芽孢桿菌芽胞和木黴菌厚垣孢子複合製劑、其製備方法及應用的製作方法

2023-06-02 11:46:51

專利名稱：芽孢桿菌芽胞和木黴菌厚垣孢子複合製劑、其製備方法及應用的製作方法
芽孢桿菌芽胞和木黴菌厚垣孢子複合製劑、其製備方法及應用技術領域
本申請涉及生物技術領域，尤其是農業生物技術領域。具體而言，本申請涉及芽孢 桿菌芽胞和木黴菌厚垣孢子複合製劑、其製備方法及應用。
背景技術：
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種嗜溫性的好氧產芽孢的杆狀細菌，其 生理特徵豐富多樣，分布廣泛，極易分離培養。該菌在自然界中廣泛存在，對人畜無毒無害， 不汙染環境，能產生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力。枯草芽孢桿菌 不僅可以在土壤、植物根際、體表等外界環境中廣泛存在，同時還是植物體內常見的植物內 生細菌，尤其是在植物的根、莖部。目前該菌己經在水稻、辣椒、棉花、小麥、黃瓜、大豆、玉米 等農作物上顯現出很好的病害防治效果。枯草芽孢桿菌最突出的特徵是生長快、營養簡單， 能產生耐熱抗逆的芽孢，這不僅有利於生防菌劑的生產、劑型加工及在環境中的存活、定殖 與繁殖，而且批量生產工藝簡單，成本也較低，施用方便，儲存期長，是一種理想的生防微生 物，具有廣闊的應用前景。
枯草芽孢桿菌通過定殖在植物根際、體表或體內，同病原菌競爭植物周圍的營養、 分泌抗菌物質抑制病原菌生長，同時誘導植物防禦系統抵禦病原菌入侵，從而達到生防的 目的。主要防治對象大部分為絲狀真菌所引起的植物病害，如水稻紋枯病(Magonospora curtisii)、番爺葉黴病(Cladosporium fulvum)、大豆根腐病(Fusarium graminerarum)、 蘋果黴心病(Alternaria alternata)、棉花立枯病(Rhizoctonia solani)、棉花枯萎病 (Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)等。枯草芽孢桿菌生防機制主要包括競爭作用、 拮抗作用和誘導抗性作用3個方面。另外，枯草芽孢桿菌產生的具有生防活性的抗菌物質， 包括脂肽類、肽類、蛋白類、磷脂類、多烯類、胺基酸類和核酸類等多種化合物，它們對真菌、 細菌、病毒等具有抑制作用。
儘管枯草芽孢桿菌作為生物殺菌劑在植物病害的生物防治中取得了一定的成就， 但從整體上看還存在不少問題(R. campbell, 1993)。
首先，作為生物殺菌劑，枯草芽孢桿菌在田間效果表現並不穩定，這可能由於通常 採用室內保存多代的菌株，與野生菌株活性有較大差異，且室內盆栽試驗與田間複雜的微 生態環境迥然不同，造成室內抑菌圈測定結果與田間結果差異較大。其次，微生物製劑其毒 性和安全性一般認為好與化學藥劑，傾向於無毒和無殘留，但是一些微生物製劑也可能引 起病原菌抗性，特別是那些以抗生素類分泌物抑制病原菌的菌株。歐洲己將產抗生素桿菌 肽鋅的枯草芽孢桿菌畜用製劑列入禁用名單，理由是容易產生耐藥性和抗生素殘留。我國 對微生物農藥安全性的研究還很少，多數沒有引起足夠的重視。最後，作為微生物農藥，其 防治成本一般要高於化學藥劑，而且主要為保護劑，在植物發病後使用，效果較差，有些甚 至無效，這是許多微生物農藥都存在的弊病。
