來自尿的祖細胞及其使用方法

2023-06-13 12:49:31

專利名稱：來自尿的祖細胞及其使用方法
技術領域：
本發明大體上涉及從尿中分離細胞，以及所分離的細胞及其使用方法。
背景技術：
再生性藥物是組織工程的應用領域，其著眼於機體的損傷組織的再生。再生性藥 物的應用包括器官例如膀胱的重建或替換。很多疾病和損傷可引起膀胱的傷害或喪失，需要修復或替換該器官。具有先天性 異常例如膀胱外翻、後尿道瓣膜或脊髓脊膜突出(通常稱為脊柱裂)的兒童可以發展高壓 和高滲的低順應性膀胱。在美國，在成年群體中，膀胱癌是男性中第四常見的診斷的惡性腫 瘤，女性中是第九常見的診斷的惡性腫瘤。膀胱的基礎功能是提供可以在低壓下存儲尿並且在意志力控制下清空的寬敞的 容器。遭受包括膀胱功能喪失的痛苦的病人經歷其生活質量的顯著的消極改變，並且有腎 盂積水和腎衰竭的風險。當藥物治療不足時，通常需要進行膀胱重建，或膀胱成形術。目前，膀胱擴大術通 常是通過將去管狀的腸段置於膀胱中而實現的。雖然是功能性的，但是可以因使用用於泌 尿重建的腸段或胃瓣(gstric flap)產生幾種併發症。有害的副作用包括感染、腸堵塞、產 生粘液、電解液異常、穿孔和致癌性。因此，需要臨床上更適用的通過組織工程化再生的膀 胱重建過程。組織工程的進展已經證明可能通過使用接種原代培養細胞的生物可降解膜進 行膀胱重建(Kropp 等人(1996) J. Urol. 156 599 ；Atala 等人(1992) J. Urol. 148 658 ； Oberpenning等人(1999)Nat. Biotechnol. 17 149)。已經在人中證明了這個概念的可 行性，並且實現了膀胱重建和膀胱體積的擴大(Atala等人.(2006)The Lancet 367 1241-46)。用於實現成功的膀胱重建的生物材料支架包括非細胞的膠原基質和合成的聚合 物。膠原基質包括豬的膀胱黏膜下層膜(BSM)和小腸黏膜下層(SIS)，二者均含有正常細胞 生長、分化和功能所需的眾多的天然組分，包括膠原、糖蛋白、蛋白聚糖和功能性生長因子 (Hodde 等人(2001)Endothelium 8 11 ；Voytik-Harbin 等人(1997) J. Cell. Biochem. 67 478)。合成的聚合物支架包括聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)和乳酸-羥基乙酸的 共聚物(PLGA) (Oberpenning 等人(1999) Nat. Biotechnol. 17 149 ；Atala 等人(1993) J. Urol. 150 608)。自體膀胱細胞是用於無癌症病人中組織工程構建體的最常見的細胞來源。接種到生物材料支架的病人自己的培養細胞可以用作再生組織的框架。但是，為了獲得膀胱細 胞，需要進行侵入性組織活檢程序以便收穫細胞，這增加了醫療保健的代價並且伴有潛在 的併發症例如流血、感染和尿道或膀胱損傷。此外，由於在活檢前或活檢時對黏膜組織的破 壞，從膀胱活檢獲得的細胞有時候不能夠生長(Zhang&Frey (2003) Adv. Exp. Med. Biol. 539 907)。正在研究用於尿道重建的替代性細胞來源，包括胚胎、胎兒和成體幹細胞。幹細胞是自我更新的且非終末分化的，因此可產生各種類型的細胞。人類胚胎幹細胞對於組織 工程目的是有前途的(Frimberger 等人(2005)Urology65 827 ；Lakshmanan 等人(2005) Urology 65 :821)，但是存在免疫相容性、腫瘤形成和倫理學問題。發現胎兒或成體幹細胞 在宿主組織中只有非常稀少的數目，可能不能在培養中很好地擴增，且具有更加受限制的 分化潛能(Vogel (2001) Science 292:1820)。所以，目前幹細胞在組織工程上的臨床應用 可能是有限的。需要比通過活檢收穫自體細胞更優選的替代方案以用於尿道組織工程和細胞治 療，特別是當活檢不能獲得自體來源細胞時。

發明內容
本發明提供了產生尿祖細胞(UPC)培養物的方法，包括提供尿樣品；然後從所述 尿樣品中分離尿祖細胞。在一些實施方式中，所述分離步驟通過以下進行(a)從尿樣品中 收集細胞以提供粗製細胞樣品；和(b)從所述粗製細胞樣品中選擇尿祖細胞。在一些實施 方式中，所述收集步驟通過所述尿樣品的離心進行。在一些實施方式中，所述選擇通過將所述細胞平板接種於(plating)包含選擇性 細胞培養基的組合物中而進行。在一些實施方式中，所述選擇基於形態學而進行。在一些實 施方式中，所述選擇通過選擇對尿祖細胞特異的標記而進行，例如C-kit(CD117)、SSEA-4、 ⑶105、⑶73、⑶90、⑶133和/或⑶44。在一些實施方式中，尿祖細胞來自哺乳動物對象 (例如，人對象)。通過本文公開的任何方法製備的尿祖細胞是本發明的另一個方面。還提供了分離的尿祖細胞，其中所述細胞是c-kit陽性的，且其中所述細胞可分 化成選自下列的兩個或多個譜系尿道上皮、平滑肌、內皮和間質細胞。提供了將細胞接種到組織支架上的方法，包括提供UPC，分化UPC和將分化的細胞 接種到生物可降解的組織支架上。組織支架可包含膠原基質和/或合成的聚合物，例如聚 羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)或乳酸-羥基乙酸的共聚物(PLGA)。提供了治療有需要的對象的方法，包括提供膀胱組織基底(substrate)，其中所述 基底包含分化的UPC ；和將所述基底移植到病人中。基底可以包括膠原基質和/或合成的 聚合物，例如聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)或乳酸-羥基乙酸的共聚物(PLGA)。提供了試劑盒，所述試劑盒可包含適於尿樣品運輸的容器；培養基；一種或多種 抗生素；容納所述容器、培養基和抗生素的包裝體；以及任選地，使用說明書。本發明的另一個方面是如上所述的細胞在製備用於進行如上所述的治療方法的 藥物中的用途。本發明的前述和其它目標和方面通過本文的附圖和以下說明書更詳細地解釋。


