包含銀納米粒和何首烏提取物的組合物及其用途的製作方法

2023-05-27 23:29:46 2

專利名稱：包含銀納米粒和何首烏提取物的組合物及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及包含有效量銀納米粒和何首烏提取物的藥用組合物，以及局部給予宿主所述藥用組合物以增加毛髮生長的方法，以及所述藥用組合物在製備增加宿主毛髮生長的藥物中的用途。
背景技術：
金屬納米粒因為其在許多學科領域如催化和納米電子有著重要的應用，已吸引了越來越多的對化學領域的關注(參見(a) El-Sayed, Μ. A. Acc. Chem. Res. 2004，37，326. (b)Ho, C. -Μ. ；Yu, W. -Y. ；Che, C. -Μ. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 3303. (c)Lang, H.； May, R. A. ；Iversen, B. L. ；Chandler, B. D. J. Am. Chem. Soc. 2003，125，14832. (d)Lewis, L. N. Chem. Rev. 1993，93，2693)。近來，已付出大量努力致力於開發金屬納米粒的生物醫學應用。當生物學標記取得顯著進展時(參見(a)Nicewarner-Pena，S. R. ；Freeman, R. G. ；Reiss, B. D. ；He, L. ；Pena, D. J. ；Walton, I. D. ；Cromer, R. ；Keating, C. D. ；Natan, M. J. Science 2001,294,137. (b) Elghanian, R. ；Storhoff, J. J. ；Mucic, R. C. ；Letsinger, R. L. ；Mirkin, C. A. Science 1997，277，1078)，幾乎沒有金屬納米粒的治療學應用在文獻中被報導。值得一提的實例是銀納米粒的抗微生物特性，其已用於傷口癒合(Wright，J. B.； Lam, K. ；Hansen, D. ；Burrell，R. Ε· Am. J. Inf. Cont. 1999，27，344)。斑禿是頭皮和身體其它部位毛髮脫落的疾病。據報導與自身免疫相關，其作用機制是毛囊被自身免疫系統攻擊，從而阻止毛髮生長。另一個觀察結果是高水平的自然產生的稱為雙羥睪丸酮(DHT)的激素存在於遺傳學歸為男性模式脫髮的人頭皮中，縮短毛髮生長期。最終，毛髮變得小至實際上看不見。如果不阻止的話，這樣能導致典型的男性禿頭髮際線。斑禿經常開始於頭皮上一個或多個小的、圓的、光滑的禿塊，並能發展為全部頭髮脫落(全禿)或全部身體毛髮脫落(普禿)。流行病學上，斑禿影響大約全世界人口的 1. 7%，僅美國就包括超過470萬人，這種病症/疾病對個人的自我形象和自信心有深遠的影響，從而影響生活質量，無論在工作還是學習。各種年齡和人種的男性和女性均可發生斑禿。其發病最經常開始於兒童期/成人早期，且可為心理學破壞性的。儘管斑禿不危及生命，它最肯定改變生活，其突然發病、反覆發作和不可預期的病程對被這種疾病困擾的人的生活有深遠的心理學影響。

發明內容
PVP塗層銀納米粒子和何首烏的聯用對促進毛髮生長有協同作用。包含有效量銀納米粒和何首烏提取物的藥用組合物比僅銀納米粒在誘導毛髮生長方面更有效。因此，本發明涉及包含有效量銀納米粒、至少一種穩定劑和何首烏提取物，以及至少一種藥學可接受稀釋劑的藥用組合物。所述穩定劑可以是例如一種或多種蛋白和/或肽，優選人血清白蛋白或轉鐵蛋白，更優選人血清白蛋白(HSA)。在一個實施方案中，所述穩定劑是聚乙烯吡咯烷酮。