為解決上述存在的問題，增強生防菌的生防效果，並改善它們對環境條件的適應3性等，國內外許多實驗室已在利用細胞工程和基因工程技術進行生防微生物的遺傳改良， 構建新型高效的生防菌(王金生，200 。如陳中義等(1999)通過質粒載體將Bt基因導入 水稻生防芽孢桿菌B916，室內試驗表明重組菌株具有良好的殺蟲防病作用和很好的遺傳穩 定性。但由於不少拮抗基因特別是抗生素合成基因均由結構複雜的基因簇構成，遺傳操作 比較困難。因此，有關技術還需進一步研究。
木黴用於防治植物病害的歷史已有70多年，其生防效果已得到公認，是全世界應 用較為廣泛的生防菌。木黴屬於半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，粘孢菌類，是一類 普遍存在於土壤中的真菌，是土壤微生物的重要群落，其可寄生於植物殘體及動物糞便上， 從植物根圍、葉片及種子、球莖表面也經常可以分離到，木黴能夠寄生於多種土傳植物的病 原菌上。八十年代以來，隨著分子生物學的快速發展，木黴的研究主要集中在如何提高其生 物防效方面，如通過加強幾丁質酶、葡聚糖酶基因的表達、種間融合等手段。木黴菌PDA培 養菌落初為棉絮狀或緻密叢束狀，顏色為白色至灰白色，無固定形狀。當分生孢子成熟後， 菌落自中央到邊緣，漸漸變為不同程度的綠色，極少數為白色粉狀。分生孢子梗從菌絲的側 枝生出，直立分枝，小枝常對生，頂端不膨大，上生分生孢子團。分生孢子球形，淺色或無色。 大部分木黴對營養的需求並不嚴格，它們可在各種碳源和氮源下生長，同時可轉化和降解 一些有害或持久有害的環境汙染物；可直接利用各種單糖、單糖的衍生物、有機酸類；有顯 著的降解各種多糖(纖維素、半纖維素)和相關的多聚糖(幾丁質)；還可轉化和降解一些 農藥，如馬拉硫磷、茅草枯、五氯硝基苯等。木黴可利用複雜和簡單的氮，水解酪蛋白氨基 酸混合液、天門冬氨酸、丙氨酸、穀氨酸均能很好利用，在高氮條件下有利於木黴產生一些 酶，如纖維素酶、乳糖酶等。木黴是需氧菌，適合的氧壓有利於菌絲的生長和孢子產生；最佳 PH為4. 0-6. 5 ；生長溫度因種而不同，大多數在25°C左右生長十分迅速，並自我調節環境的 PH值，使環境適應其生長條件。
木黴菌的拮抗作用範圍具有廣譜性，相關研究顯示，木黴菌至少對18個屬四種病 原真菌有拮抗作用。木黴菌能寄生的植物病原菌即拮抗對象包括絲核菌屬(Miizotonia)、 /Jn (Sclerotium) ,^M Μ. M M (Sclerotinia) > ix if M (Helminth osporium)、H 刀菌屬(Fusarium)、毛盤孢屬(Colletotrichum、輪枝孢屬(Verticillium)、黑星菌屬 (Venturia)、內座殼屬(Endothia)、腐黴屬(Pythium)、疫黴屬(Phytophthora)、間座殼屬 (Diaporthe)和黑星孢屬(Fusicladium)等等。
目前市場上的木黴製劑均是分生孢子製劑和菌絲型製劑，多是由固體發酵而來。 固態發酵不僅是目前真菌培養通過氣生菌絲獲得大量分生孢子的最好方法，而且其特有的 優勢已使其被廣泛應用和研究。另外，固體發酵產生的分生孢子比液體發酵產生的分生孢 子質量好，耐乾燥力強，存活時間長。而且在田間應用時，固態發酵產物可直接施用，無需制 成製劑，後處理簡單，成本低。但其生產和應用規模不大，究其原因，最關鍵的難題沒有解 決即產品的貨架期短。一般以分生孢子為有效成分的製劑，保證活菌含量的時間不會超過 3個月，後期所接製劑中的木黴存活量難以達到要求，其防效的穩定性沒有得到有效保證， 在植物病害防治中目前尚不能完全取代化學防治等其它治理措施。發明內容