圖1.提議的尿祖細胞(UPC)分化路徑的示意圖。圖2.經過體外培養的來自尿的祖細胞的顯微圖像。細胞可以在不存在飼養層細胞的條件下增殖。圖3.尿細胞培養物的細胞生長曲線。在10至12天內在6-cm培養皿中細胞從單 一細胞生長至匯合。圖4.螢光激活的細胞分選(FACS)圖像證明從尿中分離的細胞中存在祖細胞標記 物，例如 CD44、105、73、90 和 133。圖5.在從膀胱活檢獲得的人尿道上皮中(A-D)和UPC(E-H)中用 uroplakin(UPIa)、細胞角蛋白7、13、19、17和核酸進行免疫螢光染色的顯微圖像。圖6.用核酸和對平滑肌特異性的標記物雙染色的UPC的顯微圖像。圖像顯示源 自尿的平滑肌祖細胞表達平滑肌蛋白標記物，例如α-平滑肌肌動蛋白(ASM) (Α)、調寧蛋 白(Calponin) (B)、結蛋白和肌球蛋白(D)。圖7.體內移植後一個月的UPC-膀胱黏膜下層膜(BSM)和UPC-小腸黏膜下層 (SIS)構建體的組織學特徵。A. Masson三重(Trichrome)染色和UPC在SIS支架上生長的 檢測。B.在SIS基質上鑑定的Lac-Z標記的UPC。C.接種尿細胞的BSM移植物的蘇木精& 伊紅(Η&Ε)染色的部分。D.在BSM基質內記錄到UPC的人Χ/Υ染色體。圖8.在培養的尿細胞中觀測到的四種細胞類型內皮樣細胞、平滑肌樣細胞、上 皮樣細胞和間質樣細胞。圖9.通過FACS分析細胞的細胞特異性標記物ΑΕ1/ΑΕ3、結蛋白、波形蛋白和紅細 胞生成素。圖10.克隆的UPC的吉姆薩(Giemsa)帶核型圖在第6代顯示出正常的染色體式樣。優選實施方式詳述本發明涉及祖細胞和從尿中選擇和培養祖細胞的方法。有利地，尿中所發現的細 胞可以不需要組織活檢而獲得，免除了病人的不舒適度和可能的併發症。所有引用的美國專利參考文獻的公開均在這裡引入作為參考，達到其與本文的公 開一致的程度。如本發明的說明書和隨附的權利要求書所用的單數形式「一個」、「一種」和 「所述」也包括複數形式，除非上下文清晰地另有說明。此外，當提及可測定值，例如化合物 的量、劑量、時間、溫度等時，本文使用的術語「約」和「大約」是指包括指定量20%、10%、 5%、1%、0.5%或甚至是0. 的變化。同樣，如本文所用的「和/或」和「/」是指並且包括 所列項目相關的一個或多個任何和所有可能的組合，以及當在或者(「或」)中分析時組合 的缺失。「尿祖細胞」或「UPC」是從尿中收集和/或分離的細胞，其具有多能性和增殖潛能。 UPC是「多能性的」，是指其能夠產生一個或多個譜系內的各種細胞類型。例如，根據一些實 施方式的UPC具有分化成下列的一種或多種的潛能膀胱尿道上皮、平滑肌、內皮、間質細 胞，甚至是骨、肌肉、上皮細胞和其它類型的細胞和組織。以前的研究已經表明尿道上皮細 胞可分化為成熟的軟骨細胞(Fernandez-Conde，Bone(1996) 18(3) :289_91)。從尿道腔中脫落的細胞通常被認為是難以在體外培養和保持的老的或損壞的表面細胞。從尿中獲得的幾種細胞可以在飼養層細胞上迅速生長。但是，當用小鼠飼養細胞 培養人細胞時，飼養層細胞通常來源於可能將病毒從動物轉移到人類的胚胎小鼠組織。為 了避免這個併發症，我們最近在沒有飼養層細胞的條件下從尿中培養了細胞。獲得了具有 祖細胞特徵且保持了增殖能力和多能性潛能的細胞。 我們的研究表明在尿中有混合的細胞群體有祖細胞，也有成熟細胞。如本文所討 論，尿含有尿道上皮祖細胞和平滑肌祖細胞，以及內皮和間質祖細胞。尿中發現的祖細胞可 來源於膀胱組織、腎組織等。在一些實施方式中，對UPC進行排除腎臟來源的選擇。這可通 過例如將收集的細胞傳代而進行，因為人們認為腎臟細胞在傳代時通常不能存活。在一些 實施方式中，在生長24-48小時內(例如每31. 3小時)，UPC良好地倍增，這允許它們大量 生長。在另外的實施方式中，UPC不誘導腫瘤形成，在一些實施方式中，UPC的生長或分化不 需要飼養細胞。「分離的」是指將細胞置於非其天然環境的條件中。但是，術語「分離的」不排除後 來將這些細胞與其它細胞組合或混合使用。「對象」通常為人對象，包括但不限於「病人」。對象可以是男性或女性，可以是任 何種族或種族劃分，包括但不限於高加索人、非洲裔美國人、非洲人、亞洲人、西班牙人、印 度人等。對象可以是任何年齡的，包括新生兒、嬰兒、嬰幼兒、兒童、青年人、成年人和老人。對象也可以包括用於(例如)獸藥和/或藥物開發目的的動物對象，特別是哺乳 動物對象，例如犬、貓、牛、山羊、馬、綿羊、豬、齧齒動物(例如大鼠和小鼠)、兔類動物、靈長 類(包括非人靈長類)等。細胞的收集可以從任何產生尿的動物(包括人類)收集UPC。在本發明的一些實施方式中，尿 祖細胞從哺乳動物的尿中收集。例如，UPC可以從狗、貓、豬、母牛(cow)、馬、猴子或人的尿 中收集。在具體實施方式
中，尿祖細胞從人尿中獲得。在一些實施方式中，UPC從新鮮的自發尿樣品中獲得，或從通過尿道導尿管或膀胱 洗滌排出的尿獲得。尿樣品可在4°C於1500RPM離心5分鐘，吸取上清液並用合適的溶液例 如磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌細胞。PBS可任選地含有5%胎牛血清(FBS)和青黴素-鏈 黴素以分別保護細胞免受損傷和潛在感染。可以在例如美國專利No. 5,912, 116 ；美國專利申請No. 20040087017 ；美國專利申 請No. 20020012953 ；和WO 2005/047529中發現從生物液體中分離細胞的方法和設備的其
