人α-防禦素5抗病毒活性突變體多肽及製備方法和應用的製作方法
2023-05-28 02:02:16 2
專利名稱：人α-防禦素5抗病毒活性突變體多肽及製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於蛋白質工程和抗病毒藥物製備技術領域，特別涉及一種人a -防禦素 5抗病毒活性突變體多肽及其製備方法和應用。
背景技術：
病毒感染性疾病嚴重危害人類健康，研製高效、特異性抗病毒藥物具有重要的現 實意義。 防禦素是人們在研究哺乳動物、昆蟲等防禦和抵抗病原微生物侵襲及感染的過程 中發現的一種分子量為3-6kD的內源性陽離子肽。之所以被稱為陽離子肽，是因為成熟的 防禦素分子內富含精氨酸(一種鹼性胺基酸)，因而在多數情況下防禦素分子都帶有較強 的正電荷。人們對防禦素的最初認識是基於其快速、強效的殺菌活性，但後來研究發現，除 了抗菌活性外，大部分防禦素還具有抗真菌、抗螺旋體以及抗病毒的作用。尤其是一些防禦 素對嚴重影響人類健康的病毒，如單純皰疹病毒(HSV)、人乳頭瘤狀病毒(HPV)、人類免疫 缺陷病毒(HIV)等顯示出一定的殺傷和抑制作用。研究資料表明，防禦素分子可以通過阻 礙病毒顆粒粘附和侵入哺乳動物細胞以及抑制病毒DNA轉錄等個環節發揮抗病毒作用。由 於防禦素是一種內源性分子，本身具有識別病原微生物與機體正常細胞的能力，所以在有 效劑量範圍內不會對人體正常細胞造成明顯影響，也不會誘發產生耐藥現象。正因如此，防 御素的研製與開發在病原微生物感染防治方面具有廣闊的應用前景。 人a -防禦素5(HD5)主要由腸道上皮細胞和生殖道黏膜上皮細胞分泌表達。由 於生殖道黏膜是HIV、 HPV和HSV-2等病毒在人體內的主要傳播部位，因此，理論上講HD5 應具有更明顯的抗此類病毒活性。Buck等在進行a防禦素抗HPV研究時發現，與其它已 知的人類防禦素分子相比，HD-5的抗病毒活性最為突出(Buck CB et al， PNAS， 2006， 103 : 1516-1521)。但是，無論哪一種防禦素，其抗病毒作用都不如抗菌效果顯著，研究表明a 防禦素抗病毒時的半數有效濃度(IC50) —般要比抗菌時的IC50高數倍以上(Tanabe Het al，J Viro1，2004，78 :11622-11631)。這就意味著當應用防禦素多肽進行抗病毒治療時其 用量要顯著增加，如此不僅會加重病人的經濟負擔，更重要的是會超出人體正常細胞對其 的耐受力，引發毒副反應。此外，包括HD5在內的大多數防禦素多肽在血清存在的情況下， 其抗病毒活性會受到顯著抑制，從而使得防禦素的體內應用受到很大限制。
已知，防禦素的抗菌及抗病毒活性不僅與其自身所特有的雙極性有關，而且還與 整個分子及分子內部重要位置胺基酸殘基所帶正電荷的多少有關。有研究證實，當將防禦 素分子內帶正電荷的精氨酸(鹼性胺基酸)替換為中性胺基酸或酸性胺基酸時，防禦素的 抗菌和抗病毒活性會顯著下降。反之，如果將防禦素分子內某一或某些酸性胺基酸突變為 鹼性胺基酸時，突變後的防禦素分子的抗菌和抗病毒活性有可能得到顯著提高(Higgs R et al， Imm皿ogenetics， 2007， 59 :573—580)。
發明內容
本發明的目的是提供一種人a -防禦素5抗病毒活性突變體多肽及製備方法和應 用。根據改變防禦素分子內胺基酸殘基組成和所帶電荷量可影響其生物學功能的特性，在 HD5自身具有一定抗HSV、 HPV和HIV等病毒作用的基礎上，通過重要位置胺基酸定點突變 和抗病毒活性篩選，獲得抗病毒活性顯著增強的HD5突變體多肽。本發明的HD5突變體多 肽在有無血清存在的情況下均具有高效的抗病毒活性，其抗病毒作用較母本HD5多肽顯著 提高。本發明的HD5突變體多肽可以用於防治HSV、 HPV及HIV等病毒的感染。
本發明的技術方案是 人a -防禦素5抗病毒活性突變體多肽的胺基酸序列如下
Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser
15 10 15 Leu Ser Gly Val Cys Arg lie Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Cys