所述何首烏提取物優選何首烏根部提取物，更優選何首烏根部的乙醇提取物。在一個實施方案中，所述藥用組合物中的銀納米粒直徑為1至lOOnm。在一 個實施方案中，所述藥用組合物中銀納米粒的濃度為ΙΟμΜ至10mM，優選 ΙΟμΜ至 ImM。在一個實施方案中，所述藥用組合物中何首烏提取物的濃度為lg/L至1000g/L， 優選 lg/L 至 100g/L。在優選實施方案中，本申請的所述藥用組合物包含選自水、乙醇、二甲基亞碸、乙腈、Hepes緩衝液、磷酸鹽緩衝液、Tris緩衝液、檸檬酸緩衝液、血清或任何其它種生理學相關的溶劑或溶液，及其混合物的稀釋劑。本發明也涉及增加毛髮生長的方法，該方法包含局部給予需要治療的宿主本發明藥用組合物。宿主優選人。本發明還涉及上文所述的藥用組合物在製備增加宿主毛髮生長的藥物中的用途。本發明還涉及包含有效量的銀納米粒和何首烏提取物的藥用組合物在製備用於增加宿主毛髮生長的藥物中的用途。在本發明的用途中，所述藥學組合物包含有效量的銀納米粒、何首烏提取物、至少一種穩定劑和至少一種藥學上可接受的稀釋劑。在本發明的用途中，所述穩定劑可以是例如一種或多種蛋白和/或肽，優選人血清白蛋白或轉鐵蛋白，更優選人血清白蛋白(HSA)。在一個實施方案中，所述穩定劑是聚乙烯吡咯烷酮。在本發明的用途中，何首烏提取物優選何首烏根部的提取物，更優選何首烏根部的乙醇提取物。在本發明用途的一個實施方案中，所述藥用組合物中銀納米粒的直徑為1至 IOOnm0在本發明用途的一個實施方案中，所述藥用組合物中銀納米粒的濃度為10 μ M至 IOmM,優選 ΙΟμΜ 至 ImM。在本發明用途的一個實施方案中，所述藥用組合物中何首烏提取物的濃度為lg/L 至 1000g/L，優選 lg/L 至 100g/L。在本發明用途的優選實施方案中，本申請的藥用組合物包含選自水、乙醇、二甲基亞碸、乙腈、Hepes緩衝液、磷酸鹽緩衝液、Tris緩衝液、檸檬酸緩衝液、血清或任何其它種類的生理學相關的溶劑或溶液，及其混合物的稀釋劑。所述宿主優選人。有許多產生不同形狀和大小銀納米粒的方法(參見(a)Raveendran，P. ；Fu, J.； Wallen, S. L. J. Am. Chem. Soc. 2003，125，13940. (b) Sun, Y. ；Xia, Y. Science 2002，298， 2176. (c)Esumi,K. ；Suzuki, Α. ；Yamahira, Α· ；Torigoe, K. Langmuir 2000,16,2604)。人血清白蛋白(HSA)是循環系統中最豐富的血漿蛋白。先前的報導顯示，這種血清蛋白能用於穩定各種金屬納米粒(參見Xie，H. ；Tkachenko, A. G. ；Glomm, W. R. ；Ryan, J. Α. ；Brennaman, Μ. K. ；Papanikolas, J. Μ. ；Franzen, S. ；Feldheim, D. L. Anal. Chem. 2003, 75,5797)。包含PVP塗層銀納米粒和何首烏的本發明的藥用組合物在促進毛髮生長方面有協同作用。 附圖簡述

圖1是何首烏的照片。圖2是商業上從上海雷允上藥業有限公司的首烏片(Shou Wu Pian，Shanghai Lei Yun Shang Pharmaceutical Co. Ltd)獲得的 PMT 片的照片。圖3是帶有0. 2cm χ 0. 2cm方格圖的Icm χ Icm透明薄膜。圖4是用溶劑對照(僅PVP，圖A)、PVP塗層的銀納米粒(納米Ag-PVP，圖B)或混合有5%米諾地爾的PVP塗層銀納米粒(圖C)治療8周後，小鼠鞍前區的照片。納米Ag-PVP 似乎誘導新毛髮生長，而添加5%米諾地爾減少這種作用。圖5是用溶劑對照(僅PVP)、僅10% PMT、0. ImM PVP塗層的銀納米粒(納米 Ag-PVP)或0. ImM納米Ag-PVP和10% PMT的混合物治療8周後，小鼠的照片。圖6是用僅PVP (溶劑對照)、僅10 % PMT,0. ImM納米Ag-PVP，以及0. ImM納米 Ag-PVP加10% PMT治療後第3、4、5、6、7和8周時，小鼠敷料皮膚中毛髮覆蓋面積的百分比。圖7 是用含有(1)僅納米 Ag-PVP (2)納米 Ag-PVP 加 (w/v)PMT, (3)納米 Ag-PVP 加10% PMT,以及(4)納米Ag-PVP加50% PMT治療8周後，測量的裸鼠敷料皮膚中毛髮覆蓋面積的百分比(η分別等於6、7、8和7，見表3. 1)。圖8是用0. ImM納米Ag-PVP或0. ImM納米Ag-PVP+10% PMT經皮治療8周裸鼠皮膚(橫截面)Ki67染色。圖9是原位雜交(ISH)檢測用納米Ag-PVP或納米Ag-PVP+PMT治療的皮膚橫截面 (400x)的 CD34。圖10顯示不同治療的小鼠敷料皮膚中每個毛囊的⑶34+細胞數量(ISH檢測)(毛鞘橫截面計數，400x，類似圖9所示)。圖11顯示用各種條件治療的小鼠體重的測量。實施本發明的模式本發明將在以下實施例中被進一步說明。然而，不能認為由此而限制本發明。本領域普通技術人員知道怎樣改變示例的製備來得到所需要的結果。