它例子。細胞的選擇和繁殖在一些實施方式中，擴增收集的UPC。「擴增」是指有活力的細胞數目的增加。可 通過例如使細胞生長一個或多個細胞周期而實現擴增，其中至少一部分細胞分裂以產生另 外的細胞。「原代培養物」是將收集的細胞接種到培養容器後建立的首次培養物。「傳代」是 指將培養物轉移或次培養至第二個培養容器，通常包括機械或酶學解聚，再接種，且通常分 裂為兩個或兩個以上子代培養物，這取決於增殖的速率。如果為了特定的基因型或表型而 選擇群體，則培養物經次培養成為「細胞株」，即培養物為勻質的且具有所需要的特徵。「細 胞系」的建立，與細胞株相反，是基本上未分化的，雖然它們可能成為特定的譜系。
「選擇」可基於將一種細胞類型與另一種區別開的任何獨特性質，例如、密度、大 小、獨特標記物、獨特代謝途徑、營養需求、蛋白表達、蛋白分泌等。例如，可以使用梯度離心 基於密度和大小而選擇細胞。可使用螢光激活的細胞分選(FACS)、免疫磁珠分選、磁激活的 細胞分選(MACS)、淘選(Panning)等選擇獨特標記物。可通過改變細胞生長的培養基特別 是無血清環境的營養成分的組成和/或數量來利用獨特的代謝途徑和營養需求。可使用各 種檢驗(例如ELISA)檢測蛋白表達和/或分泌。在一些實施方式中，通過將由尿分離的細胞提供在促進祖細胞生長的特定生長環 境(例如祖細胞培養基)中而選擇UPC。在一些實施方式中，祖細胞培養基含有3/4DMEM、 l/4Ham' s F12U0% FBS、0. 4mg/ml 氫化可的松、IO^10M, Chron毒素、5mg/ml 胰島素、1. 2mg/ ml腺嘌呤、2. 5mg/ml鐵傳遞蛋白加0. 136mg/ml 3，39，5-三碘-L-甲腺原氨酸、10mg/ml EGF、和 1 % 青黴素-鏈黴素(Zhang 等人，In vitro Cell Dev. Biol. -Animal 37:419， 2001)。在其它實施方式中，將分離的UPC提供在促進祖細胞選擇性分化的特定生長環境 中。例如，在一些實施方式中，在角化細胞無血清培養基中生長的UPC發育為尿道上皮。在 其它實施方式中，在含有10%胎牛血清的DMEM中生長的UPC發育成平滑肌樣細胞。在一 些實施方式中，內皮樣細胞可在含有20% FBS、2mmol/lL-穀氨醯胺、EGF(5nl/ml) 1 %丙酮 酸鈉和青黴素-鏈黴素的M199中培養。在一些實施方式中，間質樣細胞可在含有10% FBS、2mmol/lL-穀氨醯胺和青黴素-鏈黴素的DMEM中培養。在其它實施方式中，通過形態學選擇UPC。例如，可將從尿中分離的細胞稀釋至允 許分離單個細胞的濃度(例如，細胞可在多孔板中被稀釋至約0. 5細胞/孔)，並在顯微鏡 下觀察。可以保留含有單個細胞的孔用於擴增，通過觀察形態而選擇，例如尿道上皮、平滑 肌、內皮和/或間質細胞(見圖6A)。根據本發明的一些實施方式的尿祖細胞可基於一種或多種「標記物」而鑑定、選擇 和/或分離。這樣的標記物包括特異性基因表達、在這類細胞表面發現的抗原性分子等。在 特定的實施方式中，尿祖細胞基於至少一種特異性標記物選擇和分離。在一些實施方式中， UPC具有以下的一種或多種標記物，例如⑶117(c-kit)、SSEA-4、⑶105、⑶73、⑶90、⑶133 和⑶44，並且不具有可評估量的一種或多種以下標記物⑶31、⑶34和⑶45。因此，某些實 施方式包括選擇和分離表達⑶117、SSEA-4、⑶105、⑶73、⑶90、⑶133和⑶44中的一種或 多種和/或不表達⑶31、⑶34和⑶45中的一種或多種的尿祖細胞。例如，在一些實施方式 中，本發明的尿祖細胞是基於CD117的表達而鑑定、選擇和/或分離的。在一些實施方式中，可按照本文的公開內容通過下述而獲得UPC:從尿樣品中收 集細胞(例如通過離心)，和/或直接將細胞置於合適的培養基之中或之上，和/或基於祖 細胞特異性細胞標記物的表達而選擇並分離尿祖細胞(例如通過免疫組化或western印跡 分析)。或者，可通過收集並選擇細胞而獲得尿祖細胞，所述選擇通過螢光激活的細胞分選， 例如使用與螢光團(例如APC、藻紅蛋白、別藻藍蛋白、螢光素、德克薩斯紅(TEXAS RED)等) 偶聯的標記物特異性抗體(例如抗CD117抗體)，或使用與磁性顆粒偶聯的標記物特異性抗 體進行磁性選擇。說明性地，可使用與CD117報告蛋白的細胞外結構域(胺基酸23-322) 特異性結合的兔多克隆抗體孵育細胞(De Coppi等人(2007) Nat. Biotechnol. 25 100)。可 通過使用磁性山羊抗兔IgG微珠孵育並在Mini-MACS設備上選擇而純化⑶117-陽性細胞。還可使用直接與微珠偶聯的抗-CD117單克隆抗體來選擇尿祖細胞。任何適合於選擇的方法，包括與固相結合和分離，均涵蓋在本發明的範圍內。根據本發明的一些實施方式的尿祖細胞可常規傳代或次培養，例如以1 4稀釋 並允許擴增至約50 70%匯合度。尿祖細胞的分離的群體可常規生長並在常規培養條件 下保持，例如37°C在5% CO2的溼潤空氣中。雖然本發明的細胞可在含有KFSM-祖細胞培養 基的複合培養基(1 1)中生長(Zhang 等人，In vitro Cell Dev. Biol. -Animal 37:419， 2001)，但是通常優選的是細胞在簡單的無血清培養基中保持，例如用於尿道上皮祖細胞的 KSFM ；或含有10% FBS的用於平滑肌或間質祖細胞的培養基，例如Dulbecco最低必需培養 基(DMEM) ,Hank鹼性鹽溶液(HBSS) ,Dulbecco磷酸鹽緩衝液(DPBS)、RPMI、或Iscove改進 的Dulbecco培養基(IMDM)，從而實現對祖細胞分化為所需要細胞的更精確控制。可通過常 規的限制性稀釋方法在96孔板或24孔板中產生克隆尿祖細胞系。一旦形成細胞克隆，將 細胞分離並轉移至多孔培養皿。在一些實施方式中，培養基中包含生長因子或其它促有絲分裂劑以促進不同細胞 群體的增殖和分化。從這個意義上，本發明的具體實施方式