20 25 30 Cys Arg在天然HD5的第21位穀氨酸(Glu， E)被替換為精氨酸(Arg， R)。 編碼權人a -防禦素5抗病毒活性突變體多肽的DNA序列，其序列如下GCC ACC TGC TAT TGC CGA ACC GGC CGT TGT GCT ACC CGT GAG TCC CTC TCCGGG
GTG TGT GG丁 ATC AGT GGC CGC CTC TAC AGA CTC TGC TGT CGC HD5突變體多肽的製備方法，包括固相化學合成法和基因工程製備法。 基因工程法製備HD5突變體多肽的方法，將上述人a -防禦素5抗病毒活性突變
體多肽的DNA序列克隆到表達載體中，轉染宿主細胞，經誘導表達、純化，即得所述HD5突變
體多肽。 所述的表達載體為質粒表達載體。 所述的宿主細胞包括原核細胞和真核細胞。 所述原核細胞為大腸桿菌細胞。 所述真核細胞為酵母細胞。 人a -防禦素5抗病毒活性突變體多肽在預防和治療單純皰疹病毒(HSV)感染或 人乳頭瘤狀病毒(HPV)感染或人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的應用。該HD5突變體多肽可 以單獨應用，也可以與其他藥物或製劑配伍使用。 上述表達本發明HD5突變體多肽的宿主細胞可以是細菌、酵母及哺乳動物細胞 等，其中優選的是畢赤酵母。 純化本發明HD5突變體多肽的方法包括粗提、鹽析及液相層析等，其中液相層析 又包括了離子交換、疏水等層析技術。 本發明的HD5突變體多肽具有突出的抗HSV-2、HSV-1及HPV等病毒的能力。
本發明的皿5突變體多肽在2%、10%及20%血清中同樣具有顯著的抗病毒作用， 其抗病毒活性較母本HD5多肽顯著提高。
本發明的HD5突變體多肽無明顯的細胞毒性。 本發明HD5突變體多肽的特點是，在保持HD5基本生物學特性的基礎上(例如對 人體正常細胞無毒副作用、不會誘導病毒產生耐藥等)，HD5突變體多肽不僅顯著提高了病毒的能力，而且其抗病毒活性基本上不受血清存在的影響，從而使該突變體多肽既可以 作為外用藥又可作為內用藥應用於HSV、 HPV及HIV等病毒感染性疾病的防治。
圖1為HD5突變體多肽在無血清情況下抑制HSV-2感染vero細胞效果的分析，其 中，柱狀1代表正常細胞對照，柱狀2代表病毒對照，柱狀3代表HD5多肽對照，柱狀4代表 HD5突變體多肽，* :p < 0. Olvs.病毒對照； 圖2為HD5突變體多肽在2%血清條件下抑制HSV_2感染vero細胞效果的分析，
其中，柱狀1代表正常細胞對照，柱狀2代表病毒對照，柱狀3代表HD5多肽對照，柱狀4代
表HD5突變體多肽，* :p < 0. Olvs.病毒對照；# :p < 0. Olvs. HD5多肽對照； 圖3為HD5突變體多肽在10%血清條件下抑制HSV_2感染vero細胞效果的分析，
其中，柱狀1代表正常細胞對照，柱狀2代表病毒對照，柱狀3代表HD5多肽對照，柱狀4代
表HD5突變體多肽，* :p < 0. Olvs.病毒對照；# :p < 0. Olvs. HD5多肽對照； 圖4為HD5突變體多肽在20%血清條件下抑制HSV_2感染vero細胞效果的分析，
其中，柱狀1代表正常細胞對照，柱狀2代表病毒對照，柱狀3代表HD5多肽對照，柱狀4代
表HD5突變體多肽，* :p < 0. Olvs.病毒對照；# :p < 0. Olvs. HD5多肽對照。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本方明的實質性內容，但本發明的內容並不局限於 此。 主要試劑和材料 1. Pyrobest DNA Polymerase試劑盒(TaKara公司產品，中國大連) 2.限制性核酸內切酶EcoR 1、SacI(New England BioLabs公司產品，美國) 3.質粒載體pPIC9K、畢赤酵母菌株GS115(Invitrogen公司產品，美國) 4. Red/ET重組酶red Y /red P /red a /redA質粒pSC101_BAD-gbaA、大腸桿菌
