用於生產脂肪酶的方法、能產生所述脂肪酶的轉化解脂耶氏酵母細胞以及它們的應用的製作方法

2023-06-21 12:02:46

專利名稱：：用於生產脂肪酶的方法、能產生所述脂肪酶的轉化解脂耶氏酵母細胞以及它們的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種通過使用產生耐酸的重組體脂肪酶的解脂耶氏酵母(l^row/fl/^0(K/ca)細胞來生產脂肪酶的方法，該方法允許生產能用作藥物的脂肪酶；本發明還涉及一種過度產生耐酸重組體脂肪酶的解脂耶氏酵母菌株及其應用。
背景技術：
：人類每日攝取的食品主要由脂類、蛋白質和糖組成。在它們被吸收之前，所有這些組成要經受消化道內的酶的催化水解。這些酶中任何一種的缺乏可以因此引起消化紊亂，並且導致相當嚴重的營養不良。即，例如，在一些病態情況的病例中，比如囊性纖維化或外分泌胰腺的不足與胰脂酶缺乏有關。為校正這些缺乏，通常建議口服給藥胰腺提取物。然而，這些療法的效率受限於如下事實這些提取物中所含的酶(脂肪酶、澱粉酶和蛋白酶)會因胃介質的酸性而快速失活。因此，有人建議使用抗胃環境的脂肪酶製劑，比如，其例子有通過基因工程生產的哺乳動物胃脂肪酶製劑，比如申請人為於文尼爾研究股份公司(INSTITUTDERECHERCHEJOUVENIALSA)的法國專利申請公開2699179描述的製劑、或者在酸性介質中具有適當活性的微生物脂肪酶製劑[ZENTLER-MONRO等，Pancreas,7,311-319(1992)]。在酸性介質中有活性的微生物脂肪酶中，可能會尤其提到真菌脂肪酶，比如來自歐諾比假絲酵母(CamfWa[YOSHIDA等，Biochim.Biophys,Acta.;154,586-588(1968)]、來自星狀絲孢酵母(7>/c/205porawaWera/fl0[DHARMSTHITI等，Biotechnol.Appl,Biochem.,26,111-116(1997)]、來自爪哇根黴(i/n'zo/w^)avaw'ciw)[UYTTENBROECK等，Biol,Chem.HoppeSeyler,374,245-254,(1993)]、或來自解脂耶氏酵母[HADEBALL，ActaBiotechnol.,2,159-167(1991);NOVOTNY等，J.BasicMicrobiol.28,221-227(1988)]的那些真菌脂肪酶。除了它們在酸性pH下的活性之外，這些脂肪酶當它們的底物存在時，具有通常的抗蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶)消化的特性，並且具有抵抗膽鹽作用的特性(當存在lOmM牛磺膽酸鈉時它們的活性可保持)。已經有人描述了解脂耶氏酵母用於生產所研究基因的應用。因此，申請人為INRA和CNRS的專利申請EP1108043描述了包含所研究基因的表達盒和Zeta序列(zetasequences)的整合載體的應用，該整合載體對應於解脂耶氏酵母Ylt逆轉錄轉座子的LTR序列。這樣的表達載體允許將插入所研究基因的數個拷貝非同源地並且分散地整合入缺乏Zeta序列的解脂耶氏酵母菌株的基因組DNA中。該系統尤其已經用於將編碼脂肪酶的丄/屍2基因整合入解脂耶氏酵母DNA，並且已經允許在培養基條件(未詳述)下，與未轉化的菌株相比，轉化菌株分泌的脂肪酶量高出10至15倍。其他研究描述了如專利申請EP1108043所述的相同表達載體用於在解脂耶氏酵母中產生重組體脂肪酶的應用(國際申請WO01/83773;PIGNEDE等，JournalofBacteriology,vol.182,No.10，p.2802-2810(2000)以及PIGNEDE等,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,vol.66,No.8,p.3283-3289(2000))。具體為:-國際申請WO01/83773，申請人為法國米奧裡大藥廠(LaboratoiresMAYOLYSPINDLER)，描述了解脂耶氏酵母MS4克隆(CNCMI-2294)的產生，該MS4克隆包含被整合入其DNA的10個拷貝的基因表達盒、並且描述了其用於生產脂肪酶的應用，產率為每升培養液上清液含有0.5g左右的脂肪酶、以及使用橄欖油作為底物測得的12,000U/ml的催化活性，其中一個活性單位對應於每分鐘能夠催化釋放1)Limol脂肪酸的酶量，即，超過原始菌株200倍。然而，該申請所述的產生脂肪酶的方法的主要缺點在於其使用了含有細菌用蛋白腖(bactopeptone)或細菌用胰腖(bactotryptone)的培養基。這些未被表徵並且含有各種蛋白質水解物的產物通常用作氮源和碳源。因此，該申請所述的方法不可能得到可以直接用作藥物的脂肪酶。