實施例材料和方法材料。除非另外指明，所有化學品均購自Sigma-Aldrich Chemical Co.清潔玻璃器皿以製備銀納米粒錐形瓶浸泡在鹼水浴中(200克氫氧化鈉顆粒溶解在2L雙蒸水(ddH20)中)。然後用ddH20洗滌，接著用MilliQ水，最後濃硝酸洗滌錐形瓶。錐形瓶內的濃鹽酸和濃硝酸的混合物(體積比=1 3)煮沸30分鐘，以除去錐形瓶內的所有金屬。接著用MilliQ水洗滌錐形瓶，然後合成銀納米粒。A^yfaga (HSA)塗Hl銀j內米I立的泡丨備180mg/L無水檸檬酸三鈉鹽和16mg/L硝酸銀加到ILMilliQ水中，混合約5分鐘。 然後把50mg硼氫化鈉粉末加到混合物種，混合20分鐘。然後觀察到黃色溶液，把12g HSA 加到溶液中。
所有人血清白蛋白(HSA)溶解後，溶液經22 μ m過濾器頂部過濾。使用前溶液4°C
保存。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)塗層銀納米粒的製備 為製備IOOml聚乙烯吡咯烷酮(PVP)塗層銀納米粒，把5g PVP-K30 (來自 Sigma-Aldrich Ltd,USA)溶解於100ML 60%乙醇中，完全溶解後隨後加入IOOmg硝酸銀粉末。然後把25mgNaBH4的Iml MilliQ水加到溶液中。使用前，含有0. ImM銀納米粒的終溶
液4°C儲存。經檢驗的化學藥品的棵鼠局部給藥四周齡雄性無胸腺Balb/c本底裸鼠購自美國Jackson Laboratory.動物隨機分為不同的組，以接受不同的治療，每日在軀幹背部(頸圈或鞍前區)lcmx Icm區域敷料8 周。Icm χ Icm的紗布浸以銀納米粒溶液(或塗有HSA或PVP)，並進一步用另一 4cm寬的非拉伸棉縐布繃帶覆蓋，再以4cm寬伸展型繃帶覆蓋。敷料最後以膠帶固定。經過8周的治療，小鼠斷頸處死，收集敷料區域的皮膚片，以4%甲醛固定，進行分析。何首烏(PMT)的製備三種類型的樣品從何首烏根部的乙醇提取物製備並分離；它們是㈧根部提取物(見圖1)IOOg乾燥的PM根搗碎，浸在IOOOml 50%乙醇中(即「根與50%乙醇」的比率為 1 10」)。48小時後，收集溶液並濾出，隨後用真空旋轉蒸發儀減壓濃縮。濃縮的提取物隨後冷凍並乾燥，4°C保存直至使用。IOg量的乾燥提取物通常從IOOg PMT的乾燥根獲得。 將IOOg乾燥提取物粉末70°C下溶解在IOOOml (即10% W/V)的ddH20中，完全溶解後PMT 溶液4 °C儲存，直至實驗使用。(B)商業上可獲得的PMT片的溶解本研究中使用的何首烏(PMT)溶液還可在70°C時，將IOOg PMT片(商業上從中國上海雷允上藥業有限公司的首烏片(Shou Wu Pian, Shanghai Lei Yun Shang Pharmaceutical Co. Ltd, China)購得，見圖2)溶解在1000ml ddH20中製備，完全溶解後， PMT溶液4°C保存至使用。PMT與PVP塗層銀納米粒的混合物為製備PVP塗層銀納米粒與PMT的混合物，PVP塗層的銀納米粒溶液如上所述製備，除了 PVP是溶解在無水乙醇而非60%乙醇中。100g/L溶解的PMT溶液與0. 17mM PVP 塗層的銀納米粒溶液以體積比46混合。治療的皮膚毛髮覆蓋面積的計算毛髮覆蓋面積通過將Icm χ Icm透明薄膜(有0. 2cm χ 0. 2cm方格網，如圖3所示)放在皮膚上測量。治療後有可見新毛髮生長的小鼠毛髮覆蓋百分比由以下公式計算
覆蓋有毛髮的方格數(Number of squares covered with hair) 0/