HS996(Gene Bridges公司產品，德國) 5. L-阿拉伯多糖(Sigma公司產品，美國) 6. CCK-8細胞增殖/毒性檢測試劑盒(DOJINDO公司產品，日本) 7. Vero細胞株(本室保存) 8. HSV-2病毒株(本室保存) 9. G418、氨節青黴素(Roche公司產品，德國) 10. DMEM培養基、胎牛血清(Hyclone公司產品，美國) 11. SP S印harose Fast Flow、 Source 15RPC等層析介質(GE公司產品，美國) 12. C18反相層析、FINELINE PILOT 35層析柱(GE公司產品，美國) 13.酵母提取物、胰蛋白腖、無胺基酸酵母氮源(Oxford公司產品，美國) 14. LB培養基 酵母提取物5g 胰蛋白腖10g NaCl 10g
溶於1000ml去離子水中，並用lmol/L的NaOH調節pH值至7. 0，高壓蒸氣滅菌。
15. YPD液體培養基
酵母提取物2g
胰蛋白腖4g 溶於180ml去離子水中，高壓滅菌。冷卻後加入20ml經濾器除菌後的20%的右旋
糖和0. 2ml濃度為100mg/ml氨苄青黴素。 16. BMGY液體培養基 酵母提取物 10g 胰蛋白腖 20g 無胺基酸酵母氮源13. 4g 甘油 10g 磷酸鉀 26. 63 lg 溶於1000ml雙蒸水中高壓滅菌，冷至室溫後補加生物素至終濃度為4X 10—7L，氨
苄青黴素終濃度為100 g/ml，調節pH至6. 0， fC保存備用。 17.磷酸鹽緩衝液 NaCl 8g KC1 0. 2g Na2HP04 1. 44g KH2P04 0 . 24g 溶於1000ml去離子水中，並用濃HC1調節pH值至7.4，高壓蒸氣滅菌。
實施例1HD5突變體多肽的固相化學法合成 1、根據HD5突變體的胺基酸序列，利用全自動多肽合成儀(433A，
AppliedBiosystem)委託上海生工生物工程公司合成HD5突變體多肽。 2、通過HPLC反相C18柱層析、脫鹽對合成的HD5突變體多肽進行純化。 3、採用同樣方法合成、純化母本HD5多肽對照品。 4、對於純化的HD5突變體多肽，採用高壓液相(HPLC)方法進行純度鑑定，應用基 質輔助雷射解析電離飛行時間質譜法(MALDI-TOF)對其分子量進行測定，通過等電聚焦電 泳測定其等電點，用自動胺基酸測序儀測定胺基酸序列結構。 5、 HPLC結果顯示，最終所得HD5突變體多肽的純度> 95% ;等電聚焦電泳結果顯 示所得HD5突變體多肽的等電點為9. 2左右；質譜分析結果顯示所得HD5突變體多肽的分 子量為3615. 27，均與理論推導值一致。 實施例2重組HD5突變體多肽在畢赤酵母中的表達及純化製備 1、合成編碼HD5突變體的全長基因。委託上海生工生物工程公司合成編碼HD5突
變體的全長基因，基因序列如下 GCC ACC TGC TAT TGC CGA ACC GGC CGT TGT GCT ACC CGT GAG TCC CTC TCCGGG GTG TGT GG丁 ATC AGT GGC CGC CTC TAC AGA CTC TGC TGT CGC際 注陰影部分的3個鹼基所編碼的胺基酸即為突變後的精氨酸，方框內的3個鹼基 所編碼的是終止密碼子。 2、重組HD5突變體酵母表達載體的構建
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(1)PCR引物設計為了保證酵母表達的重組HD5突變體N端無多餘的胺基酸，採 用Red/ET重組技術將編碼HD5突變體的基因序列直接插入到酵母表達載體pPIC9K中的 STE^蛋白酶識別位點之後。為此，首先合成帶有50bp同源臂的上、下遊PCR引物，引物序 列如下 m H D 5 - u p :
5 ' - 〃 g" g" WS欲g "C弱g aa<3
靴- ， g"gcc acc tgc tat tgc cga ac-3' mHD5-down :5' -" "C3" ^CCC〃 "gSSCC<3 f
&s欲c ，TCA gcg aca gca gag tct gt-3' 其中mHD5-up中5'端斜體部分為pPIC9K質粒中STE13蛋白酶識別位點之前的50 個鹼基的序列，陰影部分為HD5突變體基因的特異性上遊引物序列；mHD5-down中5'端斜 體部分為PPIC9K質粒中多克隆位點之後的50個鹼基的序列，陰影部分為HD5突變體基因 的特異性下遊引物序列。這樣在進行PCR擴增編碼HD5突變體基因片段的同時，其兩端分 別加載上了與pPIC9K質粒載體骨架部分同源的50bp序列。 (2) PCR擴增以合成的HD5突變體全長基因DNA片段為模板，以mHD5_up和 mHD5-down作為上、下遊引物，進行PCR反應，反應條件如下①變性94。