-PIGNEDE等(JournalofBacteriology,2000)更具體地表徵了被解脂耶氏酵母(POld菌株)丄/屍2基因編碼的胞外脂肪酶。在本文中描述了下面的研究內容從各種野生型菌株(缺乏Yltl的POld和含有Yltl的E150)以及從包括JMY184(POld-6-15)和JMY279(POld-6-17)在內的各種重組菌株分泌脂肪酶的情況，以及轉化體JMY184的脂肪酶過度產生情況。PIGNEDE等的文章比較了被野生型菌株、突變株和根據如上所述方法(國際申請WO01/83773)得到的重組菌株的脂肪酶生產情況。野生型菌株分泌的脂肪酶為30-50U/mL，而在N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NNNG)的作用下得到的突變株在優化培養條件下產生的脂肪酶多出25倍，即1200U/mL的脂肪酶，該優化的培養條件涉及含有蛋白腖的培養基(預培養培養基)和含有乳清的培養基(發酵培養基)(也請參見DESTAIN等，1997)。藉助於該表達盒中的包含受POX2啟動子和非同源整合調節的丄/屍2基因的呈多拷貝和呈分散方式的構造，得到了重組菌株。PIGNEDE等得到了穩定的轉化體(例如菌株JMY184)，其在未優化的條件下，即在YPDH培養基(包含10g/L酵母浸膏、10g/L細菌用蛋白腖、10g/L的葡萄糖和10g/L的橄欖油)中產生2000U/mL的脂肪酶，相當於約0.5g脂肪酶/L上清液。以如上所述相同的方式，PIGNEDE等和DESTAIN等描述的脂肪酶製劑不適用於醫療用途，並且尤其不適合於臨床批量的製備，因為它們的生產需要使用含有蛋白腖或乳清的培養基。-在其文獻中，PIGNEDE的研究小組(AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2000)研究了用包含丄"2基因表達盒的載體轉化的解脂耶氏酵母菌株。該作者發現，對於8種這樣的轉化體，￡/屍2基因表達盒的拷貝數在6和16之間(平均10個拷貝)，這導致在不同的基因座處所述表達盒發生2至15次整合。該JMY184菌株因此包含12個拷貝的在4個不同的基因座處整合的丄/屍2基因表達盒。此外，該作者更具體地研究了該JMY184轉化體。他們確認，JMY184菌株在豐富的YPDH培養基(含有細菌用蛋白腖)上培養會產生0.5g脂肪酶/L上清液，使用橄欖油作為底物進行測量時，該上清液的活性為1500U/mL(相對地，野生型菌株POld為50U/mL)。根據這些數值可以推定脂肪酶的比活性為約3000U/mg。該作者另外報告到，優化JMY184菌株在發酵罐中的脂肪酶生產可以得到活性高達10,000U/mL的製品。然而，作者未公開得到該結果的培養條件。在該文獻中，作者另外研究了這些轉化體在培養基中的穩定性，尤其是JMY184克隆的穩定性，並且顯示它們的穩定性為120代。PIGNEDE等認為，為了優化脂肪酶的生產，待考慮的因素是轉化體的穩定性和培養條件。此外，他們顯示，在整合的￡/屍2基因的拷貝數和脂肪酶的過度產生之間有強相關性。然而，對於脂肪酶的生產，在該文獻中公開的僅有的培養基是含有蛋白腖的培養基，比如豐富的YPDH培養基。生產脂肪酶的現有技術方法，即使它們使得到提高的脂肪酶產率成為可能，也不適用於適合醫療目的的脂肪酶的生產。實際上，通常使用的培養基全部含有未被表徵的動物來源的混合物和/或產物，比如蛋白腖、胰腖或乳清。因此需要開發允許生產適合醫療使用的重組體脂肪酶製品的體系。
發明內容為了解決該問題，本發明人開發了用於生產脂肪酶的方法，其與現有技術生產的方法相比能更好地滿足這些需要。更具體地講，本發明人開發了一種用於生產脂肪酶的方法，其中使用的培養基不含上述產物，即，培養基不包含動物來源的產物並且不包含未被表徵的混合物比如蛋白腖、胰腖或乳清。本發明人另外還篩選出一種新穎的用於生產脂肪酶Lip2的重組體解脂耶氏酵母菌株，該菌株與所述方法相結合可以顯著地提高脂肪酶的產率。因此，本發明的主題是一種使用被載體轉化的解脂耶氏酵母菌株用於生產脂肪酶的方法，該載體包含用於表達酵母耐酸脂肪酶的表達盒，其特徵在於，使用的培養基不包含動物來源的產物或未被表徵的混合物，比如蛋白腖、胰腖或者乳清。更具體地說，本發明的主題是一種用於生產脂肪酶的方法，該方法包括a)在允許脂肪酶產生的條件下用於培養使用表達載體轉化的解脂耶氏酵母細胞的步驟，所述載體包含用於表達酵母耐酸脂肪酶的表達盒；b)用於回收由所述培養基的上清液產生的脂肪酶的步驟；該方法的特徵在於，用於培養的步驟a)是在不含由動物來源的蛋白質材料(例如乳清)或它們的酶消化產物(例如胰腖或蛋白腖)所組成的動物來源的產物或未被表徵的混合物的培養基中進行。