為解決上述問題，本發明提供了以下技術方案。
本發明第一方面提供了一種用於防治植物病害的複合製劑，所述複合製劑包含芽 孢桿菌芽胞和木黴菌厚垣孢子。
在一個較佳的實施方案中，所述複合製劑是可溼性粉劑，所述複合製劑包含載體 和潤溼分散劑，所述載體選自白碳黑或硅藻土，所述潤溼分散劑選自烷基萘磺酸鹽。在一 個更佳的實施方案中，所述載體的含量為5-30% (W/W)，所述潤溼分散劑的含量為0. 5-5% (W/W)，以發酵液的重量為基準(以可溼性粉劑乾燥之前發酵液的重量為基準)。在另一個 較佳的實施方案中，所述複合製劑中所述芽孢桿菌芽胞的含量為IO8-IOltl個細胞/克(制 劑)，所述木黴菌厚垣孢子的含量為IO8-IO9個活孢子/克(製劑)。
本發明另一方面提供了 一種製備上述複合製劑的方法，該方法包括以下步驟
(1)提供含芽孢桿菌芽胞的發酵液以及含木黴菌厚垣孢子的發酵液；
(2)將含木黴菌厚垣孢子的發酵液勻漿，然後與含芽孢桿菌芽胞的發酵液混合，得 到所述複合製劑。
在一個較佳的實施方案中，所述步驟(1)中的含木黴菌厚垣孢子的發酵液用以下 方法獲得
在發酵培養基中，溫度25 33°C、種子接種量5 10%、種子濃度IO5-IO6個/ mL、通氣比1 2至2 1，罐壓0.03-0. 05MPa下，發酵84-96小時，獲得含木黴菌厚垣 孢子的發酵液，其中所述發酵培養基的組成是麩皮0.4-0.6%，(NH4)2SO4 0. 1-0.3%, KH2PO4O. 1-0. 2%, CaCO3 0. 1-0. 2%,葡萄糖 1-3%，0. 2-0. 5% 的大豆油，ρΗ5· 5-6. 0。
在另一較佳的實施方案中，所述複合製劑是可溼性粉劑，它是通過對步驟(2)所 得的複合製劑進一步乾燥製得的，且在所述步驟O)中還包括混合入載體和潤溼分散劑的 步驟，所述載體選自白碳黑粉或硅藻土，所述潤溼分散劑選自烷基萘磺酸鹽。在更佳的實施 方案中，所述載體的含量為5-30% (W/W)，所述潤溼分散劑的含量為0. 5-5% (W/W)，以發酵 液的重量為基準。
本發明另一方面涉及本發明上述複合製劑在防治植物病害中的應用。在較佳的實 施方案中，所述植物病害選自西瓜枯萎病和蔓枯病。
本發明的複合製劑可用於防治多種植物土傳病害，同時，該菌劑能夠促進植物生 長，提高肥料利用率，誘導植物產生抗逆境和抗病害的能力。通過該發明生產出的厚垣孢子 製劑比用傳統方法生產的分生孢子製劑具有更強的生活力和抗逆能力，作用功能更多，更 適合於生產應用。
具體實施方式
本發明第一方面提供了一種用於防治植物病害的複合製劑，所述複合製劑包含芽 孢桿菌芽胞和木黴菌厚垣孢子。所述芽孢桿菌宜為枯草芽孢桿菌。
在一個優選的實施方案中，所述複合製劑中所述芽孢桿菌芽胞的含量為IO8-IOki 個細胞/克製劑，所述木黴菌厚垣孢子的含量為IO8-IOki個活孢子/克製劑。
