一種腺苷A2A受體標籤小鼠的構建方法
2023-05-28 15:13:23
一種腺苷a2a受體標籤小鼠的構建方法
技術領域
1.本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種腺苷a2a受體標籤小鼠的構建方法。
背景技術：
2.腺苷a2a受體是重要的藥物靶點，其拮抗劑可用於治療帕金森病(2019年美國fda批准)，或用於腫瘤治療的多項臨床試驗。先前有文章報導了一種a2a受體的轉基因小鼠，其構建方法過程中使用了長度為4.8kb的啟動子序列,在a2a受體後表達β-半乳糖苷酶基因。該小鼠存在的問題是，a2a受體在腦中的表達情況與已有的報導不一致，尤其在紋狀體區域沒有高豐度表達。這導致該小鼠品系一直無法用於針對a2a受體的基礎研究。
技術實現要素：
3.腺苷a2a受體免疫染色或免疫分離的抗體特異性較差，從而無法準確研究該受體在體內的分布情況以及可能的相互作用蛋白。為了解決上述缺陷與不足，本發明提供了一種腺苷a2a受體標籤小鼠的構建方法。
4.本發明採用的技術解決方案是：一種腺苷a2a受體標籤小鼠的構建方法，包括以下步驟：在體外轉錄cas9 mrna，預測小鼠基因組中獨特的靶點從而設計grna，在體外轉錄grna，通過in-fusion克隆方法構建供體載體，將cas9mrna、grna mrna和供體載體顯微注射到c57bl/6小鼠的受精卵中獲得陽性f0小鼠，將陽性f0代小鼠與野生型c57bl/6小鼠交配，獲得穩定的f1代小鼠。
5.所述的通過in-fusion克隆方法構建供體載體的步驟如下：
6.提取c57bl/6小鼠鼠尾的基因組dna，並以此為模板，使用對應的arm-f/r引物對分別進行pcr擴增，得到對應的5』端和3』端同源臂pcr片段，將3xha-2xmyc片段直接合成到peasy-blunt載體上，以含有3xha-2xmyc片段的peasy-blunt質粒為模板，以3xha-2xmyc-f/r為引物對，進行pcr擴增，得到3xha-2xmyc pcr片段，將獲得的5』端同源臂pcr產物、3』端同源臂pcr產物及3xha-2xmyc pcr產物片段進行純化回收，將純化好的三個pcr片段與線性化的hp361供體載體按比例進行混合，在重組酶的催化下，37℃反應30min。將反應產物轉化stbl3大腸桿菌感受態，鋪板，挑選單克隆，利用m13-f(100)/m13-r引物進行單克隆菌液pcr鑑定，將陽性單克隆進行sanger測序驗證，獲得hp361 donor供體載體。
7.所述的5』端同源臂pcr產物的核苷酸序列如seq id no：1所示。
8.所述的3』端同源臂pcr產物的核苷酸序列如seq id no：2所示。
9.所述的3xha-2xmyc pcr產物片段的核苷酸序列如seq id no：3所示。
10.所述的線性化的hp361供體載體採用ecori與hindiii雙酶切進行線性化。
11.所述的線性化的hp361供體載體的核苷酸序列如seq id no：4所示。
12.所述的hp361 donor供體載體的核苷酸序列如seq id no：5所示。
13.所述的3xha-2xmyc pcr產物片段的標籤蛋白的胺基酸序列如seq id no：6所示。
14.所述的arm-f/r引物對和3xha-2xmyc-f/r引物對的引物序列為，
15.adora2a-5'arm-f2：atgaccatgattacgccaagcttggacgtggtacccatgaattacatg；
16.adora2a-5'arm-r2：ggaaggggcaaactctgaagacc；
17.adora2a-3'arm-f2：tgagggaaagacattttaatatttttggg；
18.adora2a-3'arm-r2：gtgtgatggatatctgcagaattccacagggcagctctgaac；
19.3xha-2xmyc-f：cagagtttgccccttcctac；
20.3xha-2xmyc-r：attaaaatgtctttccctcacagatc。
21.本發明的有益效果是：本發明提供了一種腺苷a2a受體標籤小鼠的構建方法，通過在a2a受體基因的c端添加標籤蛋白序列構建新的小鼠品系，從而可利用標籤蛋白的特異性抗體研究a2a受體的分布和互作蛋白。在本發明構建的a2a-tag小鼠中，a2a受體在紋狀體區域高豐度表達，在多個腦區可檢測到該受體的低豐度表達。
附圖說明
22.圖1為本發明構建方法流程示意圖。