根據所述方法的優選實施方式，根據步驟a)的所述培養基包含-作為氮源的無機氮，並且優選硫酸銨；-碳源，其選自於碳水化合物來源的碳源，多元醇例如甘油、以及脂類來源的碳源例如脂肪酸和甘油酯；以及-無機鹽、微量元素和維生素。根據所述方法的另一個優選的實施方式，步驟a)包括al)用於在含有碳水化合物來源的碳源的培養基中預培養如上限定的轉化的解脂耶氏酵母細胞的步驟；以及a2)所述細胞的發酵步驟，包括在含有碳水化合物來源的碳源的培養基中的細胞生長期，以及在含有選自短鏈、中鏈或長鏈三酸甘油酯的脂肪酸作為唯一碳源的培養基中的脂肪酶合成期。於是，發酵在允許細胞生長的第一種情況下進行，例如在存在碳水化合物來源的碳源時進行，以及在允許生物合成所述脂肪酶的條件下的第二種情況下進行，例如在存在脂肪酸型的化學誘導劑作為唯一碳源時進行，該化學誘導劑包括比如短鏈三酸甘油酯(例如三丁酸甘油酯)、中鏈三酸甘油酯(比如三辛酸甘油酯)或長鏈三酸甘油酯(例如橄欖油或者三油酸甘油酯)。優選進行發酵時，常數p02為15%~25%，並且優選pH小於6.5。例如發酵可以在下述條件下進行:空氣流量約為1wm，其中一個vvm單位是每液體體積每分鐘1體積的空氣(例如，對於一個30升的發酵罐，1wm等於301/min;而對於一個5升的發酵罐，1vvm等於51/min)。根據本實施方式的優越特徵，進行預培養步驟al)直至0D6,m值為3~10每1mL，並且在發酵步驟a2)中，當培養液的OD6oonm值達到60-70每1mL時開始所述脂肪酶合成期。根據本實施方式的另一個優越特徵，當OD6nm值達到300-350每毫升時啟動步驟b)。另外步驟b)可以包括bl)從所述培養液上清液中分離脂肪酶；b2)在步驟bl)中得到的脂肪酶的純化。這兩個步驟按本領域已知的傳統方法進行物理分離(過濾、層析、離心法)或者物理化學分離法(沉澱法)。從上清液中分離脂肪酶可以由本領域的技術人員進行，例如通過選自中空纖維切向過濾、正面過濾以及連續式或分批式離心法的技術進行。脂肪酶的純化尤其包括降低生物載荷(bioload)，g卩，微生物的存在，並且可以通過本領域的技術人員所熟知的任何合適的純化技術進行，例如選自過濾、分級沉澱、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾層析的技術。任選地，用於生產根據本發明的脂肪酶的方法也可以包括濃縮或富集步驟，該步驟包括提高製品中脂肪酶的濃度。這樣的步驟例如可以在提純步驟之後進行。也可以與該提純步驟同時進行。根據本發明的生產方法尤其有可能以約1至3g的純化脂肪酶每升培養液上清液的量生產出重組體脂肪酶。在特別優越的方式中，根據本發明的方法允許生產催化活性大於培養液上清液的15,000U/mL的重組體脂肪酶製品。優選所述製品的活性大於培養液上清液的20,000U/mL。在pH6時通過使用三辛酸甘油酯作為底物測定這些數值。脂肪酶製品的該活性值對於本申請上下文的藥劑開發尤其重要。實際上現在可以給藥劑量降低的根據本發明方法生產的脂肪酶，同時保持足夠的效力以得到欲期的治療效果，例如可以是與脂肪酶缺乏有關的胰腺不足相關的脂肪吸收障礙的矯正。現在根據本發明的方法，在無需動物來源的產物的情況下通過使用重組體解脂耶氏酵母菌株可以生產出脂肪酶Lip2，該事實成為重要的優勢，並且大大地促進了脂肪酶用於醫療目的的應用。用於獲得在本發明的方法中使用的重組體解脂耶氏酵母細胞的表達載體是一整合載體，其具有至少一個拷貝的丄/屍2基因和用於調節表達的元件。然後該載體可以被整合入質粒DNA或者整合入酵母的基因組DNA。整合載體的一個尤其優選的例子是如國際申請WO01/83773所述的載體JMP6或載體JMPIO。載體JMP6包含有丄/屍2基因的表達盒，其編碼解脂耶氏酵母Lip2脂肪酶的Lip2p前體，其上遊設置用於醯基CoA氧化酶AC02的稱為POX2的解脂耶氏酵母啟動子。載體JMP10也包含LIP2基因，其上遊是用於Lip2脂肪酶的解脂耶氏酵母啟動子。這兩種啟動子可被三酸甘油酯和脂肪酸誘導。在這些載體中的各個中，表達盒和啟動子被設置在如上所述Zeta序列之間。該整合可以是靶向整合，即針對某位點，或者是隨機的整合。因此，當轉化的解脂耶氏酵母菌株不含Zeta序列時(例如，P01d菌株的情形)，表達盒的整合分散於所述菌株基因組DNA中。另一方面，當解脂耶氏酵母菌株包含Zeta序列(例如，E150菌株的情形)時，整合主要針對這些序列。根據所述方法的另一個優選的實施方式，轉化的解脂耶氏酵母菌株優選是稱為YL-LIP2-6C的菌株，該菌株於2005年12月15日保藏在法國培養物和微生物國家保藏中心(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes，C.N.C.M.，28rueduDocteurRoux,75724ParisCedex15)，保藏編號為1-3542。