本發明的複合製劑可以採用本領域技術人員熟知的各類農藥劑型，其包括但不局 限於粉齊 、可溼性粉齊 、乳油、顆粒齊 、膠懸齊 、水溶齊 、氣霧劑、片齊 、煙齊 、燻蒸齊 、油霧 劑、緩釋劑、微膠囊劑、懸浮乳劑、固體乳油、微乳劑和可流動粉劑等，其中優選可溼性粉劑、 微膠囊製劑、懸浮乳劑、固體乳油、微乳劑和可流動粉劑。由於可溼性粉劑和微膠囊劑使用方便安全、持續性強，有利於生物農藥的長效作用，且使用的助劑無害，不含有有機溶劑，對 環境友好，所以是最為優選的。
在本發明的複合製劑(如可溼性粉劑)中，還可包含其它載體和助劑等。在一個優 選的實施方案中，本發明的複合製劑是可溼性粉劑，該可溼性粉劑包含載體和潤溼分散劑。 惰性的載體常用於加工粉劑、可溼性粉劑、顆粒劑等固體劑型，其作用是稀釋有效成分便於 加工，改善理化性狀便於使用。作為製劑載體的惰性材料會在一定程度上影響製劑中孢子 的穩定性。製劑中孢子的存活表現為一定水平的新陳代謝。即使在特定貯存條件下代謝活 動非常微弱，但積累起來的代謝副產物會對孢子自身產生抑制作用。
在本發明中，優選的惰性載體是所述載體選自白碳黑粉或硅藻土。
潤溼分散劑能降低水的表面張力使有效成分很快被水潤溼的物質。加工可溼性粉 劑、懸浮劑、幹懸浮劑、水分散性粒劑等，兌水配成懸浮液噴灑用的劑型時添加潤溼劑，使不 溶於水的藥粒表面很快被潤溼而分散懸浮於水中。藥液噴灑到靶體表面上易於展布，擴大 覆蓋面積。常用的潤溼劑有皂角、茶枯、木質素磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽、拉開粉、多種非離子 型表面活性劑等。在本發明中，優選的潤溼分散劑為烷基萘磺酸鹽。
所述載體和潤溼分散劑的含量很容易由本領域技術人員根據有限實驗來確定。 在一個較佳的實施方案中，所述載體的含量為5-30% (W/W)，所述潤溼分散劑的含量為 0. 5-5% (W/W)，以發酵液的重量為基準。
另外，本發明的複合製劑內還可添加其它具有活性組分，這可由本領域技術人員 根據具體目的通過常規試驗來進行選擇和確定。
製備方法
技術領域：
本發明另一方面提供了 一種製備本發明複合製劑的方法，該方法包括以下步驟
(1)提供含芽孢桿菌芽胞的發酵液以及含木黴菌厚垣孢子的發酵液；
(2)將含木黴菌厚垣孢子的發酵液勻漿，然後與含芽孢桿菌芽胞的發酵液混合，得 到所述複合製劑。
含芽孢桿菌芽胞的發酵液以及含木黴菌厚垣孢子的發酵液的用量(或其混合比 例)可由本領域技術人員根據具體情況通過常規試驗來確定，通常較佳的是希望複合製劑 中所述芽孢桿菌芽胞的含量為IO8-IOltl個細胞/克，所述木黴菌厚垣孢子的含量為IO8-IOki 個活孢子/克。在所述步驟( 中，所述勻漿步驟的目的是使菌絲體充分破碎，具體可採用 本領域技術人員熟知的各種機械破碎方法。
在一個優選的實施方案中，所述複合製劑是可溼性粉劑。為了便於長期貯存，可將 發酵液與載體、潤溼分散劑或其它助劑按照一定的比例混合後得到液固混合物，然後採用 諸如壓力式噴霧、離心式噴霧等方式進行乾燥，從而製得所述可溼性粉劑。因此，在該實施 方案中，還包括在所述混合液中混合入載體和潤溼分散劑的步驟。所述載體和潤溼分散劑 的添加次序沒有特別的限制，它們之一或兩者可以先部分或全部加入含芽孢桿菌芽胞的發 酵液後再與含木黴菌厚垣孢子的發酵液勻漿後的勻漿液混合得到混合液，也可以先部分或 全部加入與含木黴菌厚垣孢子的發酵液勻漿後的勻漿液後再與含芽孢桿菌芽胞的發酵液 混合得到混合液，或者可以在將含木黴菌厚垣孢子的發酵液勻漿後的勻漿液與含芽孢桿菌 芽胞的發酵液混合之後再加入部分或全部載體和/或潤溼分散劑。在一個優選的實施方案 中，所述載體宜選自白碳黑粉或硅藻土，所述潤溼分散劑宜選自烷基萘磺酸鹽。在更優選的實施方案中，所述載體的添加量，以發酵液總重量(即步驟O)的發酵液混合物的重量) 計，5-30% (優選10-20%)的載體以及0.5-5% (優選)的潤溼分散劑。
