構建體，b)從所述受精卵或胚胎幹細胞製備非人類轉基因動物，並由此，c)產生非人類轉基因動物，所述轉基因動物基因組中含有編碼GLYT1的轉基因DNA。
9.產生表達轉基因GLYT1的非人類轉基因動物的方法，包括a)向非人類受精卵或非人類胚胎幹細胞引入根據權利要求1到7中任一項的遺傳構建體，b)從所述受精卵或胚胎幹細胞製備非人類轉基因動物，並由此，c)產生表達轉基因GLYT1的非人類轉基因動物。
10.由權利要求8到9中任一項的方法產生的非人類轉基因動物。
11.非人類轉基因動物，其基因組中含有權利要求1到7中任一項的遺傳構建體。
12.根據權利要求10或11的非人類轉基因動物，其中轉基因動物是齧齒動物。
13.根據權利要求10或11的非人類轉基因動物，其中轉基因動物是小鼠。
14.根據權利要求10到13中任一項的非人類轉基因動物，所述轉基因動物過表達GLYT1蛋白質。
15.根據權利要求10到13中任一項的非人類轉基因動物，所述轉基因動物組織特異性地過表達GLYT1蛋白質。
16.根據權利要求10到15中任一項的非人類轉基因動物的後代。
17.來源於根據權利要求10到16中任一項的非人類轉基因動物或其後代的細胞系或原代細胞培養物。
18.來源於根據權利要求10到16中任一項的非人類轉基因動物或其後代的組織或器官型腦片培養物。
19.根據權利要求10到16的非人類轉基因動物、或根據權利要求17的細胞系或原代細胞培養物、或根據權利要求18的組織或器官型腦片培養物作為模型在研究化合物對精神病行為的作用中的用途。
20.根據權利要求10到16的非人類轉基因動物、或根據權利要求17的細胞系或原代細胞培養物、或根據權利要求18的組織或器官型腦片培養物在測試化合物的GLYT1特異性抑制作用中的用途。
21.根據權利要求10到16的非人類轉基因動物、或根據權利要求17的細胞系或原代細胞培養物、或根據權利要求18的組織或器官型腦片培養物作為模型在研究抑制突觸NMDA受體功能的效果中的用途。
22.評估GLYT1功能對NMDA受體活化的體內影響的方法，所述方法包括在權利要求10到16中任一項的非人類轉基因動物中測定NMDA受體活性、突觸可塑性和行為——包括學習和記憶，並將此NMDA受體活性、突觸可塑性和行為與對照的相比較。
23.測試GLYT1抑制劑化合物增強NMDA受體活性的能力的方法，所述方法包括向權利要求10到16的非人類轉基因動物、或根據權利要求17的細胞系或原代細胞培養物、或根據權利要求18的組織或器官型腦片培養物施予GLYT1抑制劑化合物，確定化合物的效果——包括評價行為、電生理學和組織學，和與對照的行為、電生理學和組織學相比較。
24.測試GLYT1抑制劑化合物增強NMDA受體活性的能力的試劑盒，所述試劑盒包括權利要求10到16中任一項的非人類轉基因動物、或根據權利要求17的細胞系或原代細胞培養物、或根據權利要求18的組織或器官型腦片培養物或組織，以及用於確定化合物是否表現出增強NMDA受體活性的能力的手段。
全文摘要
本發明提供用於產生非人類轉基因動物的遺傳構建體和方法，所述非人類轉基因動物的基因組中含有編碼GLYT1的轉基因DNA。這些轉基因動物還能被用於產生能夠生成更多活性GLYT1的轉基因動物。此外，還提供所述產生更多GLYT1蛋白質的轉基因動物，以及產生它們的方法。本發明也涉及這些動物作為模型在分析抑制突觸NMDA受體功能的效果以及研究化合物減輕精神病行為症狀的能力中的用途。
文檔編號C12N5/10GK1670213SQ20051005547
公開日2005年9月21日 申請日期2005年3月18日 優先權日2004年3月19日
發明者D·阿爾貝拉蒂-賈尼, M·保利-埃費斯 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司