包括用支持尿祖細胞生長並分 化為尿道上皮、平滑肌、間質細胞等的選擇性培養基來培養尿祖細胞。在本文上下文中，分 化是指細胞狀態，其中細胞發展特定的形態學或功能性特徵。說明性地，當尿祖細胞在補充 了 0.09mM鈣的角質細胞無血清培養基(KSFM)中生長時，細胞分化成尿道上皮。同樣地，在 補充了血清例如10%胎牛血清(FBS)的DMEM中培養的尿祖細胞促進向平滑肌細胞的分化。 因此，本發明還包括分化並表達至少一種尿道上皮特異性標記物或至少一種平滑肌特異性 標記物或至少一種其它組織特異性標記物(例如間質特異性)的尿祖細胞群體。可通過檢測對特定細胞類型特異性的標記物來確定UPC是否分化成這些特定類 型的細胞。例如，可通過一種或多種尿道上皮特異性標記物(包括例如uroplakin、細胞 角蛋白7、細胞角蛋白13、細胞角蛋白17、細胞角蛋白19和細胞角蛋白20)的存在來鑑定尿 道上皮細胞；可通過一種或多種平滑肌特異性標記物(包括，例如α-平滑肌肌動蛋白、結 蛋白、調寧蛋白和肌球蛋白)的存在來鑑定平滑肌細胞。可通過使用任何合適的常規方法 例如免疫組化和/或western印跡分析來確定細胞類型特異性標記物的表達。此外，如果需要，可在使用前將細胞冷凍或冷藏，然後解凍成有活力的形式。冷凍 或冷藏細胞的方法(用於以後回復至有活力的形式)在本領域是熟知的。例如細胞的冷藏 可包括將細胞在生長培養基與另一種防止水形成冰晶體的液體的混合物中冷凍，然後將細 胞儲存於液氮溫度(例如，約-80°C至約-196°C )。參見例如美國專利No. 6，783，964。治療方法可使用本文公開的方法治療的疾病，包括但不限於尿道組織的擴大或替換。本文 所用的「治療」是指任何種類的對病人有益的治療，所述病人為例如患有疾病的病人或具有 患疾病風險的病人。治療包括為了改善病人病狀(例如一種或多種症狀的減輕)、延緩疾病 的發生或發展等而進行和禁止進行的行動。已經證明根據本發明的一些實施方式的尿祖細胞可分化成各種功能細胞類型，本 發明的尿祖細胞可應用於治療尿道的疾病和病狀，包括例如膀胱外翻；膀胱體積不足；部 分或全部切除後的膀胱重建；膀胱修復；外傷引起的腎或輸尿管損傷等。按照一些實施方 式的治療包括尿道疾病和病狀，例如先天性異常、癌症、外傷、輻射、感染、醫原性損傷、神經 損傷或其它誘因。通常，治療包括改變尿道功能；改善尿道功能；或重建、修復、擴大或替換損傷的尿道細胞或全組織或器官，以預防或治療尿道疾病或病狀。從這個意義上，尿祖細胞可用於如下尿道結構的組織工程例如輸尿管、膀胱、尿道、腎盂(renal pelvic)、腎臟、骨、 軟骨、肌肉、皮膚等。此外，尿祖細胞可應用於下尿道藥理學和尿道疾病的診斷。根據本發明的一些實 施方式的細胞可用於診斷疾病，例如，血尿症或尿道系統的腫瘤，如膀胱、腎盂、腎臟、輸尿 管、前列腺和尿道的腫瘤；腎臟疾病，例如腎糖尿病、腎小管壞死、急性或慢性腎衰竭和腎移 植後的腎臟排斥；和其它疾病，包括間質性膀胱炎、神經源性膀胱、輻照膀胱和膀胱輸尿管 反流或反流腎病。參見例如美國專利No. 5，733，739,5, 325，169和5，741，648。按照本發明，在一些實施方式中，治療包括給予需要治療的對象有效量的尿祖細 胞，例如未分化的、分化的或其混合物，從而改善或減輕對象疾病或病狀的至少一種體徵或 症狀。在組織移植的應用中，在一些實施方式中，細胞是與移植入組織的對象相同物種 的細胞。在一些實施方式中，細胞為自體的(即來自待治療的對象)、同基因的(即，遺傳學 上相同的不同對象，例如來自相同的雙胞胎)、同種異體的(即來自相同物種的非遺傳相同 成員)或異種的(即來自不同物種的成員)。在一些實施方式中，當本發明的細胞用於治療對象時，細胞被配製成藥物組 合物，所述組合物包含與藥學上可接受的溶媒或載體混合的細胞。這樣的製劑可通 過本領域熟知的技術製備。參見例如美國專利申請2003/0180289 ；Remington =The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro,編輯，第 20 版 Lippincott Williams&ffilkins :Philadelphia，PA，2000。在製備根據本發明的藥物製劑時，細胞通常與 特別是可接受的載體混合。當然載體必須是在可以與製劑中的其它任何成分兼容的意義上 可接受的，且必須對病人無害。載體可以是固體或液體或二者皆有(例如，水凝膠)，可與細 胞配製成單位劑量的製劑。在一個實施方式中，以載體中的懸浮液的形式提供細胞以減少 細胞凝塊。在另一些實施方式中，細胞配製成膠囊化形式(例如封裝在可通透營養物和氧氣 的膠囊中以維持細胞在體內的活力)。用於將細胞封裝在通透性膠囊中的材料和方法是熟 知的，在例如美國專利No. 6，783，964中有描述。例如，細胞可封裝在直徑為50或100 μ π!至 1或2mm的微膠囊中，微膠囊包含含有細胞的內部多糖樹膠核心，所述核心被半透膜包圍； 微膠囊包含藻酸鹽與聚賴氨酸、聚鳥氨酸及其組合的組合。其它合適的封裝材料包括但不 限於在美國專利No. 5，702，444中描述的那些。在具體實施方式