該YL-LIP2-6C菌株遺傳學穩定。為本發明的目的，在此使用的術語"穩定"、"遺傳學穩定"、"基因穩定"及其變化表述是指，對於將所研究的核酸整合入克隆的DNA而言相同數量的基因座至少保持30代。選用30代這一數量作為計算遺傳穩定性的基礎，是因為本發明人注意到該數量對應於細胞群的許多次複製，足以允許使用一方法進行脂肪酶的生產，所述方法包含至少一個預培養重組體解脂耶氏酵母細胞的步驟和一個在適當的發酵條件下生產脂肪酶的步驟。為本發明的目的，世代被定義為細胞群的複製，並且可以根據公式Y^XX2S計算，其中Y是在時間t時的細胞群(例如，表示為細胞密度)；X是在時間to時的啟始細胞群，並且g代表細胞群從數值X至數值Y所必需經過的傳代數。優選在至少30代以後，當至少90%的被分析菌落含有與起始克隆相同數量的所研究基因的基因座時，克隆被認為是遺傳學穩定的。因此，作為明顯的例子，克隆YL-LIP2-6C被認為是穩定的，這是因為在100代後，幾乎100%的被分析菌落含有6個ZJ戶2基因的基因座(一個基因座對應於用於整合丄/屍2基因的表達盒的內源性丄/屍2基因+5個基因座)。令人驚訝的是，當根據本發明的方法使用這一特殊的菌株時，本發明人成功地大量地生產出重組體脂肪酶，並且在整個所述生產期間進行較好的控制。本發明人的確成功地提高了脂肪酶的產率，並且尤其能夠得到1~3g純脂肪酶每升培養液上清液的產率。他們也能得到活性接近20,000U/mL的脂肪酶製品。為本發明的目的，脂肪酶的活性對應於其酶催化活性。脂肪酶溶液的催化活性表示為單位(U)每毫升分析溶液。比活力表示為單位(U)每毫克純化蛋白質(脂肪酶)。一個單位相當於每分鐘能夠催化釋放1pmol脂肪酸的酶量。脂肪酶的比活力根據用作底物的三酸甘油酯的性質變化。除提高脂肪酶的產率之外，本發明人也能提供生產方法較好的再現性，提高最終產品的均一性，並且改善用於純化脂肪酶的條件。因此，這些各種改進可以獲得滿足醫療用途所需條件的脂肪酶。事實上，在他們的研究的上下文中，本發明人現在已經觀察到，Lip2脂肪酶在pH值大於3並且直至pH值接近8的範圍內具有活性，最優的活性在pH56之間。另一方面，其在pH3或者pH8.5下保溫2小時會不可逆地失活。經分析，Lip2脂肪酶的比活力也與不同的底物有關，並且本發明人因此測定在pH4下純化脂肪酶對於短鏈三酸甘油酯(三丁酸甘油酯)、中鏈三酸甘油酯(三辛酸甘油酯)和長鏈三酸甘油酯(橄欖油)的比活力值分別為約10,760U/mg、約16,920U/mg和約12,260U/mg。最後，本發明人驚訝地觀察到，Lip2脂肪酶在膽鹽存在時具有活性，並且該活性隨著膽鹽的濃度而增加。直到現在，僅僅發現與輔助脂肪酶相結合的胃脂肪酶和胰脂酶在膽鹽存在時具有這種活性。因此，具有較高比活性的Lip2脂肪酶的應用不需要輔助脂肪酶的存在。克隆YL-LIP2-6C含有數個拷貝的該Lip2脂肪酶的表達盒，導致在不同的基因座處產生5次￡/屍2基因的整合。當置於適合產生脂肪酶的條件下時，相比現有
技術領域：
的轉化解脂耶氏酵母菌株，克隆YL-LIP2-6C生產出更多的脂肪酶。脂肪酶的產率大於1g/L培養液上清液，即，大於如上所述觀察到的現有
技術領域：
克隆的產率。本發明的主題還涉及脂肪酶製品，其可以通過根據本發明的方法而得到。根據所述脂肪酶製品的優選實施方式，當按如上所指出的方法測定時，其活性至少等於15,000U/ml，優選大於20,000U/ml。另外，本發明的主題還涉及根據本發明的脂肪酶製品用於製備藥物的應用，其目的在於治療與脂肪(例如短鏈、中鏈或長鏈脂肪酸)吸收失調有關的疾病，尤其是與胰腺不足、特別是外分泌胰腺不足相關的疾病。本發明的主題還涉及一種藥物，其特徵在於，其包含如上限定的脂肪酶製品。本發明的主題還涉及一種用載體轉化的解脂耶氏酵母菌株，所述載體用於表達酵母耐酸脂肪酶，其特徵在於，該菌株是稱為YL-LIP2-6C的克隆，其於2005年12月15日保藏在法國培養物和微生物國家保藏中心(C.N.C.M.，28rueduDocteurRoux，75724ParisCedex15)，保藏編號為1-3542。另外，本發明的主題還涉及如上限定的細胞用於生產酵母耐酸脂肪酶的應用。除前述特徵外，本發明還包括如下說明書中出現的其他特徵，下面參照實施本發明方法的實施例和下述附圖，對這些特徵進行描述-圖1顯示了用於在生產脂肪酶的方法期間控制YL-LIP2-6C克隆的遺傳穩定性的總體方法。-圖2顯示了在發酵工藝期間，在600nm下光密度(OD6,m，左側Y軸)的變化(--)和生長速率(h-1，右側Y軸)的變化(-■-)與時間(小時，X軸)的關係。箭頭顯示了誘導脂肪酶的產生。-圖3顯示了在不同的基因座處將ZJ屍2基因整合入23個菌落的基因組(車道24至43)的整合次數的Southernblot分析，菌落收集時間點T33對應於發酵結束，即在發酵開始後約100小時。