如何提高已有製劑中的孢子的耐受能力也是解決現有技術中存在的問題的重要 方面。木黴的厚垣孢子是木黴抵抗不良環境而休眠的生存結構。厚垣孢子，一般是在不良 條件下，菌絲細胞內的原生質收縮，細胞壁加厚而形成。在無隔菌絲中，菌絲的一部分集中 儲存養料，同時產生厚壁，兩端形成封閉的隔膜而與菌絲其它細胞切斷，形成厚垣孢子；在 有隔菌絲的較老菌絲部位往往可形成厚垣孢子。厚垣孢子一旦遇到適宜的環境條件便萌發 產生菌絲。所以，利用厚垣孢子為主體的生防製劑就可能具有耐貯藏和貨架壽命長長等優 點，能滿足作為生物農藥的要求。然而，由於厚垣孢子對人工發酵培養要求條件比較苛刻， 所以尋找適宜的發酵培養條件以求得到高生物量的厚垣孢子成為亟待解決的問題。
在本發明中，還提供了一種獲得木黴菌厚垣孢子或含木黴菌厚垣孢子發酵液的方 法，該方法包括在發酵培養基中，溫度25 33°C、種子接種量5 10%、種子濃度IO5-IO6 個/mL、通氣比1 2至2 1，罐壓0.03-0. 05MPa下，對木黴菌進行液體發酵84-96小時， 從而獲得富含木黴菌厚垣孢子的發酵液。所用的發酵培養基的組成是麩皮0.4-0.6%， (NH4)2SO4 0. 1-0. 3%, KH2PO4 0. 1-0. 2%, CaCO3 0. 1-0. 2%，葡萄糖 1-3%，0· 2-0. 5%的大 豆油，pH5. 5-6. O0
在更優選的實施方案中，該方法包括在發酵培養基中，溫度^-30°C、種子接種量 6-9%、種子濃度IO5-IO6個/mL、通氣比1 2至2 1，罐壓0. 03-0. 05MPa下，對木黴菌 進行液體發酵96小時，從而獲得富含木黴菌厚垣孢子的發酵液。所用的發酵培養基的組成 是麩皮0. 5%，(NH4)2SO4 0. 2%,KH2PO4 0.1%,CaCO3 0. 1 %，葡萄糖 2%，0. 2-0. 3%的大豆 油，pH5. 5-6. O0
防治植物病害的應用
本發明提供的複合製劑可以用於有效地防治各種植物病害。在一個較佳的實 施方案中，本發明的複合製劑可以用於有效地防治包括絲核菌屬(Miizocionia)、殼球孢 屬(Macrophomina)、鍵刀菌屬(Fusarium)、核盤菌屬(sclerotium)、腐黴屬(Phythium)、 ^βΜ (Phytophthora)、/]、胃(Sclerotium)、 3 M (Helminth osporium)、^ i 孢屬(Colletotrichum、輪枝孢屬(Verticillium)、黑星菌屬(Venturia)、內座殼屬 (Endothia)、間座殼屬(Diaporthe)和黑星孢屬(Fusicladium)等引起的植物病害或土傳 植物病害。另外，本發明的複合製劑還可以防治草莓等植物的白粉病和灰黴病等，還可以控 制瓜、果的採後各種腐爛病。