中，本發明的細胞與生物可降解支架或基質一起給予。已經證明 在富含膠原的支架上體外共培養之後，膀胱細胞可形成特殊層狀(distinctive layers)的 正常膀胱結構，尿道上皮生長在平滑肌細胞上面(Zhang等人(2000) J.Urol. 164:928)。另 夕卜，已經表明在部分膀胱造口術模型中，接種了膀胱細胞的支架構建體參與了組織重塑的 再生過程(Zhang等人(2005) BJU Int. 96 :1120)。因此，祖細胞的實施方式可應用於體外 工程化細胞支架構建體，以用於後續的體內移植以完全再生膀胱。生物可降解支架或基質是無毒或對生物學功能無損害且能夠被宿主分解為其基 礎成分的任何物質。理想地，支架或基質是多孔結構以允許細胞沉積在基質上和基質的孔 內，在某些實施方式中，支架或基質是定形的。這樣的製劑可以這樣製備向生物可降解支架提供至少一個細胞群體以將細胞群體接種在支架上和/或支架內。在一些實施方式中， 然後將接種的支架移植入受體對象的體內，其中分離的、層化組織的細胞群體促進新生器 官或組織結構的形成。 可以使用的生物可降解支架包括例如天然或合成的聚合物，例如膠原(例如SIS 和BSM)；聚(α酯)，例如聚乳酸；聚羥基乙酸；聚原酸酯和聚酸酐及它們的共聚物，它們可 以受控速率通過水解被降解且再吸收。在美國專利No. 7，186，554中提供了其它合適材料 的實例。可使用如下方法將生物可降解支架「定形」，例如，溶劑澆鑄、壓模、拉絲、網格化 (meshing)、浸出(leaching)、織造(weaving)和包被。在溶劑澆鑄中，將溶於合適溶劑(例 如二氯甲烷)中的一種或多種聚合物的溶液澆鑄為分枝(branching)圖案浮雕結構。溶劑 蒸發後，獲得薄膜。在壓模時，以最多30，000磅每平方英寸的壓力將聚合物壓入合適的模 樣中。拉絲包括從熔化的聚合物中拉絲，網格化包括通過將纖維壓成氈狀材料而形成網。 在浸出時，將含有兩種材料的溶液鋪展(spread)成類似最後形式的形狀。然後，使用溶劑 熔解掉一種組分，從而形成孔(參見美國專利No. 5，514，378)。在成核時，將重建性尿道上 皮移植物形狀的薄膜暴露於能夠產生放射損壞材料軌跡的放射性裂變產物。然後，用酸或 鹼蝕刻聚碳酸酯層，將放射損壞材料軌跡變成孔。最後，可使用雷射進行定形並且燒出通過 很多材料的單個孔以形成具有統一孔尺寸的重建性尿道上皮移植物。這些定形技術可組合 使用。例如，可以將生物可降解基質織造、壓模並且還粘合。此外，可以將通過不同方法定 形的不同聚合物材料結合在一起以形成複合形狀。複合形狀可以是層狀結構。例如，可以 將聚合物基質與一種或多種聚合物基質結合以形成多層聚合物基質結構。所述結合可通過 使用液態聚合物粘合或通過縫合而進行。另外，聚合物基質可形成為固體塊並通過雷射或 其它標準機械加工技術定形成為其想要的最終形式。雷射定形是指使用雷射除去材料的方 法。可以在移植前(在接種細胞前或後)用添加劑或藥物處理生物可降解支架以便 例如促進移植後新組織的形成。因此，例如，可將生長因子、細胞因子、細胞外基質組分和 /或其它生物活性材料加入生物可降解支架中以促進移植物癒合和新組織的形成。通常， 這樣的添加劑根據重建或擴大的組織或器官而選擇，以確保在移植的器官或組織中形成合 適的新組織。用於促進骨癒合的這樣的添加劑的例子參見例如Kirker-Head(1995)Vet. Surg. 24(5) :408-19o可根據標準方法將細胞接種到生物可降解支架上。例如，已經報導了將細胞接 種到聚合物基底以用於組織修復(參見，例如授予Atala的美國專利No. 6，171，344，引入 本文作為參考；Atala 等人(1992) J. Urol. 148 :658_62 ；Atala 等人(1993) J. Urol. 150 608-12)。作為例子，可將生長於培養物中的細胞胰蛋白酶化以分離細胞，分離的細胞可接 種在生物可降解支架上。或者，從細胞培養獲得的細胞可作為細胞層從培養板中提起，可直 接將細胞層接種於生物可降解支架上而不預先分離細胞。生物可降解支架上接種的細胞的密度可以變化。例如，在一些實施方式中，較高的 細胞密度促進所接種的細胞形成更多的組織，而較小的密度可允許由從宿主滲入移植物的 細胞形成相對較多的組織。還可依據生物可降解支架和細胞使用其它的接種技術。例如， 可通過真空過濾將細胞施於生物可降解支架。根據本文的教導，選擇細胞類型並將細胞接種在生物可降解支架上對於本領域普通技術人員來說將是常規的。在其它實施方式中，本發明的製劑包括用於腸胃外給藥的那些(例如皮下、肌內、 真皮內、靜脈內、動脈內、腹膜內注射)或移植。在一些實施方式中，通過血管內給藥，可以 通過簡單注射，也可以通過置於合適的血管(例如腎動脈)中的導管注射。在另一個實施 方式中，以如上討論的待擴大器官或組織上的移植物的方式施用。 適用於腸胃外給藥的本發明的製劑包括無菌液體，優選細胞的水性注射組合物， 該製劑可以與意向接受者的血液是等滲。這些製劑還可以包含抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和 溶質，這些物質使製劑與意向接受者的血液等滲。除了所給予的細胞外，製劑是無菌的，其 意義是它們不含微生物汙染物，例如細菌和病毒。製劑可以是可灌注(synringeable)、可注 射形式；可以是適合於手術移植入(例如)對象的膀胱、尿道、輸尿管或腎臟的形式；或其 它任何適於給予到對象中的形式。根據一些實施方式，給予對象的細胞可以是與待治療對象同基因的(syngeneic) (即同系的，包括同基因的(isogeneic)和自體的)，同種異體的(即同源的)或異種的(即 異源的)，這取決於其它的步驟例如是否存在封裝或是否給予細胞免疫抑制治療。細胞的治療有效劑量在對象之間有所不同，這取決於例如年齡、體重和對象的狀 況以及遞送途徑等的因素。可根據本領域技術人員已知的程序來確定此劑量。通常，在一 些實施方式中，可以給予每個對象ι χ ο5、1 X IO6或5 X IO6直至1 X IO7,1 X IO8或1 X IO9個 細胞的劑量，單獨一次一起給予或分開幾次給予。