拷貝數16:6個丄/屍2基因的基因座(5個用於整合丄/屍2基因表達盒的基因座+1個用於內源性Z/屍2基因的基因座)。M:大小標記。-圖4顯示了在T16至T33的生產期間YL-LIP2-6C克隆產生重組體脂肪酶的SDS-PAGE監測情況。箭頭顯示了誘導產生脂肪酶(T17，發酵48小時)。M:分子量梯度；右手部分凝膠中的五個泳道對應於已知量(2.5嗎至20嗎)的純化Lip2脂肪酶。-圖5顯示了在時間點T33(發酵工藝終點)處上清液中脂肪酶純度的SDS-PAGE分析情況。MW:分子量梯度；參照Lip2F5:Lip2脂肪酶範圍1至10嗎；YL-LIP2-6C上清液被分析的上清夜的體積為iaL。-圖6顯示了通過MALDI-TOF型質譜分析法測定的YL-LIP2-6C克隆生產的重組體脂肪酶的質譜。具體實施方式實施例1-材料和方法1)使用的培養基顯示的最終濃度是母液中的濃度。未富集的基礎培養基02130Stableseeoriginaldocumentpage12另外富集培養基02130S包含下述添加劑tableseeoriginaldocumentpage12無機鹽溶液配方成分最終濃度MgS0426.76g/1CaCl26.40g/1FeS045.61g/1CoCl20.29g/1ZnS047.72g/1Na2Mo040.09g/1H3B030.34g/1MnCl20.47g/1CuS040.61g/1FeS04溶液配方成分最終濃度FeS040.9g/1氨水溶液，14%消泡液StruktolJ673稀釋至1/10倍(Schill+SeilacherAG，MoorfleeterStr28，22113，漢堡，德國)2)基因組DNA的提取和Southernblot分析"J基鵬腦遊連欲將由4mL培養物中得到的細胞團粒懸浮在0.5mL的山梨糖醇緩衝液(0.9M山梨糖醇；0.1M的tris-HCl，pH8.0;0.1MEDTA)中。以0.28M的濃度添加50的Zymolase20T(6mg/mL)(Euromedex，67458MundolsheimCedex，法國)、50|uL的2-巰基乙醇，並且將溶液在37°C下攪拌(180rpm)保溫1小時。溶液離心，並且將細胞團粒懸浮在0.5mL的TE緩衝液(50mM的tris-HCl，pH8;20mMEDTA)中。添加50的10%SDS，通過倒置混合溶液，並且在65。C下保溫20分鐘。添加0.2mL的5M乙酸鉀，然後混合溶液，並且在冰中保持30分鐘，然後離心5分鐘。將上清液轉移至1.5mL試管中，然後添加0.8mL預先在冰中冷卻的100%乙醇。通過倒置混合溶液，然後離心。在除去上清液後，添加0.4mL含有100^g/ml的RNaseA(Invitrogen，美國)的TE緩衝液，並且將溶液在37。C下保溫1小時。在添加1mL預先在冰中冷卻的100%乙醇後，輕輕地混合溶液，直至DNA沉澱，然後離心。除去上清液，然後將DNA團粒在大氣中自然乾燥，然後懸浮在100)iL的無菌水中，然後在4。C下保溫過夜。通過測定260nm(A260)和280nm(A280)下的吸光度，測量基因組DNA的濃度。將1嗎的基因組DNA與無菌水混合至42.5)aL的最終體積。添加5的緩衝液(5X)和2.5iliL的HindIII(50uL)(Invitrogen，美國)，並且將溶液在37。C下4小時。cJ5birf/ernWo/分析按照從羅氏診斷公司(RocheDiagnostic)購買的"DIGHighPrimeDNALabelingandDetection"試劑盒所述的工序，進行Southernblot型轉印。"標記辭藩工,藉助於酶PhusionDNA聚合酶(Finzyme)和下述兩種引物，通過在基因組DNA上進行PCR，得到了對應於編碼Lip2脂肪酶的完整基因的探針正義引物5'誦GTGTACACCTCTACCGAGACCTCT-3'(SEQIDNo.1)反義引物5'-TTAGATACCACAGACACCCTCGGT-3'(SEQIDNo.2)在PCR反應後，藉助於"NucleospinExtractII"試劑盒(MachereyNagel)，將探針進行凝膠純化。然後藉助於購自羅氏公司的"DIGhighprimeDNAlabeling"試劑盒，對純化的探針進行金標記(digoxygenin)。"凝^"分庸、ZM^轉伊浙,號檢漱將2嗎的HindIII消化的DNA與加載的緩衝液混合，然後在0.8%瓊脂糖凝膠上沉澱。在50V下進行2小時30分鐘的遷移，然後將DNA轉印到Hybond+薄膜(AmershamBioscience公司)上。利用在薄膜上標記探針的雜交、接著通過X-射線曝光目測，檢測基因組DNA中丄/屍2基因的基因座數量。