更具體地說，本發明的複合製劑可以用於防治以下植物病害水稻紋枯病、稻曲 病；三七，菸草，花卉，小麥，白菜等的土傳病害；白粉病，灰斑病，炭疽病等疫病；小麥紋枯 病；稻瘟病，甘藍黑斑病；黃瓜白粉病，草莓白粉病和灰黴病；猝倒病(如番茄，黃瓜，茄子， 青椒，西瓜，香瓜，甜瓜)，根腐病，立枯病，枯萎病等病害。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。本發明的所有技術方案(包括較佳的、更較的或最佳的技術 方案)均可任意組合而形成新的技術方案。所有這些技術方案均視為在本申請的文字記載 範圍內。除非另有描述，本發明的實施將採用本領域技術人員所知道的常規技術。或者，可 按照試劑生產商所提供的說明書進行。
實施例1 木黴T4的500L罐液體發酵產厚垣孢子的研究
本實施例對木黴T4在500L發酵罐中的厚垣孢子產生進行了研究。所用菌株為綠 色木黴(T. viride) T4，從植物根際土壤中分離獲得，並可從華東理工大學生物反應器工程 國家重點實驗室購買，另可參見文獻(夏斯琴，王偉，化學與生物工程，「綠色木黴T4的固體 發酵工藝及其製劑穩定性的研究」，2008年，Vol. 25，No. 12，52-56頁)。
在發酵培養基中，溫度觀_301、種子接種量6-9%、種子濃度IO5-IO6個/mL、通氣 比1 2至2 1，罐壓0.03-0. 05MPa下，對木黴菌進行液體發酵96小時，從而獲得富含木 黴菌厚垣孢子的發酵液。所用的發酵培養基的組成是麩皮0.5%,(NH4)2SO4 0.2%,KH2PO4 0. 1 %, CaCO3 0. 1%，葡萄糖 2%，0. 2%的大豆油，pH5. 5-6. 0。
結果發現，木黴T4在500L發酵罐中進行液體發酵有較好的厚垣孢子形成能力。在 500L發酵罐中，前24h大量形成菌絲，無厚垣孢子形成，到3 厚垣孢子已經開始形成，但 是數量很少，這時木黴的菌絲形成豐富，較稠密；隨著發酵時間延長，厚垣孢子逐漸形成，到 72h厚垣孢子量達到1. 5 X IO7個/mL，72h 84h厚垣孢子增長較快，到84h厚垣孢子已有 3. 16X IO7個/mL，到96h厚垣孢子量略有上升，3. 24X 107個/mL，肉眼明顯可見發酵液中菌 絲物質變細，發酵液變稀，終止發酵。從種子液到發酵終止結束需要6d時間，與國內外研究 相比所需時間相對較少，厚垣孢子產量也達到較高水平。
實施例2 植物油對木黴T4菌厚垣孢子的影響
重複實施例1的發酵工藝，只是在培養基中添加四種濃度的大豆油，然後測定木 黴T4的厚垣孢子產量。
結果發現，與不加入大豆油相比，加入大豆油可明顯促進木黴T4厚垣孢子的產 生，隨著大豆油濃度的增大，產生的厚垣孢子逐漸增多，在5g/L的濃度下厚垣孢子數最多， 達3. 3 X IO7個/mL，2g/L的濃度下產生的厚垣孢子量也達到了 3. 28 X IO7個/mL，幾乎接近 5g/L的產量。同時在5g/L的濃度下發現，鏡檢計數時發現發酵液中仍有大的油滴存在，說 明5g/L的濃度過量，不能被木黴全部吸收，因此，2-3g/L(即0. 2% -0. 3% )的大豆油的添 加最利於木黴T4厚垣孢子的產生。
實施例3 木黴可溼性粉劑的製備