在其它實施方式中，可以給予每千克對象 體重為I-IOOXlO8個細胞的劑量，單獨一次一起給予或分開幾次給予。當然，如果必要可 以提供後續的給藥。如果需要或必要，還可根據已知的技術給予對象抑制所給予細胞的移植排斥的藥 齊U，例如雷帕黴素、咪唑硫嘌呤、皮質類固醇、環孢黴素和/或1^506。參見例如美國專利 No. 5，461，058 ；5，403，833 ；和 5，100，899 ；另外參見美國專利 No. 6，455，518 ；6，346，243 ； 和 5，321，043。此外，本發明的細胞可在接種前用遺傳材料進行轉染(例如，用特定基因)。可用 的遺傳材料可以是例如能夠減少或消除宿主內免疫反應的遺傳序列。例如，可以抑制諸如I 類和II類組織相容性抗原等細胞表面抗原的表達。這將使所移植的細胞被宿主排斥的幾 率降低。用於收集尿祖細胞的試劑盒本文還提供了用於收集尿樣品的試劑盒。優選地，根據本發明的試劑盒用於在向 遙遠地區(例如合適的實驗室設施)運輸時保存尿祖細胞的活力。在一些實施方式中，試 劑盒包括含有合適培養基(例如l_15mL，在一些實施方式中為5mL的血清例如胎牛血清) 的管。培養基可以是冷凍形式提供，在使用前解凍。在其他實施方式中，試劑盒包括含有抗 生素(例如，l_15mL，在一些實施方式中為5mL的含有青黴素和鏈黴素的溶液)的管。 抗生素可以是粉末形式或水性溶液(任選地以凍幹形式提供，在使用前解凍)。試劑盒還可包含合適的容器(例如瓶子)，以用於收集尿樣品(例如，三個無菌塑 料瓶，其具有合適體積，例如100-1，OOOmL,在一些實施方式中為500mL)。試劑盒還可包含 醇藥籤。在一些實施方式中包括冷卻裝置例如冰袋、冷卻袋(cold pack)等，以保持尿冷卻 於約4°C (例如，2個尺寸為3英寸X2英寸X0.5英寸的冰袋)。另外的實施方式包括能容納以上所列組分的容器(例如，尺寸為6英寸高X6英寸寬X7英寸長的塑料盒)，任選地，還包括使用說明書。本發明以以下非限定性實施例進行更詳細的解釋。實施例1從尿中分離並鑑定祖細胞從22個男性和1個女性供體(15個健康個體和8個病人，年齡為2至50歲)中 收集58份人尿樣品。在任何培養物中均沒有發現細菌汙染。尿樣品在4°C於1500RPM離心 5分鐘，用無菌PBS洗滌兩次。使用梯度稀釋方法，將細胞以平均0. 5細胞/孔置於含有祖 細胞培養基的多孔板中。祖細胞培養基含有3/4DMEM、l/4Ham' s F12U0% FBS.O. 4mg/ml 氫化可的松、10_1QM，Chron毒素、5mg/ml胰島素、1. 2mg/ml腺嘌呤、2. 5mg/ml鐵傳遞蛋白加 0. 136mg/ml 3,39,5-三碘-L-甲腺原氨酸、10mg/ml EGF，、和青黴素-鏈黴素(Zhang 等人，In vitro Cell Dev. Biol. -Animal 37:419,2001)。鑑定單個細胞並允許其生長至 50%以上的匯合度。然後將細胞次培養，轉移至6cm的培養皿並擴增。從約39%的源自尿樣品的培養物獲得原代細胞長出物。集落中的平均細胞數目 為在健康個體中在第二天為4. 5/100ml尿(表1和圖1)。細胞是小的、看起來亮的細胞， 基於我們的長期觀察經驗，其最像是來自於膀胱黏膜的底層，是相對未分化的。從每個克隆 系中得到了一致的高產率的尿細胞。在含有祖細胞培養基和KSFM(1 1)的複合培養基中， 尿細胞的細胞倍增時間為31. 3小時。在6-cm培養皿中，尿細胞從單個細胞到達到匯合需 要10至12天(圖2)。表 1 為了證明尿細胞的分子和細胞特徵，分析了祖細胞特異性和分化細胞特異性標 記物的表達。第1、3和4代的尿細胞對包括下列的祖細胞特異性表面標記物染色均為陽 性C_kit、SSEA-4、CD105+、CD73+、CD90+、CD133+ 和 CD44+ ；對於 CD31\ CD34"和 CD45-染 色均為陰性(表2和圖3)。CD44被認為是膀胱基底細胞的細胞表面標記物(Desai等人 (2000)Mod. Pathol. 13 :1315)。由於基底細胞具有自我更新的潛能並且可以增殖並分化成中間和表面細胞，所以基底細胞被稱作尿道上皮祖細胞或幹細胞(Staack等人(2005) Differentiation 73 :121)。通過CD44和使用細胞角蛋白13 (其為基底細胞和中間細胞的 細胞內蛋白標記物)的免疫螢光確定了尿中的基底細胞(Romih，等人(2005)Cell Tissue Res. 320 259)。表2 看起來在尿中具有混合的細胞群體有祖細胞也有成熟細胞。發現尿含有尿道上 皮祖細胞和平滑肌祖細胞。如上所示，用⑶標記物確認了這些細胞。另外，使用了尿道上 皮祖細胞標記物和平滑肌細胞標記物以進一步鑑定這些細胞。在70%的細胞匯合度時使 用抗尿道上皮祖細胞特異性標記物uroplakin Ia和細胞角蛋白7、13、17和19的單克隆抗 體，每個抗體按照以下稀釋使用抗-細胞角蛋白7，1 200 ；抗-細胞角蛋白13，1 100 ； 抗-細胞角蛋白17，1 100 ；和抗-細胞角蛋白19，1 100。確定了尿祖細胞中uroplakin 和所示細胞角蛋白的表達，並將其與培養的從常規活檢組織獲得的尿道上皮(Zhang等人 (2003) Adv. Exp. Med. Biol. 539 907 ；Ludwikowski 等人(1999) BJU Int. 84 507 ；Sugasi 等 人(2000) J. Urol. 164:951 ；Zhang 等人(2001) In VitroCell Dev. Biol. Anim. 37 419)以 及正常人膀胱黏膜(Southgate等人，Lablnvestigation (1994) 71 583)中的標記物表達相 比較。