3)蛋白質濃度的測定通過Bradford方法測定蛋白質濃度。藉助於Bradford方法直接在發酵培養的上清液上進行蛋白質定量。將這樣測定蛋白質的量與純化Lip2脂肪酶的已知量相比較。在試管內，將20的標準樣以適當的稀釋度與1mL含有染料的經稀釋(5倍)的試劑混合。然後相對於得到的對照物(單獨的稀釋染料)OD595值來測定樣品OD595值。4)重組體脂肪酶比活力的測量藉助於pH滴定設備(RADIOMETER),於37°C下對脂肪酶的活性進行電位滴定法測量。使用的底物是三辛酸甘油酯。使10mM的底物在15mL含有1mMtris-HCl(pH5.5)、150mMNaCl,5mMCaCl2和4mM牛磺脫氧膽酸鈉(sodiumtaurodeoxycholate)(SIGMA公司)的反應緩衝液中乳化。將比活力單位定義為每分鐘每毫克蛋白質釋放1pmol脂肪酸。5)變性條件下的聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將包含25%含有SDS和還原劑的混合物的12pL的樣品加載至4-12%的bistris凝膠(Biorad)上。在160V下進行45min遷移。然後通過用考馬斯亮藍(Coomassieblue)染色來分析凝膠。6)通過MALDI-TOF(基質協助雷射解吸電離-飛行時間)型質譜分析法，測定YL-LIP2-6C克隆生產的Lip2脂肪酶的分子量通過使用購自PerseptiveBiosystems公司(麻薩諸塞州(Framingham)，MA)、具有在337nm發射的氮雷射器的"VoyagerEliteXLtimeofflight"質譜儀，進行雷射解吸/電離型質譜分析。通過使用具有25kV加速電壓、0.3%柵極電流、0.3%離子引導電流、以及IOOOns停滯時間的線性的和延遲抽出模式(delayedextractionmode),得到了Lip2蛋白質正離子模式(positivemode)的質譜。每一個光譜都是100個雷射脈衝方式的結果。將待分析的材料與相等體積的芥子酸(Fluka)飽和溶液混合，所述芥子酸飽和溶液是在含有50%(v/v)乙腈/三氟乙酸水溶液的溶液中製備的。將2jaL等分的這種混合物沉澱在不鏽鋼樣品平板上，並且在進行分析之前在大氣中自然乾燥。藉助a-糜蛋白酶原A(Sigma),進行外部校準。表示的數值是平均值，並且對應於離子[M+H]+。實施例2—表達載體的構建和YL-LIP2-6C克隆的產生通過用專利申請EP1108043所述的、稱為JMP6的、並且包含編碼解脂耶氏酵母Lip2脂肪酶的Lip2p前體的丄/屍2基因的表達載體來轉化不含Zeta序列的解脂耶氏酵母菌株POld，得到了YL-LIP2-6C菌株，所述￡/屍2基因的上遊是AC02啟動子。如上所述，所述表達盒側翼為Zeta序列。根據專利申請EP1108043所述的方法，進行載體JMP6的構建和POld菌株的轉化。包含5個不同的用於丄/P2基因表達盒整合的基因座的該YL-LIP2-6C菌株於2005年12月15日保藏在法國培養物和微生物國家保藏中心(CNCM，28rueduDocteurRoux,75724ParisCedex15)，保藏編號為1-3542。實施例3-用YL-LIP2-6C菌株生產脂肪酶以及YL-LIP2-6C遺傳穩定性的驗證使用YL-LIP2-6C菌株用於生產脂肪酶的方法，該方法包括適合於產生脂肪酶的預培養步驟和發酵步驟。該方法的綜合法如圖l所示。然後分析這樣生產的脂肪酶的活性和質量。另外，通過測定i:/P2基因的表達盒的基因座數量，分析了YL-LIP2-6C的遺傳穩定性。1)生產方法豫潛斜撥縻將裝在甘油小瓶中的YL-LIP2-6C克隆保藏液解凍，並且取5|aL保藏液加入25mL的富集02130S培養基中，在250mL錐形瓶(ErlenMeyerbottle)中培養，所述培養基含有1%(v/v)的維生素溶液和1%(v/v)的微量元素溶液。將培養物在28。C下攪拌(180rpm)溫育36小時。將得到的25mL預培養物(預培養物1)接種入裝在2升錐形瓶中的200mL的富集02130S培養基中，在28。C下攪拌(180rpm)溫育36小時。將這樣得到的預培養物2(225mL)接種在發酵罐內的富集02130S培養基中。在發酵工藝的時間點TO處，將2mL的FeS04溶液添加至培養液。每隔6至9小時，將2至3mL的維生素溶液添加至發酵培養液，並且在發酵34小時後(在T12處)，啟動葡萄糖的供應。葡萄糖供應量逐漸提高持續14小時，然後在T17(對應於發酵48小時)中斷，然後啟動用油酸的誘導。在接下來的54小時，油酸的供應逐漸增加，然後在T33(發酵102小時)時OD6Q值達到340，終止發酵工藝。將最終的3升培養液離心(14,000rpm)。回收上清液並且在-20。C下儲存。