C，5min ;②變性 94。C，30s ;③復性:55。C，30s ; 延伸:72。C，30s ;⑤返回步驟"②"，35循環；⑥延伸:72。C， 5min ;⑦4t:保存，總循環次數為35次。將PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示擴 增出約150bp大小的DNA條帶。所得PCR產物即為兩端分別帶有50bp同源臂的HD5突變 體基因片段。 (3)Red/ET介導重組HD5突變體酵母表達載體的構建將EcoR I酶切線型化的 pPIC9K片段和上述PCR擴增產物按相等濃度共電擊轉化已用0. 1% L-阿拉伯糖誘導表達 red y /red P /red a /redA重組酶的HS996感受態細胞，然後接種於LB平板，37。C培養過夜， 挑取經卡那黴素篩選的陽性克隆再培養，並提取質粒進行酶切和測序鑑定，結果顯示獲得 的質粒序列正確，陽性克隆命名為pPIC9K-HD5-E21/R。 將測序正確的pPIC9K-HD5-E21/R質粒DNA用Sac I酶切回收後，分別轉化GS115 感受態細胞。電擊轉化參數為1500V，200Q，25iiF。然後將轉化菌液接種於YPD平板，對 經基因組PCR鑑定整合有目的基因的克隆株進行培養，製備感受態細胞，按前述方法再次 進行電擊轉化和鑑定。接著用常規方法進行表型和G418抗性篩選，最終挑選出具有His+/ My t+表型且耐受5. Omg/ml G418的克隆株接種培養，並標識凍存於-7(TC保種。
(4)酵母工程菌株的發酵和重組HD5突變體多肽的純化 取-7(TC凍存的整合有pPIC9K-HD5-E21/R的酵母工程菌種接種於YPD平板30°C 過夜培養活化，挑選外觀優良的單個菌落接種於BMGY培養基，3(TC恆溫搖床220rpm振蕩培 養16 18h至0D6。。 " 3 5，然後按1 : 10轉種1次培養至0D6。。約為4，以此菌液為種 子液。然後將種子液移種於裝有基礎鹽培養基(添加微量鹽PTM》的15L發酵罐(B.Braim 公司，德國)進行高密度培養發酵。發酵溫度控制在3(TC (開始甲醇誘導後控制為28tO， 溶解氧控制在30% 40%之間，pH值控制在5. 0(開始甲醇誘導後控制為3. 5)，細胞培養 至0D6。。 " 150時開始流加甲醇誘導，甲醇流加速率控制在1%左右。誘導表達60h後停止
7發酵，低溫離心取上清，隨後進行純化。首先將上清進行超濾層析，以去除部分色素和降低 高強度的鹽離子濃度，並將目的多肽濃縮約100倍，同時用20mmol/L磷酸鹽緩衝液(pH值 7.2)更換緩衝體系。接著過SP S印harose Fast Flow柱進行陽離子交換層析，去除絕大 部分殘留色素和雜蛋白，收集含有目的多肽的組分，再上FINELINE柱(Source RPC 15填 料，柱高5cm)進行反相層析，將收集分離組分於-S(TC凍幹機內分步凍存即獲得純化的重 組HD5突變體多肽。 實施例3HD5突變體多肽的細胞毒性測定 接種vero細胞(非洲綠猴腎細胞)於96孔板中，接種密度為2000個細胞/孔， 接種體積為100 iU， vero細胞在含10%胎牛血清的1640培養液中培養24h至細胞完全貼 壁，棄培養液，換用含有不同濃度HD5突變體多肽的培養液繼續培養，每一濃度均重複5孔， 同時設置母本HD5多肽對照組和空白對照組。培養72h後，每孔加入CCK-8反應液10 yl， 37t:繼續培養4h，輕輕吸棄上清液，振蕩混勻，酶標儀測定490nm波長處吸光度值(A值)。 細胞存活率(％) 二藥物組A值/空白對照組A值X100%。結果顯示，在100iig/ml以內 HD5突變體多肽不會顯著影響細胞的增殖活性，而且相同濃度的HD5突變體多肽處理組與 母本HD5多肽處理組之間的細胞存活率沒有明顯差別，表明HD5突變體的細胞毒性沒有增 加。 實施例4HD5突變體多肽的抗病毒活性測定 首先常規方法製備HSV-2病毒液，並測定病毒的半數感染量(TCD5。)。接種vero細 胞於96孔板中，接種密度為2000個細胞/孔，接種體積為100 iU， vero細胞在含10 %胎 牛血清的DMEM培養液中培養24h至細胞完全貼壁，棄培養液，更換同時含有100倍TCD5。