按照實施例1所述，利用500L發酵罐進行培養獲取厚垣孢子發酵液，條件30°C， 180r/min,2. lL/min，接種量為6%，96小時厚垣孢子大量形成後，發酵結束。將發酵液高速 勻漿(5000r/min勻漿3分鐘)後，加入10% (W/W)的載體和1% (ff/ff)(以發酵液總重量 計)潤溼分散劑，用噴霧乾燥(條件進口溫度155°C、出口溫度105-110°C、進料速度4. 5L/ h)乾燥後製成可溼性粉劑。對其按可溼性粉劑標準進行檢測。表1中列出了不同載體(輕 質碳酸鈣(1250目)、高嶺土(1250目)、白炭黑(500目)、滑石粉(800目)、硅藻土(500 目)、膨潤土(325目))對木黴活力的影響。
表 權利要求
1.一種用於防治植物病害的複合製劑，其特徵在於，所述複合製劑包含芽孢桿菌芽胞 和木黴菌厚垣孢子。
2.如權利要求1所述的複合製劑，其特徵在於，所述複合製劑是可溼性粉劑，所述複合 製劑包含載體和潤溼分散劑，所述載體選自白碳黑或硅藻土，所述潤溼分散劑選自烷基萘磺酸鹽。
3.如權利要求2所述的複合製劑，其特徵在於，所述載體的含量為5-30%(W/W)，所述 潤溼分散劑的含量為0. 5-5% (W/W)，以發酵液的重量為基準。
4.如權利要求1所述的複合製劑，其特徵在於，所述複合製劑中所述芽孢桿菌芽胞的 含量為IO8-IOki個細胞/克，所述木黴菌厚垣孢子的含量為IO8-IO9個活孢子/克。
5.一種製備權利要求1所述複合製劑的方法，該方法包括以下步驟(1)提供含芽孢桿菌芽胞的發酵液以及含木黴菌厚垣孢子的發酵液；(2)將含木黴菌厚垣孢子的發酵液勻漿，然後與含芽孢桿菌芽胞的發酵液混合，得到所 述複合製劑。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述步驟(1)中的含木黴菌厚垣孢子的發酵 液用以下方法獲得在發酵培養基中，溫度25 33°C、種子接種量5 10%、種子濃度IO5-IO6個/mL、 通氣比1 2至2 1，罐壓0.03-0. 05MPa下，發酵84-96小時，獲得含木黴菌厚垣孢子 的發酵液，其中所述發酵培養基的組成是麩皮0.4-0.6%，(NH4)2SO4 0. 1-0.3%, KH2PO4 0.1-0.2%，CaCO3 0.1-0.2%，葡萄糖 1-3 %，0. 2-0. 5 % 的大豆油，pH5. 5-6. 0。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特徵在於，所述複合製劑是可溼性粉劑，它是通過 對步驟( 所得的複合製劑進一步乾燥製得的，且在所述步驟O)中還包括混合入載體和 潤溼分散劑的步驟，所述載體選自白碳黑粉或硅藻土，所述潤溼分散劑選自烷基萘磺酸鹽。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述載體的含量為5-30%(W/W)，所述潤溼 分散劑的含量為0. 5-5% (W/W)，以發酵液的重量為基準。
9.權利要求1所述的複合製劑在防治植物病害中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特徵在於，所述植物病害選自西瓜枯萎病和蔓枯病。
全文摘要
本發明提供了一種用於防治植物病害的複合製劑，所述複合製劑包含芽孢桿菌芽胞和木黴菌厚垣孢子。本發明還提供了製備該複合製劑的方法及其應用。
文檔編號A01P21/00GK102027998SQ20091019628
公開日2011年4月27日 申請日期2009年9月24日 優先權日2009年9月24日
發明者夏斯琴, 李小禮, 王偉, 王劍 申請人:華東理工大學