免疫螢光程度定義為從陰性(_)到強陽性(++++)。與從培養的組織活檢獲得的尿道 上皮相似，尿細胞表達uroplakin Ia和細胞角蛋白(CK) 7、13、17和19(圖3和表3)。表 3 此外，如免疫螢光所確定(圖4和表4)，與原始膀胱細胞相比，從尿獲得的細胞表 達平滑肌細胞特異性標記物、a-平滑肌肌動蛋白(ASMA)、結蛋白、肌球蛋白和調寧蛋白。表 4 實施例3 尿祖細胞的細胞收縮件和緊密連接通過用膠原柵格測定細胞收縮性而確定了源自尿的平滑肌細胞的功能特徵。膠原 柵格收縮檢驗的方法在本領域是已知的(Kropp等人(1999) J.Urol. 162 :1779)。對激動劑 的收縮反應以相似的方式進行，只是在柵格即將釋放前向無血清培養基中加入激動劑。所 測試的激動劑包括Ca-離子載體A23187 (1025M)和KC1。分析了源自尿的尿道上皮祖細胞的緊密連接。尿道上皮的屏障功能由頂膜斑和 細胞間緊密連接來維持。用常規方法例如電子顯微鏡研究了尿祖細胞內的緊密連接組分 (Zhang 等人(2003) Adv. Exp. Med. Biol. 539 907 ；Ludwikowski 等人(1999) BJU Int. 84 507 ；Sugasi 等人(2000) J. Urol. 164 951 ；Zhang 等人(2001) In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 37 419 ；Cross 等人(2005) Am. J. Physiol. Renal Physiol. 289 :F459)。實施例4 尿祖細胞分化為平滑肌細胞為了確定上皮-間質(stromal)細胞相互作用或細胞-細胞相互作用對尿祖細 胞分化為平滑肌細胞的作用(Staack等人(2005) Differentiation73 121 ；DiSandro等人(1998) J. Urol. 160 1040)，使用了兩種共培養方法。第一種是使用具有4. 5 y m尺寸排除的 跨孔(transwell)裝置進行間接共培養。將尿平滑肌祖細胞置於上部小室的孔中，將來自 組織活檢的膀胱平滑肌細胞和/或尿道上皮接種在跨孔單元底部的孔中(Luk等人(2005) J. Immunol. Methods 305 39 ；Gerstenfeld 等人(2003) Connect Tissue Res. 44 (±曾幹丨J 1) 85)。第二種方法是直接的共培養方法，用0. 4 y m孔尺寸的跨孔插入物進行。跨孔用作基底 膜，其中在下側培養尿祖細胞，而在相對的上側培養正常人膀胱尿道上皮和平滑肌細胞(Le Visage等人92004) Tissue Eng. 10:1426)。然後通過在接種細胞後3、7、14和28天後的表 型外觀、分子分析和針對平滑肌蛋白表達的免疫組化染色來評價尿細胞。實施例5 接種尿祖細胞的支架評價了膀胱黏膜下層膜(BSM)和小腸黏膜下層(SIS)上的尿祖細胞的細胞粘附、 增殖和分化，以確定臨床應用的細胞-基質相互作用。在體外接種細胞的構建體中，在混合 培養基(KSFM DMEM, 1 1)得存在下，將源自尿祖細胞的尿道上皮接種在BSM黏膜一側， 將源自尿祖細胞的平滑肌細胞接種在漿膜一側。接下來，將接種的基質皮下移植到無胸腺小鼠內。取回移植的工程化組織並通 過組織化學(H&E和Trichrom)、免疫組化(細胞角蛋白和平滑肌細胞特異性標記物)、 western印跡分析和人X/Y染色體檢測檢驗(FISH)進行評價。對於組織化學和免疫組化 分析，使用標準程序將工程化組織固定於10%中性緩衝的福馬林中，脫水，並包埋於石蠟 中。切取5毫米的部分並固定。進行常規的蘇木精伊紅(H&E)染色和Masson三重染色。使 用以下單克隆抗體進行免疫組化染色抗平滑肌細胞蛋白的單克隆抗體a -平滑肌肌動 蛋白(1 1000稀釋)、結蛋白(1 20)、調寧蛋白(1 50)和肌球蛋白(1 100)；以及抗 尿道上皮細胞特異性蛋白的單克隆抗體細胞角蛋白AE 1/AE3(1 100抗體稀釋)(Zhang 等人(2005) BJU Int. 96 1120 ；Zhang 等人(2003) Adv. Exp. Med. Biol. 539 907 ；Zhang 等 人(2000) J. Urol. 164 928 ；Zhang 等人(2006) BJUInt. 98 1100 ；Zhang 等人(2004) Tissue Eng. 10 181 ；Zhang 等人(2001) In VitroCell Dev. Biol. Anim. 37 419)。根據已知方法(Zhang等人(2005)BJU Int. 96 1120 ；Lin 等人(2004) J.Urol. 171 1348)用裂解緩衝液裂解細胞或接種細胞的支架組織而分離用於western印 跡分析的蛋白。小鼠抗-人a-平滑肌肌動蛋白、結蛋白、肌球蛋白和AE 1/AE3用作一抗， 過氧化物酶標記的山羊抗-小鼠IgG用作二抗。通過商售的加強化學發光檢驗試劑盒檢測 蛋白條帶的存在。在移植後一個月用LacZ染色在移植物組織中觀察尿祖細胞。還通過人X/Y染色 體確認了移植的細胞。有利地，在體內支架中尿祖細胞形成多層尿道上皮細胞和平滑肌樣 組織結構(圖5)。此外，移植後三個月未在移植物組織中發現腫瘤。因此這些數據提供了體外和體內證據，其證明從尿中獲得的細胞可以作為膀胱組 織工程的來源。尿祖細胞是容易獲得的，並且已經表明它們在體外增殖並分化成尿道上皮 和平滑肌。源自尿祖細胞的膀胱細胞顯示出尿道上皮和平滑肌樣的表型，包括分別表達尿 道上皮和平滑肌特異性蛋白。膠原基質支持尿祖細胞的三維生長，這對於膀胱重建是基本 的需要。體內接種尿祖細胞的支架為膀胱重建提供了具有成本有效性的方法。以上是本發明的示例，不應被理解為其限制。本發明通過以下權利要求限定，其中 包括權利要求的等同物。