潛譜遊顏在發酵期間，監測溫度、氧分壓和pH，並且分別保持在28。C、20%和6.2。大約每隔3小時，採集培養液樣品並且測量OD60值，以便監測生長速率的變化。結果顯示於圖2中。取兩個1mL該樣品的提取物，以14,000rpm離心5min，並且將細胞團粒和上清液在-20。C下儲存。表I顯示了發酵工藝的監測情況。表I:發酵工藝的監測tableseeoriginaldocumentpage17微藤錄眾任選地，進行用於純化脂肪酶的附加步驟。藉助於切向微過濾設備，在陶瓷薄膜(購自PALL公司的pilotX6型)上從培養液中分離脂肪酶，該薄膜允許尺寸大於截流尺寸(0.1pm)的酵母保留下來。首先以濃縮模式、然後以滲濾模式來回收含有脂肪酶的滲透液。根據廠商的介紹進行這些步驟，包括適當的改進。包含在滲透液中的微生物的濃度然後通過過濾(0.2pm)(Millipore公司)而降低，從而得到小於10cfu/mL的生物載荷。通過使用ProfuxM12設備(Millipore公司)，將脂肪酶溶液濃縮至約5升的體積，並且通過使用Biomax10kDa標準Pellicon薄膜進行切向超濾作用，以便除去低分子量的雜質。除去不包含脂肪酶的超濾液。然後按如上所述通過除去微生物，再次提純脂肪酶溶液，從而得到小於5cfu/mL的生物載荷。可以另外凍幹這樣純化得到的脂肪酶。3)YL-LIP2-6C生產的重組體脂肪酶的表徵",發,JT藝^^/l粼K-Z/屍2-6C朦樣主產遊i艨在各個測量點，對培養液樣品進行離心法，並且通過SDS-PAGE分析上清液。將75pL的上清液與75水混合，然後取5pL加載於26孔凝膠上。含有已知量Lip2脂肪酶的樣品也被分析。結果如圖4所示。通過將在發酵終止(T33)—時得到的脂肪酶量與已知量Lip2脂肪酶的斜率相比較，可以估計出在發酵100小時後得到的脂肪酶濃度是1.5g/L。此外，本發明人使用根據本發明生產脂肪酶的方法，最終體積約為35升，其使得脂肪酶的生產產率為13g每升培養液上清液。W節微度腳定贈娜微艨產鋪僻如實施例l所示(Bradford方法)測定培養液上清液中的蛋白質濃度。進行七次單獨的測量，並且上清液中蛋白質濃度是2.3g/L。通過SDS-PAGE估計上清液中Lip2蛋白質的純度。結果如圖5所示。純度估計為約70%。因此，使用YL-LIP2-6C克隆由發酵步驟得到的脂肪酶產率是1.6g/L。d^-丄/屍2-6C生產遊畫邀體遊嚴艨遊/"/r活力漱量如實施例1所示測量由YL-LIP2-6C克隆生產的脂肪酶的比活力。在緩衝液中將對應於發酵上清液的樣品稀釋100倍，該緩衝液含有50mM的Na2HP04、50mM的KH2P04、150mM的NaCl，pH6.0。在37°C下用三辛酸甘油酯進行3次獨立實驗而測定的催化活性是21,883.33U/mL上清液(表II)。表II:發酵上清液樣品活性的測量tableseeoriginaldocumentpage19從上清液中Lip2脂肪酶的估計濃度(參見上面)看，脂肪酶的比活力是13,675U/mg，可與為臨床研究生產的脂肪酶的比活力相比較。由YL-LIP2-6C克隆產生的脂肪酶的比活力符合臨床批量所需要的條件。W置雄微膽好量在離心後，無需純化，對發酵培養液上清液進行質譜分析(參見實施例l)。結果如圖6所示。觀察的主峰顯示了37,648Da的分子量。由YL-LIP2-6C生產的Lip2脂肪酶具有合理的分子量，這是因為該觀測值符合臨床批量所需要的條件，即37，500+A1000Da。該實施例顯示了穩定克隆YL-LIP2-6C的篩選(在該情況下，在30代後分析的100%克隆具有與初始克隆相同數量的丄/屍2基因的基因座)。另外，所述克隆的遺傳穩定性不受用於生產脂肪酶的培養條件的影響(在預培養期間；就在發酵之前；就在通過油酸誘導脂肪酶產生之前；在發酵終止)。3)YL-LIP2-6C克隆的遺傳穩定性在時間點T0、T17和T33篩選的菌落中，通過測定解脂耶氏酵母DNA中在不同的基因座整合的丄/屍2基因的表達盒的發生數，分析了YL-LIP2-6C克隆在包括預培養步驟和發酵步驟的生產脂肪酶方法期間的遺傳穩定性。離麟遂稀釋預培養物2的樣品(T0，發酵開始)、在T17時(就在誘導之前)和在T33時(發酵終點)發酵條件下的培養液樣品，在第一情況下稀釋至006=1，然後稀釋1000倍。將10nL的該稀釋溶液各自塗布在3個YPD培養基培養平板上。然後平板在28。C下溫育48小時，並且然後在4°C下儲存直到篩選出用於基因座數量分析的菌落。將20個來源於在發酵開始點(TO)收集的樣品的菌落、20個來源於就在誘導(T17)之前收集的樣品的菌落、和100個來源於在發酵終止時(T33)收集的樣品的菌落分別接種在4mL的富集02130S培養基中，然後培養72小時。