— x /oWJfr^ (ISH) ^lll CD34 以及免,瘡染色檢測丨 Κ 67原位雜交檢測小鼠CD34是在5 μ m厚的福馬林固定組織的石蠟固定切片中進行。石蠟固定的載玻片用二甲苯脫蠟，然後用梯度濃度的乙醇再水化。脫蠟後切片在含有0. 2N HCl和0.3% Triton的溶液中室溫孵育30分鐘，然後用10g/ml蛋白酶-K (Invitrogen) 37°C消化15分鐘。該PK消化用0. IM甘氨酸室溫終止10分鐘。2X SSC洗滌切片，用2ng/y 1 DIG標記的正義和反義cRNA探針46°C下在含有50%去離子化甲醯胺、 2X 35(、10%硫酸葡聚糖、5乂 Denhardt，s 溶液、0. 25mg/ml 酵母 tRNA、0. 5% SDS 的雜交緩衝液中雜交過夜。切片用2x SSC/50%甲醯胺46°C下洗滌15分鐘兩次，然後用0. lXSSC/30% 甲醯胺46°C洗滌15分鐘，接著用0. lXSSC/30%甲醯胺室溫洗滌15分鐘，並用0. IXSSC室溫洗滌15分鐘。雜交探針用鹼性磷酸酶綴合綿羊抗DIG F(ab)片段(Roche)檢測，用NBT/ BCIP溶液(Roche)顯色。切片隨後用帶DAPI (Vector Laboratories)的封固劑封固，檢測螢光。DIG標記的小鼠CD34探針對應核苷酸379-773[NM_133654(小鼠(mus musculus) CD34 抗原(CD34)，mRNA)]。染色檢測Ki67在5 μ m厚的福馬林固定的皮膚組織的石蠟固定切片中進行。石蠟固定的載玻片用二甲苯脫蠟，然後用梯度濃度的乙醇再水化。切片隨後在IOmM檸檬酸鈉緩衝液(pH 6.0)中微波加熱15分鐘。然後載玻片用1 200兔抗Ki67抗體(LabVision, United States)或相同濃度純化的兔IgG (Zymed，USA ;as an isotype) 4°C染色過夜。此後， 切片用 1 200 AlexaFluor 594 山羊抗兔 IgG (H+L)抗體(Molecular Probes，USA)室溫下
孵育 1 小時。切片最後用帶DAPI (Vector Laboratories,United States)的 VECTASHIELD⑧
封固。螢光顯微鏡(Nikon E600顯微鏡)下研究圖像。平行試驗包括陽性和陰性對照。陽性對照是小鼠脾切片。陰性對照是用作為一抗的純化兔IgG染色的皮膚切片。Ki-67的核染色被認為是陽性的。Ki67陽性細胞百分比由下式計算
權利要求
1.藥用組合物，其包含有效量銀納米粒、至少一種穩定劑、何首烏提取物，以及至少一種藥學可接受稀釋劑。
2.權利要求1所述的藥用組合物，其中一種或多種蛋白和/或肽和/或聚乙烯吡咯烷酮作為穩定劑使用。
3.權利要求2所述的藥用組合物，其中所述蛋白選自人血清白蛋白和轉鐵蛋白。
4.權利要求1所述的藥用組合物，其中所述何首烏提取物為何首烏根部的提取物。
5.權利要求4所述的藥用組合物，其中所述何首烏根部提取物是所述何首烏根部的乙醇提取物。
6.權利要求1至5中任一項所述的藥用組合物，其中所述銀納米粒直徑為1至lOOnm， 所述組合物中銀納米粒的濃度為IOyM至10mM。
7.權利要求6中所述的藥用組合物，其中所述組合物中銀納米粒的濃度為ΙΟμΜ至ImM0
8.權利要求1至5中任一項所述的藥用組合物，其中所述組合物中何首烏提取物的濃度為 lg/L 至 1000g/L。
9.權利要求8所述的藥用組合物，其中所述組合物中何首烏提取物的濃度為lg/L至 100g/L。
10.權利要求1至5中任一項所述的藥用組合物，其中所述稀釋劑選自水、乙醇、二甲基亞碸、乙腈、Hepes緩衝液、磷酸鹽緩衝液、Tris緩衝液、檸檬酸緩衝液、血清或任何其它種類生理學相關的溶劑或溶液，及其混合物。
11.增加毛髮生長的方法，其包含局部給予需要治療的宿主根據權利要求1至10的所述藥用組合物。
12.權利要求11所述的方法，其中所述宿主是人。
13.根據權利要求1至10的藥用組合物在製備增加宿主毛髮生長的藥物中的用途。
14.權利要求13的用途，其中所述宿主是人。
全文摘要
公開了包含有效量銀納米粒和何首烏提取物的藥用組合物，局部給予宿主所述藥用組合物以增加毛髮生長的方法及其用途。
文檔編號A61K33/38GK102438634SQ200980157220
公開日2012年5月2日 申請日期2009年2月10日 優先權日2009年2月10日
發明者蔡明芬 申請人:蔡明分