權利要求
一種產生尿祖細胞培養物的方法，包括提供尿樣品；和然後從所述尿樣品中分離尿祖細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述分離步驟通過以下進行(a)從尿樣品中收集細胞以提供粗製細胞樣品；和(b)從所述粗製細胞樣品中選擇尿祖細胞。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述收集步驟通過所述尿樣品的離心而進行。
4.根據權利要求2所述的方法，其中所述選擇步驟通過將所述細胞平板接種於含有選 擇性細胞培養基的組合物中而進行。
5.根據權利要求2所述的方法，其中所述選擇步驟通過基於形態學選擇感興趣的細胞 而進行。
6.根據權利要求2所述的方法，其中所述選擇步驟通過選擇對尿祖細胞特異性的標記 物而進行。
7.根據權利要求2所述的方法，其中所述選擇步驟通過選擇對尿祖細胞特異性的標記 物而進行，其中所述選擇標記物通過FACS進行。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其中所述標記物選自C-kit(⑶117)、SSEA-4、 CD105、CD73、CD90、CD133 和 CD44。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述尿祖細胞來自哺乳動物對象。
10.根據權利要求1-9所述的方法製備的分離的細胞。
11.根據權利要求1-9中任一項所述的方法，還包括以下步驟使所述尿祖細胞分化成 至少一種選自下列的細胞尿道上皮細胞和平滑肌細胞。
12.—種分離的尿祖細胞，其中所述細胞是c-kit陽性的，且其中所述細胞可以分化成 兩種或兩種以上選自下列的譜系尿道上皮、平滑肌、內皮和間質細胞。
13.一種提供接種的組織支架的方法，所述方法包括以下步驟 提供權利要求10所述的分離的尿祖細胞；使所述尿祖細胞分化成至少一種選自下列的細胞尿道上皮細胞和平滑肌細胞，從而 產生分化的細胞；和將所述分化的細胞接種在生物可降解組織支架上。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述組織支架包含膠原基質。
15.根據權利要求13所述的方法，其中所述組織支架包含合成聚合物。
16.根據權利要求13所述的方法，其中所述組織支架包含選自下列的合成聚合物聚 羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)以及乳酸-羥基乙酸的共聚物(PLGA)。
17.一種包含生物可降解組織支架和尿祖細胞的接種的組織支架。
18.根據權利要求17所述的接種的組織支架，其中所述尿祖細胞是分化的或未分化的。
19.根據權利要求17所述的接種的組織支架，其中所述尿祖細胞分化為選自下列的細 胞尿道上皮細胞、平滑肌細胞、間質細胞和內皮細胞。
20.根據權利要求17-19中任一項所述的接種的組織支架，其中所述生物可降解組織 支架包含膠原基質。
21.根據權利要求17-19中任一項所述的接種的組織支架，其中所述生物可降解組織 支架包含合成聚合物。
22.根據權利要求17-19中任一項所述的接種的組織支架，其中所述生物可降解組織 支架包含選自下列的合成聚合物聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)以及乳酸-羥基乙酸的 共聚物(PLGA)。
23.一種治療有需要的對象的方法，所述方法包括以下步驟 提供膀胱組織基底，其中所述基底包含尿祖細胞；使所述尿祖細胞分化成至少一種選自下列的細胞尿道上皮細胞和平滑肌細胞，從而 產生分化的細胞；將所述分化的細胞接種在生物相容性基底上；和 將所述基底移植入所述病人。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述基底包含膠原基質。
25.根據權利要求23所述的方法，其中所述基底包含合成聚合物。
26.根據權利要求23所述的方法，其中所述基底包含選自下列的合成聚合物聚羥基 乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)以及乳酸-羥基乙酸的共聚物(PLGA)。
27.—種試劑盒，包含用於運輸尿樣品的合適的容器； 培養基；一種或多種抗生素；用於容納所述容器、培養基和抗生素的包裝體；和 任選地，使用說明書。
28.根據權利要求27所述的試劑盒，還包括冷卻裝置。
29.根據權利要求27或28所述的試劑盒，還包括醇藥籤。
30.根據權利要求27、28或29所述的試劑盒，其中所述容器是無菌的。
全文摘要
本發明提供尿祖細胞和從尿樣品中產生尿祖細胞培養物的方法。可以基於使用選擇性培養基、基於形態學和/或通過選擇細胞特異性標記物而選擇細胞。還提供了分離的尿祖細胞，其為c-kit陽性的，並且可分化成尿道上皮、平滑肌、內皮或間質細胞。提供了使用尿祖細胞的方法，其中提供了接種細胞的組織支架。還提供了治療有需要的對象的方法，包括提供含有分化的UPC的膀胱組織基底和將基底移植入病人。最後，提供了試劑盒，其包含適合用於尿樣品運輸的容器；培養基；一種或多種抗生素；容納所述容器、培養基和抗生素的包裝體；以及任選地，使用說明書。
文檔編號C12N5/074GK101842105SQ200880025335
公開日2010年9月22日 申請日期2008年5月20日 優先權日2007年5月21日
發明者A·阿塔拉, 張元原 申請人:韋克福裡斯特大學健康科學院