接著，在30%甘油中製備保藏液，用於DNA的提取和Southernblot分析(見材料和方法部分)。"對f"0,來^fIT-丄/屍2-6C蘑樣遊蘑霧，粼定在不廚遊基茵座必丄/屍2基齒蕃合遊發生教對於在20個在時間點TO(發酵開始)收集的菌落上、20個在時間點T17(發酵48小時)收集的菌落上、和100個在時間點T33(發酵100小時)收集的菌落上的不同的丄/屍2基因的基因座整合的發生數的Southernblot分析結果如圖3所示。結果表明，分析的所有菌落都含有6個丄/屍2基因的基因座。因為野生型菌株含有一個拷貝的內源性ZJ屍2基因，因此YL-LIP2-6C菌株含有5個用於整合基因表達盒的基因座。因此YL-LIP2-6C克隆在100個小時發酵工藝期間是100%穩定的。權利要求1.一種用於生產重組體脂肪酶的方法，其包括a)培養用載體轉化的解脂耶氏酵母細胞的步驟，所述載體包含用於表達酵母耐酸脂肪酶的表達盒；以及b)從培養液上清液中回收用所述細胞生產的所述重組體脂肪酶的步驟，該方法的特徵在於，用於培養的步驟a)是在不含由動物來源的蛋白質材料或它們的酶消化產物所組成的動物來源的產物或未被表徵的混合物的培養基中進行的。2.如權利要求1所述的生產方法，其特徵在於，所述培養基包含-作為氮源的無機氮，並且優選硫酸銨；-碳源，其選自於碳水化合物來源的碳源、多元醇例如甘油、以及脂類來源的碳源例如脂肪酸和甘油酯；以及-無機鹽、微量元素和維生素。3.如權利要求1或2所述的生產方法，其特徵在於，步驟a)包括al)在含有碳水化合物來源的碳源的培養基中預培養轉化的解脂耶氏酵母細胞；a2)發酵步驟，包括在含有碳水化合物來源的碳源的培養基中的細胞生長期，以及在含有選自短鏈、中鏈或長鏈三酸甘油酯的脂肪酸作為唯一碳源的培養基中的脂肪酶生產期。4.如權利要求3所述的的生產方法，其特徵在於，所述發酵在15%~25%的恆定p02和pH小於6.5的條件下進行。5.如權利要求3或4所述的生產方法，其特徵在於，進行用於預培養的步驟al)直至OD,nm值為3~10每1mL，在用於發酵的步驟a2)中，當所述培養液的OD6Gnm值達到6080每lmL時，開始所述脂肪酶生產期。6.如權利要求1至5中任一項所述的生產方法，其特徵在於，當所述OD,nm值達到300-350每1mL時，進行收集所述脂肪酶的步驟b)。7.如權利要求1至6中任一項所述的生產方法，其特徵在於，步驟b)包括bl)從所述培養液上清液中分離所述脂肪酶；以及b2)純化步驟bl)中得到的脂肪酶。8.如權利要求7所述的生產方法，其特徵在於，採用從中空纖維切向過濾、正面過濾、和連續式或分批式離心中選出的技術來進行所述分離，採用從過濾、分級沉澱、離子交換層析、疏水交互作用層析、和凝膠過濾層析中選出的技術來進行所述純化。9.如權利要求1至8中任一項所述的生產方法，其特徵在於，步驟a)包含培養名為YL-LIP2-6C的克隆，所述克隆於2005年12月15日保藏在位於28rueduDocteurRoux,75724ParisCedex15的法國培養物和微生物國家保藏中心(C.N.C.M.)，保藏編號為1-3542。10.—種酵母耐酸的重組體脂肪酶製品，其特徵在於，該製品能夠通過如權利要求1至9中任一項所述的方法得到。11.如權利要求IO所述的製品，其特徵在於，所述製品在pH6時的催化活性至少為15,000單位每毫升培養液上清液，優選大於20,000單位每毫升培養液上清液，其中一個單位對應於當使用的底物是三辛酸甘油酯時每分鐘能催化釋放1iimol脂肪酸的酶的量，和/或所述製品中所述脂肪酶的濃度大於1g脂肪酶每升。12.如權利要求10或11所述的脂肪酶製品的應用，用於生產治療與胰腺不足相關的脂肪吸收不良綜合症的藥物。13.—種被載體轉化的解脂耶氏酵母細胞，所述載體包含酵母耐酸胞外脂肪酶的表達盒，其特徵在於，所述細胞是名為YL-LIP2-6C的克隆，所述克隆於2005年12月15曰保藏在法國培養物和微生物國家保藏中心(C.N.C.M.)，保藏編號為1-3542。14.如權利要求13所述的細胞用於生產所述酵母耐酸脂肪酶的應用。15.—種藥物，其特徵在於，包含如權利要求10或11所述的脂肪酶製品。全文摘要用於生產解脂耶氏酵母耐酸重組體脂肪酶的方法，該方法利用的培養基除其使用的物質外不含任何動物來源的產物或未表徵的混合物比如胰腖、蛋白腖或抗乳血清。可以生產過多量的脂肪酶Lip2的解脂耶氏酵母的重組菌株被稱作YL-LIP2-6C，該菌株於2005年12月15日保藏在法國培養物和微生物國家保藏中心(C.N.C.M.)，保藏編號為I-3542，本文還涉及其應用。文檔編號C12P21/02GK101506359SQ200680054940公開日2009年8月12日申請日期2006年6月15日優先權日2006年6月15日發明者伊夫·勒布隆,尼古拉斯·穆茲申請人:法國米奧裡大藥廠