病 毒液和100ii g/ml HD5突變體多肽的DMEM培養液，培養液中的血清濃度可選擇為0X、2X、 10%、20%，同時設置正常細胞對照組(既不加病毒液，也不加HD5突變體多肽)、病毒對照 組(只加病毒液，不加HD5突變體多肽)和母本HD5多肽處理組(同時加入100倍TCDs。病毒 液和100 ii g/ml母本HD5多肽)。37。C培養48h後，每孔加入CCK-8反應液10 y 1， 37。C繼續 培養4h，輕輕吸棄上清液，振蕩混勻，酶標儀測定490nm波長處吸光度值(A值)。細胞保護 率=(藥物組A值-病毒對照組A值)/ (正常細胞對照組A值-病毒對照組A值)X 100 % 。 結果顯示，濃度為100 g/ml的HD5突變體多肽無論在有無血清存在的情況下，均可以顯著 保護vero細胞不被HSV-2感染，尤其在血清存在情況下，其保護效果顯著強於母本HD5多 肽(見圖1-4)。 結論本發明HD5突變體不僅具有高效、低毒的抗HSV-2病毒能力，而且其抗病毒 活性基本上不受血清存在的影響，從而使該突變體多肽既可以作為外用藥又可作為內用藥 應用於HSV、HPV及HIV等病毒感染性疾病的防治。
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權利要求
一種人α-防禦素5抗病毒活性突變體多肽，其特徵在於所述突變體多肽胺基酸序列如下Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser15 10 15Leu Ser Gly Val Cys Arg Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Cys20 25 30Cys Arg。
2. 製備權利要求1所述人a -防禦素5抗病毒活性突變體多肽的方法，其特徵在於所述的製備方法為固相化學合成法。
3. 編碼權利要求l所述的人a-防禦素5抗病毒活性突變體多肽的DNA序列，其具有如下序列GCC ACC TGC TAT TGC CGA ACC GGC CGT TGT GCT ACC CGT GAG TCC CTC TCCGGG GTGTGT CGT ATC AGT GGC CGC CTC TAC AGA CTC TGC TGT CGC。
4. 製備權利要求l所述人a-防禦素5抗病毒活性突變體多肽的方法，其特徵在於將權利要求3所述的人a -防禦素5抗病毒活性突變體多肽的DNA序列克隆到表達載體中，轉染宿主細胞，經誘導表達、純化，即得所述HD5突變體多肽。
5. 根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於所述的表達載體為質粒表達載體。
6. 根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於所述的宿主細胞包括原核細胞和真核細胞。
7. 根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於所述原核細胞為大腸桿菌細胞。
8. 根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於所述真核細胞為酵母細胞。
9. 權利要求l所述人a-防禦素5抗病毒活性突變體多肽在預防和治療單純皰疹病毒(HSV)感染或人乳頭瘤狀病毒(HPV)感染或人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的應用。
全文摘要
本發明涉及一種人α-防禦素5(HD5)抗病毒活性突變體多肽及製備方法和應用，所述突變體多肽的胺基酸序列的HD5中第21位穀氨酸被替換為精氨酸(E21R)。所述突變體多肽的製備方法，有固相化學合成法和基因工程製備法兩種。本發明的HD5突變體多肽在有無血清存在的情況下均具有高效的抗病毒活性，其抗病毒作用較母本HD5多肽顯著提高。本發明的HD5突變體多肽可以用於防治HSV、HPV及HIV等病毒的感染。
文檔編號A61P31/20GK101704886SQ20091019148
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月17日 優先權日2009年11月17日
發明者王軍平, 王崧, 王艾平, 申明強, 程天民, 粟永萍, 陳芳 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學