23.圖2為本發明構建的a2a-tag小鼠利用針對tag標籤蛋白的特異性抗體進行染色的結果圖。
24.圖3為本發明構建的a2a-tag小鼠進行多種行為學範式檢測的結果圖。
25.圖4為本發明構建的a2a-tag小鼠在杏仁核區檢測到a2a受體的表達圖。
26.圖5為本發明構建的a2a-tag小鼠在外側隔區檢測到a2a受體的表達圖。
具體實施方式
27.以下結合附圖和下述實施方式進一步說明本發明，應理解，附圖和下述實施方式僅用於說明本發明，而非限制本發明。
28.實施例1通過in-fusion克隆方法構建供體載體
29.donor構建流程如下：提取c57bl/6小鼠鼠尾的基因組dna，並以此為模板，使用對應的arm-f/r引物對分別進行pcr擴增(表1)，得到對應的5』端和3』端同源臂pcr片段。5』端同源臂pcr產物的核苷酸序列如seq id no：1所示，3』端同源臂pcr產物的核苷酸序列如seq id no：2所示。
30.將3xha-2xmyc片段直接合成到peasy-blunt載體上，以含有3xha-2xmyc片段的peasy-blunt質粒為模板，以3xha-2xmyc-f/r為引物對(表1)，進行pcr擴增，得到3xha-2xmyc pcr片段。3xha-2xmyc pcr產物片段的核苷酸序列如seq id no：3所示。
31.將獲得的5』端同源臂pcr產物、3』端同源臂pcr產物及3xha-2xmyc pcr產物片段進行純化回收，使用分光光度計進行dna濃度測定。按照multis one step cloning kit試劑盒(諾唯贊，c113)說明書進行操作，將純化好的三個pcr片段與線性化的hp361載體(ecori與hindiii雙酶切進行線性化，線性化的hp361供體載體的核苷酸序列如seq id no：4所示)按比例進行混合，在重組酶的催化下，37℃反應30min。將反應產物轉化stbl3大腸桿菌感受態，鋪板，挑選單克隆，利用m13-f(100)/m13-r引物進行單克隆菌液pcr鑑定，將陽性單克隆進行sanger測序驗證，獲得hp361 donor載體(hp361 donor供體載體的核苷酸序列如seq id no：5所示)。將測序正確的單克隆菌液進行復甦和擴增，質粒中提(tiangen，cat.#dp118-02)。中提的質粒通過酶切質檢和測序質檢後，保存於-20℃，用於後
續實驗。
32.表1擴增donor模板所用引物序列
[0033][0034]
實施例2構建腺苷a2a受體標籤小鼠
[0035]
我們使用crispr/cas9技術修飾a2ar基因。簡單的過程如下：參考文獻在體外轉錄cas9 mrna。使用軟體工具crispor(http://crispor.tefor.net/)預測小鼠基因組中獨特的靶點從而設計grna。根據說明書，使用t7高產rna轉錄試劑盒(vazyme)在體外轉錄grna。通過in-fusion克隆方法構建供體載體(如實施例1)。將cas9 mrna、grna mrna和供體載體顯微注射到c57bl/6小鼠的受精卵中。經pcr和測序證實受精卵移植獲得陽性f0小鼠，將陽性f0代小鼠與野生型c57bl/6小鼠交配，獲得穩定的f1代小鼠。
[0036]
實施例3
[0037]
將實施例2構建的a2a-tag小鼠，利用針對tag標籤蛋白的特異性抗體進行染色，結果如圖2所示，在構建的a2a-tag小鼠中，a2a受體在紋狀體區域高豐度表達。在杏仁核區和外側隔區，如圖4、5所示，檢測到a2a受體的低豐度表達。這與已有的研究結論是一致的。其中綠色區域是紋狀體，其它腦區無陽性信號。
[0038]
實施例4構建的a2a-tag小鼠進行多種行為學範式檢測
[0039]
結果如圖3所示，構建的a2a-tag小鼠生長正常，利用曠場實驗進行運動能力檢測，利用懸尾實驗和高架迷宮實驗進行焦慮和抑鬱等情緒檢測。結果發現，與同窩野生型小鼠相比，a2a-tag小鼠均不存在異常。
[0040]
各位技術人員須知：雖然本發明已按照上述具體實施方式做了描述，但是本發明的發明思想並不僅限於此發明，任何運用本發明思想的改裝，都將納入本專利專利權保護範圍內。
[0041]
以上所述僅是本發明的優選實施方式，本發明的保護範圍並不僅局限於上述實施例，凡屬於本發明思路下的技術方案均屬於本發明的保護範圍。應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理前提下的若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。